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표준 추가 방법

Overview

출처: 폴 바우어 박사연구소 - 퍼듀 대학교

표준 첨가 방법은 양적 분석 방법이며, 관심 샘플에 매트릭스 효과를 초래하는 여러 구성 요소가 있을 때 자주 사용되며, 여기서 추가 구성 요소는 분석 흡수성 신호를 줄이거나 향상시킬 수 있습니다. 이로 인해 분석 결과에 심각한 오류가 발생합니다.

표준 추가는 일반적으로 매트릭스가 모든 솔루션에 동등하게 영향을 미친다고 가정하기 때문에 측정에서 매트릭스 효과를 제거하는 데 사용됩니다. 또한 추출 공정에서 수행되는 화학상 분리를 보정하는 데 사용됩니다.

이 방법은 알 수 없는 용액의 실험(이 경우 형광) 강도를 판독한 다음, 공지된 표준의 다양한 양으로 미지의 강도를 측정함으로써 수행된다. 데이터는 형광 강도 추가된 표준의 양으로 플로팅됩니다(표준이 추가되지 않은 알 수 없음 자체는 y축에 플롯됩니다). 최소 사각형 선은 도 1에도시된 바와 같이 알 수 없는 농도의 음수로 x축을 교차합니다.

Figure 1
그림 1. 표준 추가 방법의 그래픽 표현.

Principles

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이 실험에서 표준 추가 방법은 분석 도구로 입증된다. 이 방법은 일반적인 교정 곡선의 생성없이 종의 정량적 분석을위한 절차이다. 표준 추가 분석은 분석물의 알려진 표준 용액의 정확한 알리쿼트 첨가 전후분광 강도를 측정하여 수행됩니다.

이 실험은 형광 복합체를 형성하는 것과 같은 방법으로 반응하여 비 형광 종을 연구합니다. 이 방법은 일반적으로 금속 이온의 조사에 사용됩니다. 알루미늄 이온(Al3+)은8-하이드록시퀴놀린(8HQ)을 가진 복합체를 형성하여 결정된다. Al3+는 수성 용액에서 8HQ에 의해 침전된 다음 클로로폼으로 추출됩니다. 클로로폼 용액의 형광은 원래 Al3+ 용액의 농도와 측정되고 관련된다. 이 실험에서는 100만 개당(ppm 또는 μg/mL) 범위의 감도가 예상됩니다.

반응은

Reaction

이 실험 중 각 샘플의 알루미늄 양은 다음과 같이 계산됩니다.

0
알 수 없는 + 0 mL 표준 V알 수 없음(C 알 수없음)= 25 mL (C 알 수없음)
알 수 없는 + 1 mL 표준 V알 수 없음(C 알 수없음)+ V표준(C표준)= 25 mL (C알 수 없음)+ 1 mL (1 μg/ mL)
알 수 없는 + 2 mL 표준 V알 수 없음(C알 수 없음)+ V표준(C표준)= 25 mL (C알 수없음)+ 2 mL (1 μg/ mL)
알 수 없는 + 3 mL 표준 V알 수 없음(C알 수없음)+ V표준(C표준)= 25 mL (C알 수없음)+ 3 mL (1 μg/mL)
알 수 없는 + 4mL 표준 V알 수 없음(C알 수없음)+ V표준(C표준)= 25 mL (C알 수없음)+ 4 mL (1 μg/mL)

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Procedure

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1. 시약 준비

  1. 100 ppm 표준 Al3+ 용액: 알루미늄 질산염(Al(NO3)3• 9H2O)를DI 물로 1L 체피 플라스크에 용해하십시오.
  2. 8HQ 용액은 1M 아세트산(2% wt/vol): 100mL 체피 플라스크에 8-하이드록시퀴놀린 2.0 g를 추가합니다.
  3. 조심스럽게 100 mL 플라스크에 5.74 mL 빙하 아세트 산을 추가 한 다음 DI 물로 마크에 희석하십시오. 이를 통해 8-하이드록시퀴놀린이 수단계에서 용해될 수 있습니다.
  4. 1 M NH4+/ NH3 버퍼 (pH ~8): 100 mL 병에 암모늄 아세테이트 (NH4OAc)의 20 g를 추가합니다.
  5. 이 100mL 병에 수산화 암모늄 의 7mL을 추가하고 DI 물로 마크에 희석하십시오. 이렇게 하면 결합될 때 8HQ 용액에서 산을 중화시키는 데 도움이 됩니다.
  6. 다른 시약은 무수성 나트륨 황산나트륨(Na2SO4)및 클로로폼(사양 등급)을 포함한다.

2. 샘플 준비

  1. 100mL 볼륨 플라스크에 파이펫이 있는 100ppm 스톡 Al3+ 용액의 1.0mL를 추가하여 1.00 ppm 표준 Al3+ 솔루션을 준비합니다.
  2. 후드에 있는 대형 링 스탠드에 있는 링에 125mL 분리 깔때기 6개를 놓습니다. BL, 0, 1, 2, 3, 4. 모든 유리 제품이 유리 제품 벽에 붙어 있는 경우 정량적 결과를 얻기 어렵기 때문에 모든 유리 제품이 꼼꼼하게 깨끗한지 확인하십시오.
  3. 0, 1, 2, 3 및 4로 표시된 5개의 분리 유입경로에 알 수 없는 Al3+ 용액의 25.00mL를 추가합니다. 이 예에서 알 수 없는 농도는 0.110 ppm입니다.
  4. 1.00-ppm 표준 Al3+ 용액의 0, 1.00, 2.00, 3.00 및 4.00 mL을 각각 1mL 파이펫이 있는 5개의 깔때기에 추가합니다.
  5. BL이라고 표시된 세파라토리 깔때기에 증류수 25.00mL를 추가하여 공백을 준비합니다.
  6. 파이펫을 사용하여 8하이드록시퀴놀린 용액의 1.0mL를 6개의 솔루션에 추가합니다.
  7. 6개의 솔루션 각각에 파이펫을 사용하여 3.0mL의 버퍼 솔루션을 추가합니다.
  8. 각 용액을 10mL의 클로로폼으로 두 번 추출하여 매번 1분 동안 격렬하게 흔들어 보시기 를 합니다. 때때로 압력 축적을 방출하기 위해 분리 깔때기를 배출해야합니다. (참고 : 좋은 추출은 위상 사이에 액체 액체 접촉이 많은 경우에만 이루어집니다).
  9. 깨끗하고 건조한 100mL 라벨비커로 클로로폼을 수집합니다. 클로로폼은 밀도가 1.5g/cm3에가깝기 때문에 하층이다. 완전한 추출 후 수성 상에 노란색 의 흔적이 남아 있어야합니다.
  10. 각 비커에서 결합된 클로로폼 추출물을 각각 25mL 체피플라스크로 옮기고 클로로폼으로 마크에 희석한다. 모든 클로로폼이 증발하지 않도록 각 볼륨 플라스크에 스토퍼를 배치해야합니다.
  11. 단계 2.9에서 6 개의 100 mL 비커 각각에 무수성 나트륨 황산나트륨 (Na2SO4)를1 g로 추가하십시오. 황산나트륨은 클로로폼 추출물에 존재할 수 있는 물의 흔적을 제거하는 데 도움이 됩니다.
  12. 솔루션을 존경받는 비커로 다시 전송합니다. 시료의 물 탈수를 용이하게 하기 위해 조심스럽게 소용돌이치십시오.
  13. 클로로폼 추출물을 석영 불소세포로 분해합니다(참고: 클로로폼은 플라스틱 폴리스티렌 세포를 용해합니다).

3. 내분 파장 선택

스캔을 실행하여 흥분 및 방출 파장을 결정한 다음 해당 값에 있는 모든 샘플의 형광 강도를 읽고 기록하기만 하면 됩니다. 여기 및 방출 대역폭은 5nm에서 미리 설정됩니다. 이 단지는 가까운 UV에서 흡수되므로 흥분 파장이 약 385 nm여야 합니다. 처음에, 방출 지점에서 500 nm에서 형광을 모니터링합니다.

  1. 플루오리미터에서는 크세논 램프에 전원을 공급하기 전에 형광계의 내부 및 외부 냉각 팬이 모두 켜져 있는지 확인합니다. 크세논 램프는 매우 뜨거워지고 지속적인 냉각이 필요합니다.
  2. PMT 검출기로 고전압(HV)을 400 V로 켭니다.
  3. 셔터를 모두 엽니다.
  4. 컴퓨터에서 데이터 수집 프로그램을 엽니다.
  5. "샘플 + 2 mL 추가"(2) 용액을 석영 세포에 배치하여 최고의 여기 및 방출 파장을 결정하는 데 사용하십시오.
  6. 방출 파장이 처음 500nm로 설정되어 335-435 nm에서 2 nm/s의 스캔 속도로 내분 스캔을 실행합니다.
  7. 생성된 형광 플롯에서 최대 형광 흥분 파장(EXλ max)을결정하고 계측기를 해당 값으로 설정합니다.

4. 배출 파장 선택

  1. 불소 방출 파장을 450 nm로 설정합니다.
  2. 450-550 nm에서 100 nm 스캔을 실행하도록 방출 파장 범위를 설정합니다.
  3. 스캔을 시작하려면 불소계의 전면 패널의 "START" 버튼을 누르는 동시에 프로그램의 "평가판 시작" 버튼을 클릭합니다.
  4. 생성된 형광 플롯으로부터, 최대 형광 방출 파장(EMλmax)을결정하고 계측기를 해당 값(도2)으로설정한다.

Figure 2
그림 2. 최적의 EXλ최대 및 EMλ최대 파장을 결정합니다.

5. 샘플의 형광 측정

  1. 모든 샘플은 EMλ최대 및 EXλ최대에서실행됩니다. 검사는 각 샘플에 대해 필요하지 않지만 이러한 조건에서형광 값만 있으면 됩니다. 가장 희석 된 샘플 (빈)로 시작하여 석영 셀에 넣고 계측기에 놓습니다. 실험실 노트북에서 형광 강도를 기록합니다.
  2. 다른 모든 샘플에 대해 반복합니다.
  3. 교정 차트를 만들기 전에 빈 상대 강도는 각 솔루션의 상대적 강도에서 빼야 합니다.

6. 표준 추가 플롯 만들기

  1. 형광 강도 대 알3+의 μg를 추가플롯합니다.
  2. 결과 플롯의 최소 사각형 값을 결정하고 경사 및 가로채기를 모두 기록합니다.
  3. Al 3+ = -b/m의 방정식 μg에서 알3+의 μg를 알 수 없는 샘플에서 확인
  4. 알 수 없는 알루미늄의 부피가 각 샘플에 25.0mL를 첨가했다는 것을 알고, 미지의 알루미늄의 농도를 결정한다.

표준 첨가 방법은 분석물 측정 신호를 방해하는 매트릭스 효과를 최소화하는 데 사용되는 정량적 분석 기술입니다.

알 수 없는 성분 농도는 종종 빛 분광, 질량 분광법 및 전기 화학과 같은 다양한 분석 기술을 통해 해명됩니다. 그러나, 측정은 매트릭스라고 하는 샘플의 다른 구성 요소에 의해 영향을 받을 수 있으며, 매트릭스 효과라고 하는 신호의 부주의한 감소 또는 향상을 유발할 수 있다. 이러한 효과는 결과를 왜곡하고 분석에 상당한 오류를 일으킬 수 있습니다.

표준 추가 방법을 사용하여 측정 신호에 대한 매트릭스 효과를 최소화할 수 있습니다. 이는 알려진 별과식 용액의 정확한 볼륨을 샘플에 추가하여 수행됩니다.

이 비디오는 표준 추가 방법의 기초를 소개하고 형광 측정을 사용하여 실험실에서 기술을 수행하는 방법을 보여줍니다.

매트릭스 효과는 다른 분자의 숫자가 음과 식물과 상호 작용하는 복잡한 샘플에서 발생할 수 있습니다. 예를 들면, 이것은 분자가 문체와 결합하거나 응집할 때 생길 수 있고, 그 에 의해 형광하는 그것의 기능을 변경합니다. 또는 매트릭스는 전체 용액의 이온 강도를 변화시키고, 아닐리테의 특정 특성을 변화시킬 수 있다.

표준 추가 방법을 사용하여 이러한 효과를 완화하기 위해 샘플의 동일한 볼륨에 다양한 적물인 단화 표준 솔루션이 추가됩니다. 그런 다음 용매를 사용하여 용액 볼륨이 동일하게 만들어집니다.

이어서, 신호는 표준 첨가유무없이 시료에 대해 측정된다. 데이터는 고전적인 교정 곡선이 아닌 샘플에 추가된 표준의 양에 비해 강도로 플로팅됩니다. 주어진 플라스크에서 의 별분의 실제 농도는 다음 방정식에 의해 정의됩니다. 기악 반응은 aalyte의 농도의 일정 한 시간 동일합니다. 결과 방정식은 선형 양식 y=mx+b를 합니다. 따라서, 플롯이 0 흡수력으로 추정될 때, 차단은 시료의 알 수 없는 농도와 같다.

신호 플롯은 우려의 농도 범위를 통해 선형이어야 합니다. 또한 분석기의 샘플 매트릭스에 대한 분석비율이 변경됨에 따라 간섭이 달라지지 않아야 합니다. 마지막으로 매트릭스 자체는 자체적으로 측정 신호를 생성해서는 안 됩니다.

다음 실험은 형광이 아닌 종인 알루미늄을 8-하이드록시퀴놀린 또는 8HQ로 반응하여 형광 ALQ3 복합체를 형성합니다.

유기 용매에서 알루미늄 복합체의 형광을 측정한 다음 원래 알루미늄 용액의 농도와 관련이 있다. 이 방법은 금속 이온의 분석에서 일반적입니다.

이제 표준 추가 방법의 기본이 설명되고 실험의 기본이 설명되었으므로 실험실에서 기술을 수행합시다.

먼저 100ppm 알루미늄 스톡 솔루션을 물에 준비한 다음 이를 사용하여 1ppm 표준 솔루션을 준비합니다.

다음으로, 100mL 체피 플라스크에 8-하이드록시퀴놀린 또는 8HQ 2 g를 추가합니다.

조심스럽게 5.74 mL 빙하 아세트산을 추가한 다음 100mL 마크에 탈온화된 물로 희석합니다. 이 단계를 사용하면 8HQ가 수단계에서 용해될 수 있습니다.

다음으로, 100mL 표시 병에 암모늄 아세테이트 20g과 30% 암모늄 수산화의 7mL를 첨가하여 완충액을 준비하고 희석한다. pH 표시기 스틱으로 pH를 확인합니다. 이 버퍼는 결합할 때 8HQ 용액에서 산을 중화시키는 데 도움이 됩니다.

필요한 다른 시약에는 무수성 나트륨 황산염 및 분광성 등급 클로로폼이 포함됩니다.

이제 액체 액체 추출을 사용하여 수성 샘플을 유기 상으로 추출하여 샘플을 준비합니다. 후드 내부의 링 스탠드 링에 6개의 125mL 분리 깔때기를 놓습니다. 더러운 유리 제품이 결과를 왜곡하기 때문에 모든 유리 제품이 꼼꼼하게 깨끗합니다. 깔때기를 "공백", "0", "1", "2", "3", "4"라고 순차적으로 레이블을 지정합니다.

파이펫을 사용하여 "0"에서 "4"까지 "0"이라고 표시된 5개의 분리 유입경로 각각에 알 수 없는 알루미늄 용액25mL을 추가합니다. "빈"이라고 표시된 깔때기에 25mL의 탈온화된 물을 추가하여 공백을 준비합니다.

다음으로, 1ppm 표준 용액의 1, 2, 3 및 4mL을 해당 번호가 매겨진 깔때기에 추가합니다. 빈 또는 0 퍼널에 표준 솔루션을 추가하지 않습니다.

8HQ 솔루션 1mL과 버퍼 솔루션 3mL을 6개의 깔때기 각각에 추가합니다.

각 플라스크에 10mL의 클로로폼을 추가하여 액체 액체 추출을 수행합니다. 깔때기를 힘차게 흔들고 때로는 유입기를 배출하여 압력 축적을 방출합니다. 깔때기를 다시 링에 넣고 액체 레이어를 분리할 수 있도록 합니다.

다음으로, 100mL 비커로 깔끔하고 건조하며 라벨이 붙은 클로로폼 위상을 수집합니다. 클로로폼은 물보다 밀도가 높기 때문에 깔때기의 하층이다.

클로로폼 추출물을 25mL 체피 플라스크로 옮기고 각 플라스크를 캡하여 증발을 방지합니다.

각 깔때기에 10mL의 클로로폼을 추가하여 나머지 수성 용액에 두 번째 액체 액체 추출을 수행합니다. 깔때기를 흔들어 이전과 마찬가지로 남은 잔류염을 클로로폼 단계로 전송합니다. 상단 수성 단계에 노란색 색상이 남아 있지 않아야 합니다.

각 깔때기에 대한 두 번째 추출을 반복한 다음 해당 레이블이 부착된 비커에서 클로로폼 단계를 수집합니다. 수집된 클로로폼을 각각의 체피 플라스크에 붓고 신선한 클로로폼으로 마크에 희석합니다.

미량수를 제거하려면 6개의 100mL 비커 각각에 황산나트륨 약 1g을 추가합니다. 솔루션을 각각의 비커로 다시 옮기고 소용돌이를 통해 시료의 탈수를 용이하게 합니다.

클로로폼 추출물을 석영 형광계 세포로 탈포한다.

제조업체의 지침에 따라 플루오리미터를 설정하고 전압을 400 V로 설정합니다. 다음으로 컴퓨터에서 데이터 수집 프로그램을 엽니다.

샘플 2를 사용하여 최고의 여기 및 방출 파장을 결정합니다. 방출 파장을 500 nm로 설정하고 335-435 nm에서 스캐처 스캔을 실행하여 2 nm/s의 스캔 속도를 제공합니다.

형광 플롯에서, 여기에 대한 최대 파장을 결정합니다. 이 경우 399 nm의 해당 흥분 파장 값으로 계측기를 설정합니다.

다음으로, 450-550 nm에서 스캔을 수행하여 방출 파장을 결정한다. 생성된 형광 플롯에서 최대 파장을 결정하고 배출 파장을 설정하여 이 경우 520 nm를 설정합니다.

선택한 여기 및 방출 파장의 공백을 포함하여 각 샘플을 측정합니다. 각 형광 강도 판독값을 기록합니다.

다른 5개의 샘플각각에서 빈 샘플의 측정된 형광을 빼는다.

5개의 시료 각각의 형광 강도를 시료에 첨가한 알루미늄의 양에 비해 플롯한다. 결과 플롯의 최소 사각형 값을 결정하고 경사 및 가로채기를 기록합니다.

형광 강도대 알루미늄 첨가량의 플롯은 표시된 바와 같이 최소 정사각형 선을 산출했습니다. 시료의 알루미늄 양은 이 라인을 사용하여 계산할 수 있습니다. 알 수 없는 첨가물의 양은 25mL이었기 때문에, 결정된 값, 2.916 μg는 25mL로 나뉜다. 이것은 0.117 μg/mL, 또는 0.117 ppm의 최종 결과를 제공합니다. 이것은 0.110 ppm의 알려진 값에 매우 가깝습니다.

이제 행렬 효과로 인해 결과가 왜곡될 수 있는 다른 분석 기술을 살펴보겠습니다.

원자 흡수 분광법은 기체 상에서 표적 분석체에 의한 빛의 흡광도를 측정하는 분석 방법입니다. 대부분의 시료의 경우, 시료 농도에 대한 흡수를 관련시키는 간단한 교정 곡선은 알 수 없는 농도를 정량화하는 신뢰할 수 있는 방법으로 작용할 수 있다.

그러나, 이 기술은 혼합물의 다른 성분이 표적 분석물분석과 상호작용하고 흡수를 억제하거나 강화하는 경우에 정확도를 잃을 수 있다. 표준 추가 방법은 특히 분석 전에 매트릭스를 제거할 수 없는 샘플에서 이러한 상호 작용의 효과를 설명하기 위해 이 경우에 사용할 수 있습니다.

계측기 교정은 측정의 정확도에 중요한 역할을 합니다. 표준 첨가 방법은 종종 ICP-MS와 같은 계측기의 교정을 돕기 위해 사용됩니다. ICP-MS는 알 수 없는 시료의 측정이 화학 적 표준의 측정을 기반으로 한다는 것을 의미하는 비교 방법입니다.

따라서, 알 수없는 측정의 불확실성은 교정의 불확실성보다 더 좋을 수 없다. 따라서 표준 추가 방법을 사용하여 표준 방법보다 더 정확한 교정 곡선을 만들고 샘플에서 행렬 상호 작용을 기록할 수 있습니다.

많은 생물학적 분자는 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC를 사용하여 분석됩니다. HPLC는 극성, 전하 및 크기와 같은 분자 특성에 따라 복잡한 혼합물을 분리하고 분석하는 기술입니다. 분석을 통해 컬럼을 남기는 시간을 통해 사용자는 혼합물의 각 구성 요소를 식별할 수 있습니다.

생물학적 분자는 종종 혼합물에서 상호 작용할 수 있으며, 중단된 매트릭스에 의해 크게 영향을 받습니다. 종종 표준 추가 방법은 이러한 영향을 차지하는 교정 곡선을 만드는 데 사용됩니다.

당신은 표준 추가 방법에 대한 JoVE의 소개를 보았다. 이제 샘플 분석에서 매트릭스 효과를 설명하는 기술을 수행하는 방법을 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

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Results

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335-435에서 난회 파장의 스캔은 399 nm에서 가장 높은 흡수를 보였기 때문에 그 값에 대해 흥분 단색으로토르가 설정되었습니다. 이어서 방출 스캔은 450-550 nm에서 수행되었고, 가장 강한 신호는 520 nm에 있는 것으로 나타났다. 이들은 모든 샘플에 사용되는 파장입니다.

견본 형광 강도 보정형 형광 강도
0.008 0.000
견본 0.128 0.120
샘플 + 1mL 0.167 0.159
샘플 + 2mL 0.220 0.212
샘플 + 3mL 0.260 0.252
샘플 + 4mL 0.290 0.282

형광의 플롯(도 3)대. 알3 + 추가의 μg(도 4)의 최소 사각형 라인을 산출 :

형광 강도 = 0.0417 x (알3+ 추가의 μg) + 0.1216

Al3+ = -(Y-Int)/경사 = -0.1216/0.0417 = -2.916 μg/mL

알 수 없는 첨가물의 양은 25mL이었기 때문에 2.916 μg/mL 값을 25로 나눌 필요가 있다.

알 수 없는 알루미늄 농도 = 2.916 μg/mL / 25.0 mL = 0.117 μg/mL = 0.117 ppm
이는 0.110 ppm (6.4 % 오차)의 실제 값에 매우 가깝습니다.

Figure 3
그림 3. 샘플의 형광.

Figure 4
그림 4. 표준 추가 교정 플롯입니다.

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Applications and Summary

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표준 첨가 방법은 원자 흡수, 형광 분광법, ICP-OES 및 가스 크로마토그래피와 같은 분석 분석에 사용되는 정확한 정량적 결과가 원할 때 종종 활용되는 기술입니다. 이것은 종종 정량적 결과에 원하는 흡광도의 감소 또는 향상을 일으키는 관심있는 샘플에 다른 구성 요소가있을 때 사용됩니다. 이 경우 기존 교정 곡선 접근 방식을 사용하여 중단 신호와 표준을 비교할 수 없습니다. 실제로 행렬 효과 평가는 유효성 검사 절차의 필수 부분이어야 합니다.

표준 추가를 사용할 수 있는 또 다른 예는 오래 된 사진 폐기물에서 은을 추출 하는 경우. 폐기물은 은 할라이드를 포함하고, 은을 회수 할 수 있도록 추출 할 수 있습니다. 알려진 양의 은으로 알려지지 않은 "폐기물"을 스파이크함으로써 이 방법은 사진 필름에서 얻은 은의 양을 예측할 수 있습니다.

벤젠 제조 공장에 노출된 근로자는 종종 벤젠의 허용 수준 보다 안전하게 아래에 있는지 확인하기 위해 테스트됩니다. 그들의 소변은 화학 물질에 대 한 테스트, 그리고 그 생물 적인 매트릭스. 또한, 아닐라바이트 억제의 양은 사람에 따라 다르므로 단일 교정 키트가 작동하지 않습니다. 표준 추가 방법을 통해 모든 직원을 정확하게 테스트하고 평가할 수 있습니다.

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