Overview
资料来源： 实验室的博士保罗 · 鲍尔-普渡大学
标准加入法是感兴趣的样品已导致基体效应，在附加组件可能减少或增强分析物吸收信号的多个组件时常用的定量分析方法。这导致重大错误的分析结果。
标准附加常用来消除基体效应的测量，因为它假设矩阵同样影响的所有解决方案。此外，它用来纠正这种化学物质的相分离的萃取过程中执行。
通过阅读实验 （在这种情况下荧光） 强度的未知溶液，然后通过测量未知的强度与不同数量的已知标准添加执行该方法。数据绘制为荧光强度 vs.的标准添加量 （未知本身，没有标准补充道，在 y 轴上绘制）。最小二乘行在未知浓度的负 x 轴相交，如图 1所示。
图 1.的标准加入法的图形表示。
Principles
在这个实验中，标准附加方法作为分析工具。该方法是进行定量分析的一种不典型的校准曲线的生成过程。标准加入分析被通过测量光谱强度的精确整除数的分析物的已知标准溶液加入前后。
本实验研究非荧光物种的反应他们在一种形成一个复杂的荧光。这种方法常用的金属离子的研究。铝离子 （Al3 +） 将以形成一个复杂的 8-羟基喹啉 (8HQ) 决定。Al3 +诱发 8HQ 从水溶液，然后提取到三氯甲烷;氯仿溶液的荧光是测量和原始的 Al3 +溶液的浓度有关。灵敏度在部分每百万 (ppm或μ g/mL) 范围内预计这项实验。
反应是
在这个实验中每个样品中铝的量的计算方法如下：
| 空白 | 0 | ||
| 未知 + 0 毫升标准 | V未知（C未知） = 25 毫升 （C未知） | ||
| 未知 + 1 毫升标准 | V未知（C未知） + V标准（C标准） = 25 毫升 （C未知） + 1 毫升 (1 μ g/m l) | ||
| 未知 + 2 毫升标准 | V未知(C未知) + V标准(C标准) = 25 毫升 (C未知) + 2 毫升 (1 μ g/m l) | ||
| 未知 + 3 毫升标准 | V未知(C未知) + V标准(C标准) = 25 毫升 (C未知) + 3 毫升 (1 μ g/m l) | ||
| 未知 + 4 毫升标准 | V未知(C未知) + V标准(C标准) = 25 毫升 (C未知) + 4 毫升 (1 μ g/m l) | ||
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Procedure
1.制备试剂
- 100 ppm 标准 Al3 +溶液： 溶解 0.9151 g 硝酸铝 (Al (没有3)3•9H2O) 用去离子水 1 L 容量瓶。
- 1 M 醋酸 （2 %wt / 卷） 的 8HQ 解决方案： 将 2.0 g 8-羟基喹啉添加到 100 毫升的容量瓶。
- 小心地 5.74 毫升冰醋酸加入 100 毫升烧瓶中，然后稀释至马克用去离子水。这允许 8-羟基喹啉，溶解在水相中。
- 1 M NH4+/NH3缓冲区 (pH ~ 8): 将 20 g 的醋酸铵 (NH4OAc) 添加到一瓶 100 毫升。
- 到这瓶 100 毫升，添加 7 毫升 30%氢氧化铵和稀释至马克用去离子水。这有助于中和酸的 8HQ 解决方案结合时中。
- 其他试剂包括无水硫酸钠 (Na2等4) 和氯仿 （规格等级）。
2.样品的制备
- 溶液 1.00 ppm 标准 Al3 + 1.0 毫升的 100 ppm 股票 Al3 +解决方案与吸管加入 100 毫升的容量瓶。
- 地点位于发动机罩的大环站在环上的六 125 毫升分液漏斗。他们应该被标记的含义如下： BL，0，1，2，3，4.确保所有玻璃器皿的认真清理，很难获得定量的结果，如果小珠子的氯仿贴到墙上的玻璃器皿。
- 将 25.00 毫升的未知 Al3 +解决方案添加到标记为 0，1，2，3，5 分液漏斗 & 4。在此示例中，未知的浓度是 0.110 ppm。
- 添加 0、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00 mL 1.00 ppm 标准 Al3 +溶液，分别与 1 毫升吸管 5 漏斗。
- 准备一张空白标记 BL.分液漏斗中加入 25.00 mL 的蒸馏水
- 将 1.0 毫升的移液管 8-羟基喹啉溶液添加到每个六的解决方案。
- 添加到每个六解决方案 3.0 mL 的缓冲溶液，用移液管。
- 提取两次用氯仿，大力震动 1 分钟每次 10 毫升每个解决方案。记得偶尔发泄分液漏斗，以释放压力。(注： 良好的萃取只发生时大量的液-液接触阶段之间)。
- 收集在干净、 干燥的 100 mL 标记烧杯中氯仿。氯仿有密度接近 1.5 g/c m3，所以它是更低的层。完整的萃取后的水相应该没有一丝的黄色左。
- 他们各自的 25 毫升容量瓶转移合并的氯仿提取物每个烧杯和稀释至标记用氯仿。请确保将瓶塞放置在每个容量瓶，以防止任何氯仿蒸发。
- 添加 ~ 1 g 的无水硫酸钠 (Na2等4) 到每个六个 100 毫升烧杯从步 2.9。硫酸钠帮助去除水中氯仿提取物可能存在的任何踪迹。
- 将解决方案传送回他们受人尊敬的烧杯。旋流仔细便于脱水的任何样品中的水。
- 醒酒氯仿提取进去的石英荧光计单元格 (注： 氯仿会溶解塑料聚苯乙烯单元格)。
3.选择激发波长
通过运行扫描，确定激发和发射波长然后只是读取和记录这些值的所有样品的荧光强度。激发和发射性能带宽预设在 5 毫微米。复合体吸收在近紫外，所以激发波长应该约 385 nm。最初，监视荧光在 500 毫微米发射分支中的。
- 在荧光计，验证两个内部和外部冷却风扇在荧光计前通电氙弧灯开启。氙弧灯变得非常热，并且需要连续冷却。
- 在高电压 (HV) 转至 400 V 的光电倍增管探测器。
- 打开两个百叶窗。
- 打开计算机上的数据采集程序，在这里它是"100nmFluorScan"。
- 地方"样品 + 2 毫升补充说:"到要用来确定最佳的激发和发射波长的石英单元格 (2) 解决方案。
- 与发射波长最初设在 500 毫微米，从 335 435 毫微米 2 nm/s 的扫描速度与运行励磁扫描。
- 从产生的荧光情节，确定最大荧光激发波长(EXλmax)，并将仪器设置为该值。
4.选择发射波长
- 设置荧光计发射波长为 450 毫微米。
- 设置发射波长范围从 450-550 nm 运行 100 nm 扫描。
- 要开始扫描，请单击按荧光计的前面板上的"开始"按钮的同时在程序上的"开始审判"按钮。
- 从产生的荧光情节，确定最大荧光发射波长 (EMλmax)，并将仪器设置为该值 (图 2)。
图 2。确定最佳 EXλ 的最大和 EMλmax 波长。
5.测量样品的荧光
- 所有的样品都是在 EMλ最大和 EXλ最大运行的。扫描不需要为每个样品，但只是在这些条件下的荧光值。开始与最稀的样本 （空白），地方在石英的单元格，然后在文书中。在实验室的笔记本上记录的荧光强度。
- 对于所有其他样本重复。
- 请记住，必须从每个解决方案之前创建校准图表相对强度减去空白的相对强度。
6.创建标准加入情节
- 情节的荧光强度与 Al3 +添加微克。
- 确定生成的情节，最小二乘值并记录斜率和截距。
- 确定的 Al3 +中方程 µ g 的 Al3 + ，未知样本 µ g =-b/m
- 了解未知的铝有 25.0 mL 添加到每个样本的容量，确定未知中铝的浓度。
标准加入法是一种用于尽量减少干扰分析物测量信号的基质效应的定量分析技术。
通过一系列的分析技术，如光光谱、 质谱法和电化学经常阐述了未知的组分浓度。然而，测量可以受其他组件在示例中，称为矩阵，并且导致无意中减少或增强信号，称为基质效应。这些影响可以倾斜的结果，并导致重大错误的分析。
标准加入法可用于最小化矩阵对测量信号的影响。这是通过将已知的分析物解的精确卷添加到样品完成。
这个视频将介绍基本的标准加入法，并演示如何在实验室用荧光测量执行的技术。
基体效应可以产生复杂样品中其他的分子数目在哪里与被测物进行交互。例如，这可以发生时分子绑定或凝聚与被测物，从而改变其发出荧光的能力。或矩阵可能改变整体解决方案时，更改特定属性分析物的离子强度。
为减轻这些影响，采用标准加入法，范围内的卷物标准溶液加入相同体积的样品。解卷然后由平等使用溶剂。
然后，信号被测量的样品与标准加入无。数据绘制强度随所用的标准添加到样品，而不是经典的校准曲线。在任何给定的烧瓶中分析物的实际浓度是由下面的公式定义的。仪器响应将等于常数乘以分析物的浓度。最后得到的方程需要线性形式 y = mx + b。因此，当故事情节推断，零吸光度，截距等于未知浓度的样品。
关注的浓度范围内，信号情节必须是线性的。此外，干扰不应作为样本矩阵变化分析物的比率而异。最后，矩阵本身不应生成任何测量信号在其自身上。
以下的实验研究铝、 非荧光物种，与 8-羟基喹啉或 8HQ，反应，形成荧光 ALQ3复杂。
铝复杂在有机溶剂中的荧光是测量，然后有关原铝溶液的浓度。这种方法是在金属离子分析中常见的。
现在，概述了标准加入法的基本知识，并实验的基本解释，让我们在实验室中执行的技术。
首先，准备在水中，100 ppm 铝股票解决方案，然后使用它准备 1 ppm 标准溶液。
接下来，添加 2 g 8-羟基喹啉或 8HQ，100 毫升的容量瓶。
小心地添加 5.74 mL 冰乙酸，然后稀释至 100 毫升马克用去离子水。这一步使 8HQ 溶解在水相中。
接下来，添加到标记瓶 100 毫升 20 g 醋酸铵和 7 毫升 30%氢氧化铵法制备缓冲区和稀释。验证用 ph 值指标棍子的 ph 值。此缓冲区可以帮助消除中 8HQ 解决方案组合时的酸。
其他试剂需要包括无水硫酸钠和分光光度法级氯仿。
现在准备样品，在这种情况下通过提取样品溶液中的成用液-液萃取有机相。放置六 125 毫升分液漏斗罩内环站环上。确保所有的玻璃器皿的认真清理，脏的玻璃器皿将倾斜的结果。按顺序标签漏斗"空白"，"0"，"1"、"2"、"3"和"4"。
用移液管，将 25 毫升的未知的铝溶液添加到每个标记为"0"至"4"的五个分液漏斗。通过将 25 毫升的去离子水添加到标记为"空白"漏斗准备空白。
接下来，将 1、 2、 3 和 4 毫升 1 ppm 标准溶液添加到相应的编号漏斗。添加空白或 0 漏斗没有标准的解决方案。
每个 6 漏斗添加 1 毫升的 8HQ 解决方案和 3 毫升的缓冲溶液。
可以通过添加到每瓶 10 毫升的氯仿执行液-液萃取。摇漏斗大力，和偶尔发泄漏斗来释放压力。将漏斗放回戒指，并允许液体层分离。
接下来，收集氯仿相，清洁，干燥，并标记的 100 毫升烧杯中。氯仿以来比水的密度更高，它是较低层的漏斗。
转入 25 毫升的容量瓶，氯仿提取物和限制每个瓶子以防止蒸发。
通过向每个漏斗添加 10 毫升的氯仿对剩余的水溶液，执行第二液-液萃取。摇漏斗，作为之前，转让任何剩余物对氯仿相。应该留在顶级的水相没有黄颜色。
对于每个漏斗，重复二次提取，然后收集中相应的标记烧杯的氯仿相。他们各自的容量瓶，倒入收集的氯仿和稀释至标记用新鲜的氯仿。
若要删除微量水，向每个六个 100 毫升烧杯添加约 1 g 的无水硫酸钠。回到他们各自的烧杯，传输解决方案和旋流便于脱水的样品。
醒酒氯仿提取物吸入石英荧光计单元格。
根据制造商的说明荧光计设置和设置为 400 V 的电压。接下来，打开计算机上的数据采集程序。
使用示例 2 来确定最佳的激发和发射波长。设置发射波长为 500 nm 和运行励磁扫描从 335-435 毫微米，与 2 nm/s 的扫描速度。
从荧光的情节，确定最大波长为激励。将工具设置为那激发波长值，在此案件 399 毫微米。
下一步，确定发射波长进行扫描从 450-550 毫微米。从由此产生的荧光情节，确定最大波长和发射波长，载此案件 520 nm。
衡量每个样本，包括在所选的激发和发射波长的空白。记录每一个荧光强度读数。
减去空白试样从每个其他 5 个样品的测量的荧光。
绘制每五个样品数量的铝添加到样品的荧光强度。确定生成的情节，最小二乘值并记录斜率和截距。
情节的荧光强度与铝添加量产生了最小二乘线，如图所示。然后可以使用下面这行计算样品中铝的量。由于添加的未知量 25 毫升，确定的值，2.916 μ g 除以 25 毫升。这样的最终结果为 0.117 μ g/m l 或 0.117 ppm。这是相当接近 0.110 ppm 的已知值。
现在，让我们看看其他一些可能有偏差结果矩阵效应的分析技术。
原子吸收光谱法是光的以气态措施吸收的目标分析物的分析方法。对于大多数的样本，有关吸收到样品浓度，简单的校准曲线可以作为可靠的方法来量化未知的浓度。
然而，这种技术可以失去准确性，如果混合其他组件交互目标分析物和抑制或增强吸收。标准加入法在这种情况下可以用于考虑影响的这些交互作用，特别是在样本矩阵不能移除之前分析的位置。
仪器校准测量精度的关键作用。标准加入法经常用于援助在校准仪器，如 icp 备女士电感耦合等离子体质谱是比较的方法，这意味着未知样品的测量基于测量的一种化学物质标准。
因此，未知的测量不确定度不能比的校准不确定度。标准加入法因此可以用于创建校准曲线，比标准的方法，更准确，占样本中的矩阵互动。
许多生物分子分析了使用高性能液相色谱法或高效液相色谱法。高效液相色谱法是一种技术，分离和分析复杂的混合物，基于分子极性、 电荷和大小等属性。时间的分析物叶列使用户能够确定混合物中的每个组件。
生物分子可以经常进行交互的一种混合物，并受他们悬浮在矩阵的影响很大。通常情况下，标准加入法用于校准曲线，为创建帐户的这些影响。
你刚看了朱庇特的概论标准加入法。你现在应该明白如何执行技术占样品分析基体效应。
谢谢观赏 ！
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Results
从 335-435 激发波长扫描显示最高吸收在 399 nm，所以励磁单色器被设置为该值。然后从 450-550 nm 进行发射扫描和最强的信号被发现在 520 nm。这些都是用于所有的样品的波长。
| 示例 | 荧光强度 | 更正后的荧光强度 |
| 空白 | 0.008 | 0.000 |
| 示例 | 0.128 | 0.120 |
| 示例 + 1 毫升 | 0.167 | 0.159 英寸 |
| 示例 + 2 毫升 | 0.220 | 0.212 |
| 示例 + 3 毫升 | 0.260 | 0.252 |
| 示例 + 4 毫升 | 0.290 | 0.282 |
情节与微克的 Al3 +添加 (图 4) (图 3) 荧光产生最小二乘的行：
荧光强度 = 0.0417 x （Al3 +添加微克） + 0.1216
金额的 Al3 + =-(Y-Int)/坡 =-0.1216/0.0417 =-2.916 微克/毫升
由于添加的未知量 25 毫升，然后需要除以 25 2.916 微克/毫升值。
未知的铝浓度 = 2.916 微克/毫升 / 25.0 mL = 0.117 微克/毫升 = 0.117 ppm
这是相当接近 0.110 ppm （6.4%错误） 的实际值。
图 3。样品的荧光。
图 4。标准加入校正标度图。
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Applications and Summary
标准加入法通常是利用时需要准确的定量结果，如原子吸收光谱、 荧光光谱法、 电感耦合等离子体发射光谱和气相色谱分析中使用的技术。这常用时兴趣导致减少或增强液的吸光度为定量结果所需的样品中有其他组件。这种情况下，一个不能简单地比较标准，使用传统的标定曲线方法分析物信号。事实上，矩阵效果评价应该是强制性的验证过程的一部分。
在哪里可以用标准附加的另一个例子是从老摄影废提取银时。废物含有卤化银，和因此可以回收银可以提取。通过扣已知量的银未知的"废物"，这种方法可以预测得到从摄影胶片的银量。
经常测试暴露苯制造工厂的工人，以验证它们安全苯的接受水平以下。他们的尿液测试的化学物质，而这是生物基质。此外，分析物抑制数目为不同的人，所以单个校准工具包将不工作。用标准加入法，每一位员工可以测试并准确评估。
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