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Spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis)
 
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Spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis)

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia

La spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis) è una delle tecniche analitiche più popolari perché è molto versatile e in grado di rilevare quasi tutte le molecole. Con la spettroscopia UV-Vis, la luce UV-Vis viene fatta passare attraverso un campione e viene misurata la trasmittanza della luce da parte di un campione. Dalla trasmittanza (T), l'assorbanza può essere calcolata come A=-log (T). Si ottiene uno spettro di assorbanza che mostra l'assorbanza di un composto a diverse lunghezze d'onda. La quantità di assorbanza a qualsiasi lunghezza d'onda è dovuta alla struttura chimica della molecola.

UV-Vis può essere utilizzato in modo qualitativo, per identificare gruppi funzionali o confermare l'identità di un composto abbinando lo spettro di assorbanza. Può anche essere usato in modo quantitativo, poiché la concentrazione dell'analita è correlata all'assorbanza usando la legge di Beer. La spettroscopia UV-Vis viene utilizzata per quantificare la quantità di DNA o proteine in un campione, per l'analisi dell'acqua e come rivelatore per molti tipi di cromatografia. La cinetica delle reazioni chimiche viene misurata anche con la spettroscopia UV-Vis prendendo ripetute misurazioni UV-Vis nel tempo. Le misurazioni UV-Vis sono generalmente prese con uno spettrofotometro. UV-Vis è anche un rivelatore molto popolare per altre tecniche analitiche, come la cromatografia, perché può rilevare molti composti.

Tipicamente, UV-Vis non è la tecnica di spettroscopia più sensibile, perché non molta luce viene assorbita su una breve lunghezza del percorso. Altre tecniche di spettroscopia come la fluorescenza hanno una sensibilità più elevata, ma non sono così generalmente applicabili, poiché la maggior parte delle molecole non sono fluorescenti. UV-Vis ha una sensibilità simile ad altre misurazioni di assorbanza, come la spettroscopia infrarossa.

Principles

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UV-Vis è spesso chiamata una tecnica generale perché la maggior parte delle molecole assorbirà nell'intervallo di lunghezze d'onda UV-Vis. L'UV si estende da 100-400 nm e lo spettro visibile da 400-700 nm. L'intervallo 100-200 nm è chiamato UV profondo. Le sorgenti luminose sono più difficili da trovare per questa gamma, quindi non viene utilizzata di routine per le misurazioni UV-Vis. I tipici spettrometri UV-Vis utilizzano una lampada al deuterio per l'UV che produce luce da 170-375 nm e una lampada a filamento di tungsteno per il visibile, che produce luce da 350-2.500 nm.

Quando un fotone colpisce una molecola e viene assorbito, la molecola viene promossa in uno stato energetico più eccitato. La luce visibile UV ha abbastanza energia per promuovere gli elettroni a uno stato elettronico più elevato, dal più alto orbitale molecolare occupato (HOMO) al più basso orbitale molecolare non occupato (LUMO). La differenza di energia tra l'HOMO e il LUMO è chiamata band gap. Tipicamente, questi orbitali sono chiamati bonding e anti-bonding. L'energia del fotone deve corrispondere esattamente al band gap affinché il fotone venga assorbito. Pertanto, le molecole con diverse strutture chimiche hanno diversi gap di banda energetica e diversi spettri di assorbimento. Le transizioni più comuni che rientrano nell'intervallo UV-Vis sono π-π* e n-π*. Gli orbitali Pi sorgono a causa di doppi legami e gli orbitali n sono per elettroni non leganti. Le stelle Pi sono orbitali pi anti-legame. Pertanto, il miglior assorbimento UV-Vis è da parte di molecole che contengono doppi legami. Gli orbitali Pi adiacenti l'uno all'altro che sono collegati, chiamati coniugazione, in genere aumentano l'assorbimento. Le transizioni Sigma-σ*, associate a singoli legami, sono ad alta energia e cadono nei raggi UV profondi, quindi sono meno utili per l'uso di routine. La comparsa di bande larghe o spalle sulla struttura UV-Vis è dovuta ai numerosi stati vibrazionali e rotazionali di una molecola, che portano a gap di banda di energia separati di energie leggermente diverse.

Per le molecole con assorbimento nella regione visibile, i composti appariranno spesso colorati. Tuttavia, un malinteso comune è che la lunghezza d'onda del picco di assorbimento (λmax) per un composto sia il colore che appare. Un composto che appare rosso non ha molto assorbimento nella regione rossa dello spettro. Invece, ilλ max per un composto che sembra rosso è verde. Il colore di un composto sorge perché quelle lunghezze d'onda della luce vengono trasmesse selettivamente attraverso il campione e quindi non vengono assorbite. Una ruota dei colori è utile per determinare quale colore assorbirà un composto e quale intervallo sarà il λmax, poiché il colore direttamente attraverso la ruota dal colore osservato è il colore che viene assorbito di più.

L'assorbimento segue la legge di Beer, A = εbC dove ε è il coefficiente di attenuazione molare, b è la lunghezza del percorso e C è la concentrazione. Il coefficiente di attenuazione molare è la caratteristica di un singolo composto da assorbire ad una data lunghezza d'onda e questa proprietà è dovuta a gruppi funzionali, coniugazione, ecc. Se un composto non ha un alto coefficiente di attenuazione, potrebbe essere etichettato con un gruppo appropriato per aumentare la sua assorbanza. La lunghezza del percorso è generalmente correlata alle dimensioni della cuvetta ed è di 1 cm negli spettrofotometri standard.

UV-Vis viene eseguito su una varietà di strumenti, dagli spettrofotometri tradizionali ai lettori di lastre più moderni. La lunghezza d'onda di assorbanza deve essere scelta, utilizzando un filtro o un monocromatore. Un monocromatore è un dispositivo che separa le lunghezze d'onda della luce spazialmente e quindi posiziona una fessura di uscita dove si trova la lunghezza d'onda desiderata della luce. I monocromatori possono essere scansionati per fornire un intero spettro di assorbanza. In alternativa, uno strumento a matrice di diodi consente di trasmettere tutti i colori della luce attraverso il campione, quindi la luce viene separata in diverse lunghezze d'onda spazialmente e rilevata utilizzando fotodiodi. Gli strumenti a matrice di diodi raccolgono spettri completi più velocemente, ma sono più complicati e più costosi.

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Procedure

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1. Calibrare lo spettrometro

  1. Accendere lo spettrometro UV-Vis e lasciare che le lampade si riscaldino per un periodo di tempo appropriato (circa 20 minuti) per stabilizzarle.
  2. Riempire una cuvetta con il solvente per il campione e assicurarsi che l'esterno sia pulito. Questo servirà come un bianco e aiuterà a tenere conto delle perdite di luce dovute alla dispersione o all'assorbimento da parte del solvente.
  3. Posizionare la cuvetta nello spettrometro. Assicurati di allineare correttamente la cuvetta, poiché spesso la cuvetta ha due lati, che sono pensati per la manipolazione (possono essere scanalati) e non sono pensati per far brillare la luce.
  4. Prendi una lettura per lo spazio vuoto. L'assorbanza dovrebbe essere minima, ma qualsiasi assorbanza dovrebbe essere sottratta dai campioni futuri. Alcuni strumenti potrebbero memorizzare i dati vuoti ed eseguire automaticamente la sottrazione.

2. Eseguire uno spettro di assorbanza

  1. Riempire la cuvetta con il campione. Per assicurarsi che il trasferimento sia quantitativo, sciacquare la cuvetta due volte con il campione e quindi riempirla di circa 3/4. Assicurati che l'esterno sia pulito da eventuali impronte digitali, ecc.
  2. Posizionare la cuvetta nello spettrometro nella direzione corretta.
  3. Coprire la cuvetta per evitare la luce ambientale.
  4. Raccogliere uno spettro di assorbanza consentendo allo strumento di scansionare diverse lunghezze d'onda e raccogliere l'assorbanza. L'intervallo di lunghezze d'onda può essere impostato con informazioni sul campione specifico, ma un intervallo di 200-800 nm è standard. Uno strumento a matrice di diodi è in grado di raccogliere un intero spettro di assorbanza in un'unica esecuzione.
  5. Dallo spettro di assorbanza raccolto, determinare il massimo di assorbanza (λmax). Ripetere la raccolta di spettri per ottenere una stima dell'errore in λmax.
  6. Per creare una curva di calibrazione, raccogliere lo spettro UV-Vis di una varietà di campioni di concentrazione diversi. Gli spettrometri sono spesso limitati nell'intervallo lineare e non saranno in grado di misurare un valore di assorbanza superiore a 1,5. Se i valori di assorbanza per il campione sono al di fuori dell'intervallo lineare dello strumento, diluire il campione per ottenere i valori all'interno dell'intervallo lineare.

3. Esperimenti di cinetica con spettroscopia UV-Vis

  1. UV-Vis può essere utilizzato per esperimenti di cinetica esaminando il cambiamento di assorbanza nel tempo. Per un esperimento di cinetica, prendere una lettura iniziale del campione.
  2. Aggiungere rapidamente il reagente per avviare la reazione chimica.
  3. Mescolare bene per mescolare con il campione. Se viene aggiunta una piccola quantità, questo potrebbe essere fatto in una cuvetta. In alternativa, mescolare il reagente con il campione e versarne rapidamente un po 'in una cuvetta per una misurazione.
  4. Misurare l'assorbanza almassimo λ per l'analita di interesse nel tempo. Se si utilizza il reagente da misurare(cioè l'assorbanza sta salendo perché c'è meno reagente da assorbire), allora il decadimento indicherà l'ordine della reazione.
  5. Utilizzando una curva di calibrazione, creare un grafico della concentrazione dell'analita rispetto al tempo, convertendo il valore di assorbanza in concentrazione. Da lì, questo grafico può essere adattato con equazioni appropriate per determinare le costanti di velocità di reazione.

La spettroscopia ultravioletta-visibile, o UV-Vis, è una delle tecniche analitiche più popolari in laboratorio.

Nella spettroscopia UV-Vis, la luce viene fatta passare attraverso un campione a una specifica lunghezza d'onda nello spettro UV o visibile. Se il campione assorbe parte della luce, non tutta la luce verrà attraversata o trasmessa. La trasmissione è il rapporto tra l'intensità della luce trasmessa e la luce incidente ed è correlata all'assorbanza. L'assorbanza può essere utilizzata in modo quantitativo, per ottenere la concentrazione di un campione. Può anche essere utilizzato in modo qualitativo, per identificare un composto abbinando l'assorbanza misurata su una gamma di lunghezze d'onda, chiamata spettro di assorbanza, ai dati pubblicati. Questo video introdurrà la spettroscopia UV-Vis e ne dimostrerà l'uso in laboratorio nel determinare la concentrazione del campione e la cinetica di reazione.

Quando un fotone colpisce una molecola e viene assorbito, la molecola viene promossa dal suo stato base in uno stato energetico superiore. La differenza di energia tra i due è il gap di banda. L'energia del fotone deve corrispondere esattamente al band gap affinché il fotone venga assorbito. La struttura chimica determina il gap di banda; quindi le molecole hanno ciascuna spettri di assorbanza unici.

L'assorbanza segue la legge di Beer, che afferma che l'assorbanza è uguale al coefficiente di attenuazione molare per la lunghezza del percorso e la concentrazione. Il coefficiente di attenuazione molare è correlato alla capacità del singolo composto di assorbire la luce di una specifica lunghezza d'onda. La lunghezza del percorso si riferisce alla distanza percorsa dalla luce attraverso il campione, che in genere è di 1 cm per le cuvette standard. La legge della birra può essere utilizzata per calcolare la concentrazione del campione, se l'assorbimento è noto, o può essere utilizzata una curva di calibrazione.

UV-Vis è spesso chiamata una tecnica generale, poiché la maggior parte delle molecole assorbe la luce nell'intervallo di lunghezze d'onda UV-visibili. La gamma UV si estende da 100 a 400 nm e lo spettro visibile varia da 400 a 700 nm. Tuttavia, la maggior parte degli spettrofotometri non funziona nell'intervallo UV profondo di 100-200 nm, poiché le sorgenti luminose in questo intervallo sono costose. La maggior parte degli spettrofotometri UV-Vis utilizza una lampada al deuterio per la gamma UV, che produce luce da 170-375 nm, e una lampada a filamento di tungsteno per la gamma visibile, che produce luce da 350-2.500 nm.

Poiché la sorgente luminosa è solitamente una lampada con ampi intervalli di lunghezze d'onda, la lunghezza d'onda di assorbanza specifica viene selezionata utilizzando filtri o un monocromatore. Un monocromatore è un dispositivo che separa spazialmente le lunghezze d'onda della luce e quindi posiziona una fessura di uscita dove si trova la lunghezza d'onda desiderata della luce. Il monocromatore può essere scansionato su un intervallo di lunghezze d'onda per fornire un intero spettro di assorbanza. Questo rende la tecnica utile per quantificare e identificare una vasta gamma di molecole.

Ora che le basi della spettroscopia UV-Vis sono state delineate, diamo un'occhiata a un semplice esperimento UV-Vis in laboratorio.

Prima di iniziare la misurazione, accendere lo spettrofotometro e lasciare che le lampade si riscaldino per un periodo di tempo appropriato per stabilizzarle.

Preparare uno spazio vuoto riempiendo una cuvetta pulita con il solvente campione, quindi pulire l'esterno con carta priva di lanugine per rimuovere eventuali impronte digitali.

Assicurarsi che la cuvetta sia allineata correttamente con i lati scanalati fuori dal percorso del fascio e inserirla nello spettrofotometro. Fissare il coperchio per evitare che la luce ambientale penetri nel sistema.

Misurare l'assorbanza del bianco a una lunghezza d'onda o su un intervallo di lunghezze d'onda. Registrare o salvare l'assorbanza, in quanto deve essere sottratta dall'assorbanza del campione.

Quindi, scartare lo spazio vuoto e risciacquare la cuvetta due volte con il campione. Quindi, riempire la cuvetta di circa 3/4 piena di campione. Pulire nuovamente l'esterno della cuvetta, per assicurarsi che sia pulito e privo di impronte digitali.

Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro con l'orientamento corretto e fissare il coperchio.

Raccogliere una misura di assorbanza o uno spettro alla stessa lunghezza d'onda o intervallo di lunghezze d'onda del bianco. Sottrarre lo spettro vuoto o la misurazione, se lo strumento non lo fa automaticamente.

Dallo spettro di assorbanza raccolto, determinare il massimo di assorbanza, o λmax.

Per quantificare la quantità di analita nel campione, creare una curva di calibrazione utilizzando un intervallo di concentrazioni di analita note. Per ulteriori informazioni su come costruire e utilizzare una curva di calibrazione, guarda il video di questa raccolta "Curve di calibrazione".

La misurazione dell'assorbanza può anche essere utilizzata per calcolare la cinetica di reazione misurando l'aumento o la diminuzione della concentrazione di composti durante la reazione. Inizia prendendo una lettura iniziale del campione, colorante blu in questo caso, al massimo assorbanza prima della reazione.

Quindi, aggiungere rapidamente il reagente, candeggina in questo caso, per avviare la reazione chimica. Mescolare bene, in modo che si mescoli con il campione.

Misurare l'assorbanza al massimo dell'assorbanza nel tempo.

Viene mostrato lo spettro di assorbanza iniziale del campione di colorante blu. I colori di sfondo mostrano i colori della luce nello spettro visibile. Il colorante blu ha un massimo di assorbanza a circa 630 nm.

La cinetica della reazione tra colorante blu e candeggina è stata misurata nel tempo. L'assorbanza del colorante blu diminuisce nel tempo, poiché reagisce con la candeggina. L'assorbanza raggiunge quasi lo zero dopo 300 s, indicando che la reazione è vicina al completamento. Per ulteriori informazioni su cinetica e reazioni, guarda il video di JoVE Science Education "Reaction Rate Laws".

La spettroscopia UV-Vis è utilizzata pesantemente in molte aree di ricerca diverse per identificare o quantificare un campione.

Ad esempio, la spettroscopia UV-Vis viene utilizzata pesantemente in campo biologico per quantificare la quantità di proteine in un campione. Un test di Bradford viene spesso utilizzato per quantificare le proteine, con l'aiuto di un colorante. In primo luogo, viene preparata una curva di calibrazione delle concentrazioni proteiche note, in genere utilizzando l'albumina sierica bovina o BSA. Quindi la macchia blu Coomassie viene aggiunta a ciascuno degli standard e al campione. L'assorbanza del complesso proteina-colorante viene quindi misurata a 595 nm.

In alternativa, le proteine possono essere misurate direttamente dalla loro assorbanza a 280 nm. In questo esempio, la concentrazione proteica viene quantificata utilizzando uno spettrofotometro a volume ultra basso. Per molte proteine, un'assorbanza di 1 è correlata a una concentrazione di 1 mg/mL.

La spettroscopia UV-Vis viene anche utilizzata per quantificare la quantità di cellule batteriche in una coltura cellulare. Per questa misurazione, l'assorbanza, o densità ottica, viene misurata a 600 nm. Tipicamente, una misurazione OD600 di 1 indica la presenza di 8 x 108 cellule batteriche per ml. Misurare la densità cellulare durante la crescita della coltura consente la determinazione della curva di crescita batterica e può aiutare a identificare quando una coltura è nella sua fase di crescita esponenziale.

L'ossido di azoto e il biossido di azoto, o NOx,sono un sottoprodotto dei gas di scarico delle automobili e possono essere dannosi per l'ambiente perché formano ozono troposferico dannoso. L'NOx può essere misurato facendolo reagire con una soluzione di acido sulfanilico e naptil-etilendiammina. La soluzione risultante è una molecola di colorante azoico di colore rosa, la cui intensità è direttamente correlata alla concentrazione di NOx. Questa concentrazione può quindi essere determinata utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla spettroscopia UV-visibile. Ora dovresti capire le basi del funzionamento UV-Vis, come misurare un campione usando un UV-Vis e come correlare l'assorbanza alla concentrazione del campione.

Grazie per l'attenzione!

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Results

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UV-Vis può essere utilizzato per ottenere uno spettro di composti colorati. Nella Figura 1Aviene mostrato lo spettro di assorbanza di un colorante blu. Lo sfondo mostra i colori della luce nello spettro visibile. Il colorante blu ha unaλ massima assorbanza nell'arancione/rosso. La Figura 1B mostra uno spettro di un colorante rosso, con λmax in verde.

La cinetica può essere misurata da un grafico di assorbanza a una lunghezza d'onda nel tempo. La Figura 2 mostra un grafico dell'assorbanza di un colorante blu (a 630 nm) mentre reagisce con la candeggina.

Figure 1
Figura 1. Spettri di assorbanza UV-Vis. A. Il colorante blu #1 ha la massima assorbanza nell'arancione / rosso. B. Il colorante rosso #40 ha la massima assorbanza nel verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. UV-Vis per la cinetica. L'assorbanza del colorante blu #1 mentre reagisce con la candeggina. La curva può essere adattata con un decadimento esponenziale, indicando la cinetica del primo ordine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Applications and Summary

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UV-Vis è utilizzato in molte analisi chimiche. Viene utilizzato per quantificare la quantità di proteine in una soluzione, poiché la maggior parte delle proteine assorbe fortemente a 280 nm. La Figura 3 mostra un esempio di spettri del citocromo C, che ha un'elevata assorbanza a 280 e anche a 450 a causa di un gruppo eme. UV-Vis è anche usato come tecnica standard per quantificare la quantità di DNA in un campione, poiché tutte le basi assorbono fortemente a 260 nm. Anche l'RNA e le proteine assorbono a 260 nm, quindi l'assorbanza ad altre lunghezze d'onda può essere misurata per verificare la ricerca di interferenze. In particolare, le proteine assorbono fortemente a 280 nm, quindi il rapporto di assorbanza a 280/260 può dare una misura del rapporto tra proteina e DNA in un campione.

La maggior parte delle analisi più semplici misurano l'assorbanza una lunghezza d'onda alla volta. Tuttavia, sono presenti più informazioni chimiche se le misurazioni vengono effettuate contemporaneamente a molte lunghezze d'onda. Gli strumenti a matrice di diodi catturano tutta la luce che viene trasmessa, dividono la luce in diversi colori usando un prisma o una griglia olografica, e quindi l'assorbanza a diverse lunghezze d'onda viene catturata su una matrice lineare di fotodiodi. Il vantaggio di questo metodo è che è utile per misurare molte molecole diverse contemporaneamente.

Figure 3
Figura 3. Spettro UV-Vis di una proteina. Il picco a 280 nm è indicativo di una proteina. Il picco a 450 è dovuto all'assorbanza del gruppo eme nel citocromo C.

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