Overview
מקור: המעבדה של ד"ר .B ג'יל וטון - אוניברסיטת וירג'יניה
ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה (UV-Vis) היא אחת הטכניקות האנליטיות הפופולריות ביותר מכיוון שהיא רב-תכליתית מאוד ומסוגלת לזהות כמעט כל מולקולה. עם ספקטרוסקופיית UV-Vis, אור UV-Vis מועבר דרך מדגם והעברת האור על ידי מדגם נמדדת. מהמשדר (T), ניתן לחשב את הספיגה כ- A=-log (T). ספקטרום ספיגה מתקבל המציג את הספיגה של תרכובת אורכי גל שונים. כמות הספיגה בכל אורך גל נובעת מהמבנה הכימי של המולקולה.
UV-Vis יכול לשמש באופן איכותי, לזהות קבוצות פונקציונליות או לאשר את זהותו של תרכובת על ידי התאמת ספקטרום הספיגה. ניתן להשתמש בו גם באופן כמותי, שכן ריכוז הניתוח קשור לספיגה באמצעות חוק הבירה. ספקטרוסקופיית UV-Vis משמשת לכימות כמות הדנ"א או החלבון במדגם, לניתוח מים וכגלאי לסוגים רבים של כרומטוגרפיה. קינטיקה של תגובות כימיות נמדדת גם עם ספקטרוסקופיית UV-Vis על ידי לקיחת מדידות UV-Vis חוזרות לאורך זמן. מדידות UV-Vis נלקחות בדרך כלל עם ספקטרופוטומטר. UV-Vis הוא גם גלאי פופולרי מאוד עבור טכניקות אנליטיות אחרות, כגון כרומטוגרפיה, כי זה יכול לזהות תרכובות רבות.
בדרך כלל, UV-Vis אינה טכניקת הספקטרוסקופיה הרגישה ביותר, כי לא הרבה אור נספג על פני אורך נתיב קצר. טכניקות ספקטרוסקופיות אחרות כגון פלואורסצנטיות יש רגישות גבוהה יותר, אבל הם אינם ישימים בדרך כלל, כמו רוב המולקולות אינן פלואורסצנטיות. ל-UV-Vis רגישות דומה למדידות ספיגה אחרות, כגון ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום.
Principles
UV-Vis נקרא לעתים קרובות טכניקה כללית כי רוב המולקולות יספגו בטווח אורך הגל UV-Vis. UV משתרע מ 100-400 ננומטר ואת הספקטרום הנראה מ 400-700 ננומטר. טווח 100-200 ננומטר נקרא UV עמוק. מקורות אור קשה יותר למצוא עבור טווח זה, ולכן הוא אינו משמש באופן שגרתי למדידות UV-Vis. ספקטרומטרים טיפוסיים UV-Vis להשתמש מנורת דיטריום עבור UV המייצר אור מ 170-375 ננומטר ומנורת חוט טונגסטן עבור גלוי, אשר מייצר אור מ 350-2,500 ננומטר.
כאשר פוטון פוגע במולקולה ונספג, המולקולה מקודמת למצב אנרגטי נרגש יותר. לאור הנראה ל-UV יש מספיק אנרגיה כדי לקדם אלקטרונים למצב אלקטרוני גבוה יותר, מהמסלול המולקולרי הכבוש הגבוה ביותר (HOMO) למסלול המולקולרי הכבוש הנמוך ביותר (LUMO). הפרש האנרגיה בין HOMO ל- LUMO נקרא פער הלהקה. בדרך כלל, מסלולי מסלול אלה נקראים מליטה ואנטי מליטה. האנרגיה של הפוטן חייבת להתאים בדיוק לפער הלהקה כדי שהפוטון ייספג. לכן, מולקולות עם מבנים כימיים שונים יש פערי רצועת אנרגיה שונים ספקטרום ספיגה שונה. המעברים הנפוצים ביותר הנופלים בטווח UV-Vis הם π-π* ו- n- π*. מסלולי פאי מתעוררים עקב קשרים כפולים, ו- n מסלוליות מיועדות לאלקטרונים שאינם מליטה. כוכב פאי הם מסלולי פאי אנטי מליטה. לכן, ספיגת UV-Vis הטובה ביותר היא על ידי מולקולות המכילות קשרים כפולים. מסלולי פאי הצמודים זה לזה המחוברים, הנקראים הטיות, בדרך כלל מגבירים את הספיגה. מעברי סיגמא-σ* הקשורים לקשרים בודדים, הם בעלי אנרגיה גבוהה יותר ונופלים בקרינת UV העמוקה, כך שהם פחות שימושיים לשימוש שגרתי. המראה של רצועות רחבות או כתפיים על מבנה UV-Vis נובע מצבי רטט וסיבוב רבים של מולקולה, אשר מובילים פערי רצועת אנרגיה נפרדים של אנרגיות שונות במקצת.
עבור מולקולות עם ספיגה באזור הנראה, התרכובות יופיעו לעתים קרובות בצבע. עם זאת, טעות נפוצה היא כי אורך הגל של ספיגת שיא (λמקסימום)עבור תרכובת הוא הצבע שהוא מופיע. תרכובת שנראית אדומה אין הרבה ספיגה באזור האדום של הספקטרום. במקום זאת,מקסימום עבור תרכובת שנראית אדומה היא ירוקה. צבעו של תרכובת מתעורר כי אלה אורכי גל של אור מועברים באופן סלקטיבי דרך המדגם, ולכן הם אינם נספגים. גלגל צבעים עוזר לקבוע איזה צבע תרכובת תספוג ואיזה טווח יהיהמקסימום λ, כמו הצבע ישירות על פני הגלגל מן הצבע הנצפה הוא הצבע כי הוא נספג ביותר.
הקליטה פועלת על פי חוק הבירה, A=εbC שבו ε הוא מקדם ההנחיה הטוחנת, b הוא אורך נתיב, ו- C הוא ריכוז. מקדם ההנחיה הטוחנת הוא המאפיין של תרכובת בודדת לספוג אורך גל נתון ורכוש זה נובע מקבוצות פונקציונליות, הטיות וכו '. אם תרכובת אין מקדם החלשהגבוהה , זה יכול להיות מתויג עם קבוצה מתאימה כדי להגדיל את הספיגה שלה. אורך הנתיב קשור בדרך כלל לגודל של cuvette והוא 1 ס"מ ספקטרופוטומטרים סטנדרטיים.
UV-Vis מבוצע על מגוון מכשירים, החל בספקטרופוטומטרים מסורתיים ועד לקוראי לוחות מודרניים יותר. יש לבחור את אורך הגל של הספיגה, באמצעות מסנן או מונוכרומט. מונוכרומט הוא מכשיר המפריד בין אורכי הגל של האור מרחבי ואז מציב חריץ יציאה שבו אורך הגל הרצוי של האור. ניתן לסרוק מונוכרומטים כדי לספק ספקטרום ספיגה שלם. לחלופין, מכשיר מערך דיודות מאפשר להעביר את כל צבעי האור דרך המדגם, ואז האור מופרד לאורכי גל שונים באופן מרחבי ומזוהה באמצעות פוטודיודות. מכשירים במערך דיודות אוספים ספקטרום מלא מהר יותר, אך הם מורכבים ויקרים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. כייל את הספקטרומטר
- הפעל את ספקטרומטר UV-Vis ואפשר למנורות להתחמם לפרק זמן מתאים (כ -20 דקות) כדי לייצב אותן.
- מלאו קובט בממס לדגימה וודאו שבחוץ נקי. זה ישמש ריק ולעזור להסביר הפסדים קלים עקב פיזור או ספיגה על ידי הממס.
- מניחים את הקובט בספקטרומטר. הקפד ליישר את cuvette כראוי, כמו לעתים קרובות cuvette יש שני צדדים, אשר נועדו לטיפול (עשוי להיות מחורץ) ואינם אמורים להאיר אור דרך.
- קח קריאה עבור הריק. הספיגה צריכה להיות מינימלית, אבל כל ספיגה צריכה להיות מופחתת מדגימות עתידיות. מכשירים מסוימים עשויים לאחסן את הנתונים הריקים ולבצע את החיסור באופן אוטומטי.
2. ביצוע ספקטרום ספיגה
- מלא את הקובט עם המדגם. כדי לוודא שההעברה כמותית, יש לשטוף את הקובט פעמיים עם המדגם ולאחר מכן למלא אותה כ-3/4 מלא. ודאו שבחוץ נקי מכל טביעות אצבעות וכו'.
- הנח את הקובט בספקטרומטר בכיוון הנכון.
- מכסים את התבלינים כדי למנוע אור סביבה.
- לאסוף ספקטרום ספיגה על ידי מתן אפשרות למכשיר לסרוק דרך אורכי גל שונים ולאסוף את הספיגה. ניתן להגדיר את טווח אורך הגל עם מידע על המדגם הספציפי, אך טווח של 200-800 ננומטר הוא סטנדרטי. מכשיר מערך דיודות מסוגל לאסוף ספקטרום ספיגה שלם בריצה אחת.
- מתוך ספקטרום הספיגה שנאסף, לקבוע את מקסימום הספיגה (λמקסימום). חזור על אוסף הספקטרום כדי לקבל הערכת שגיאה ב- λmax.
- כדי ליצור עקומת כיול, אסוף את ספקטרום ה- UV-Vis של מגוון דגימות ריכוז שונות. ספקטרומטרים מוגבלים לעתים קרובות בטווח הליניארי ולא יוכלו למדוד ערך ספיגה גדול מ- 1.5. אם ערכי הספיגה של המדגם נמצאים מחוץ לטווח הליניארי של הכלי, דלל את המדגם כדי לקבל את הערכים בטווח הליניארי.
3. ניסויים קינטיקה עם ספקטרוסקופיה UV-Vis
- UV-Vis יכול לשמש לניסויים קינטיים על ידי בחינת השינוי בספיגה לאורך זמן. לניסוי קינטיקה, יש לבצע קריאה ראשונית של המדגם.
- מוסיפים במהירות את ריאגנט כדי להתחיל את התגובה הכימית.
- מערבבים היטב לערבב עם המדגם. אם כמות קטנה מתווספת, זה יכול להיעשות cuvette. לחלופין, מערבבים את ריאגנט עם מדגם במהירות לשפוך קצת cuvette למדידה.
- למדוד את הספיגה ב λמקסימום עבור ניתוח של עניין לאורך זמן. אם משתמשים במדידת ריאגנט (כלומר הספיגה עולה מכיוון שיש פחות ריאגנט לספוג), הריקב יציין את סדר התגובה.
- באמצעות עקומת כיול, לעשות חלקה של ריכוז אנליסט לעומת זמן, המרת ערך הספיגה לריכוז. משם, גרף זה יכול להתאים למשוואות מתאימות כדי לקבוע את קבועי קצב התגובה.
ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה, או UV-Vis, היא אחת הטכניקות האנליטיות הפופולריות ביותר במעבדה.
בספקטרוסקופיית UV-Vis, האור מועבר דרך מדגם באורך גל מסוים בספקטרום UV או הנראה לעין. אם המדגם סופג חלק מהאור, לא כל האור יעבור, או יועבר. השידור הוא היחס בין עוצמת האור המועבר לאור האירוע, והוא מתואם לספיגה. הספיגה יכולה לשמש באופן כמותי, כדי להשיג את הריכוז של מדגם. ניתן להשתמש בו גם באופן איכותי, כדי לזהות תרכובת על ידי התאמת הספיגה הנמדדת על פני מגוון אורכי גל, הנקראים ספקטרום הספיגה, לנתונים שפורסמו. וידאו זה יציג ספקטרוסקופיה UV-Vis, ולהדגים את השימוש בו במעבדה בקביעת ריכוז מדגם קינטיקה תגובה.
כאשר פוטון פוגע במולקולה ונספג, המולקולה מקודמת ממצב הקרקע שלה למצב אנרגיה גבוה יותר. הפרש האנרגיה בין השניים הוא פער הרצועות. האנרגיה של הפוטן חייבת להתאים בדיוק לפער הרצועה כדי שהפוטון ייספג. המבנה הכימי קובע את פער הרצועה; לכן למולקולות יש ספקטרום ספיגה ייחודי.
הספיגה פועלת על פי חוק באר, הקובע כי הספיגה שווה למקדם ההנחיה הטוחנת כפול אורך המסלול והריכוז. מקדם ההנחיה הטוחנת קשור ליכולתו של המתחם הבודד לספוג אור אורך גל מסוים. אורך הנתיב מתייחס למרחק שעבר האור דרך המדגם, שהוא בדרך כלל 1 ס"מ עבור cuvettes סטנדרטי. ניתן להשתמש בחוק הבירה כדי לחשב ריכוז מדגם, אם הספיגה ידועה, או שניתן להשתמש בעקומת כיול.
UV-Vis נקרא לעתים קרובות טכניקה כללית, כמו רוב המולקולות לספוג אור בטווח אורך הגל הנראה UV. טווח UV משתרע בין 100-400 ננומטר, ואת הספקטרום הנראה נע בין 400-700 ננומטר. עם זאת, רוב הספקטרופוטומטרים אינם פועלים בטווח UV עמוק של 100-200 ננומטר, כמו מקורות אור בטווח זה הם יקרים. רוב ספקטרופוטומטרי UV-Vis משתמשים במנורת דיטריום לטווח UV, המייצרת אור מ-170-375 ננומטר, ומנורת חוט טונגסטן לטווח הנראה, המייצרת אור בין 350 ל-2,500 ננומטר.
מכיוון שמקור האור הוא בדרך כלל מנורה עם טווחי גל רחבים, אורך גל הספיגה הספציפי נבחר באמצעות מסננים או מונוכרומט. מונוכרומט הוא מכשיר המפריד בין אורכי הגל של האור מרחבי, ולאחר מכן מציב חריץ יציאה שבו אורך הגל הרצוי של האור. ניתן לסרוק את המונוכרומט על פני טווח אורך גל כדי לספק ספקטרום ספיגה שלם. זה הופך את הטכניקה שימושית לכימות וזיהוי מגוון רחב של מולקולות.
כעת, לאחר שהיסודות של ספקטרוסקופיית UV-Vis תוארו, בואו נסתכל על ניסוי UV-Vis פשוט במעבדה.
לפני תחילת המדידה, הפעל את הספקטרופוטומטר, ואפשר למנורות להתחמם לפרק זמן מתאים כדי לייצב אותן.
הכן ריק על ידי מילוי cuvette נקי עם ממס מדגם, ולאחר מכן לנגב את החוץ עם נייר ללא מוך כדי להסיר את כל טביעות האצבעות.
ודא כי cuvette מיושר כראוי עם כל הצדדים המרוצצים מתוך נתיב הקורה, ולהכניס אותו לתוך הספקטרופוטומטר. אבטחו את המכסה כדי למנוע כניסת נורית סביבה למערכת.
מדוד את ספיגת הריק אורך גל אחד, או על פני טווח אורך גל. הקלט או שמור את הספיגה, שכן יש להפחית אותה מספיגת המדגם.
לאחר מכן, להשליך את הריק ולשטוף את cuvette פעמיים עם מדגם. לאחר מכן, למלא את cuvette על 3/4 מלא עם מדגם. נגב שוב את החלק החיצוני של הקובט, כדי לוודא שהוא נקי וללא טביעות אצבעות.
מניחים את הקובט בספקטרופוטומטר בכיוון הנכון, ומאבטחים את המכסה.
לאסוף מדידת ספיגה או ספקטרום באותו טווח אורך גל או אורך גל כמו הריק. הפחת את הספקטרום או המדידה הריקים, אם המכשיר אינו עושה זאת באופן אוטומטי.
מתוך ספקטרום הספיגה שנאסף, לקבוע את מקסימום הספיגה, או λמקסימום.
כדי לכמת את כמות הניתוח במדגם, צור עקומת כיול באמצעות מגוון של ריכוזי ניתוח ידועים. לקבלת מידע נוסף על אופן הבנייה והשימוש בעקומת כיול, צפה בסרטון הווידאו של אוסף זה "עקומות כיול".
מדידת הספיגה יכולה לשמש גם לחישוב קינטיקה של תגובה על ידי מדידת הגידול או הירידה בריכוז תרכובות לאורך כל התגובה. התחל על ידי לקיחת קריאה ראשונית של המדגם, צבע כחול במקרה זה, במקסימום הספיגה לפני התגובה.
לאחר מכן, במהירות להוסיף את ריאגנט, אקונומיקה במקרה זה, כדי להתחיל את התגובה הכימית. מערבבים אותו היטב, כך שהוא מתערבב עם המדגם.
מדוד את הספיגה במקסימום הספיגה לאורך זמן.
ספקטרום הספיגה הראשוני של דגימת הצבע הכחול מוצג. צבעי הרקע מציגים את צבעי האור בספקטרום הנראה. הצבע הכחול בעל כושר ספיגה מרבי של כ-630 ננומטר.
הקינטיקה של התגובה בין צבע כחול לאבנה נמדדה לאורך זמן. הספיגה של צבע כחול פוחתת עם הזמן, כפי שהוא מגיב עם אקונומיקה. הספיגה מגיעה קרוב לאפס לאחר 300 s, מה שמצביע על כך שהתגובה התקרבה לסיום. לקבלת מידע נוסף על קינטיקה ותגובות, אנא צפו בסרטון החינוך המדעי JoVE "חוקי קצב התגובה".
ספקטרוסקופיית UV-Vis משמשת בכבדות באזורי מחקר רבים ושונים כדי לזהות או לכמת מדגם.
לדוגמה, ספקטרוסקופיית UV-Vis משמשת בכבדות בשדות ביולוגיים כדי לכמת את כמות החלבון במדגם. ברדפורד נעשה שימוש לעתים קרובות כדי לכמת חלבונים, בעזרת צבע. ראשית, עקומת כיול של ריכוזי חלבון ידועים מוכנה, בדרך כלל באמצעות אלבומין סרום בקר, או BSA. ואז כתם כחול קומאסי מתווסף לכל אחד מהתקנים ולדגימה. הספיגה של קומפלקס צבע החלבון נמדדת אז ב-595 ננומטר.
לחלופין, חלבונים יכולים להימדד ישירות על ידי ספיגתם ב 280 ננומטר. בדוגמה זו, ריכוז החלבון מכומת באמצעות ספקטרופוטומטר בנפח נמוך במיוחד. עבור חלבונים רבים, ספיגה של 1 בקורלציה לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
ספקטרוסקופיית UV-Vis משמשת גם לכימות כמות תאי החיידקים בתרבית התאים. עבור מדידה זו, הספיגה, או צפיפות אופטית, נמדדת ב 600 ננומטר. בדרך כלל,מדידת OD 600 של 1 מציינת את נוכחותם של 8 x 108 תאים חיידקיים לכל mL. מדידת צפיפות התאים לאורך כל צמיחת התרבות מאפשרת את קביעת עקומת הצמיחה החיידקית, ויכולה לסייע בזיהוי מתי תרבות נמצאת בשלב הצמיחה המעריכי שלה.
תחמוצת חנקן וחנקן דו חמצני, או NOx, הוא תוצר לוואי של פליטת רכב, והוא יכול להזיק לסביבה כי זה יוצר אוזון טרופוספירי מזיק. NOX ניתן למדוד על ידי תגובה זה עם פתרון של חומצה גופרתית, נפתיל-אתילנדיאמין. הפתרון המתקבל הוא מולקולת צבע אזו בצבע ורוד, שעוצמתה מתואמת ישירות לריכוזNO x. ריכוז זה ניתן לקבוע לאחר מכן באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis.
הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לספקטרוסקופיה הנראית ל-UV. עכשיו אתה צריך להבין את היסודות של פעולת UV-Vis, איך למדוד מדגם באמצעות UV-Vis וכיצד לתאם ספיגה לריכוז מדגם.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
UV-Vis יכול לשמש כדי להשיג ספקטרום של תרכובות צבעוניות. באיור 1Aמוצג ספקטרום הספיגה של צבע כחול. הרקע מציג את צבעי האור בספקטרום הנראה לעין. הצבע הכחול בעל ספיגהמקסימלית בכתום/אדום. איור 1B מציג ספקטרום של צבע אדום, עםמקסימום בירוק.
ניתן למדוד קינטיקה ממזימה של ספיגה אורך גל אחד לאורך זמן. איור 2 מציג חלקה של ספיגת צבע כחול (ב-630 ננומטר) כשהוא מגיב באקונומיקה.
איור 1. ספקטרום ספיגת UV-Vis. א. #1 הצבע הכחול יש ספיגה מקסימלית בכתום/ אדום. ב. #40 צבע אדום יש ספיגה מקסימלית בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. או-וי לקינטיקה. ספיגת צבע כחול #1 כפי שהוא מגיב עם אקונומיקה. העקומה יכולה להתאים לריקבון מעריכי, המציין קינטיקה מסדר ראשון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
UV-Vis משמש ניתוחים כימיים רבים. הוא משמש כדי כמות כמות החלבון בתמיסה, כמו רוב החלבונים לספוג חזק ב 280 ננומטר. איור 3 מציג ספקטרום לדוגמה של ציטוכרום C, בעל ספיגה גבוהה ב-280 וגם ב-450 בגלל קבוצת heme. UV-Vis משמש גם טטכניקה סטנדרטית כדי לכמת את כמות ה- DNA במדגם, כמו כל הבסיסים לספוג חזק ב 260 ננומטר. RNA וחלבונים נספגים גם הם ב-260 ננומטר, כך שניתן למדוד ספיגה באורכי גל אחרים כדי לבדוק אם יש הפרעות. באופן ספציפי, חלבונים סופגים בחוזקה ב 280 ננומטר, כך היחס של ספיגה ב 280/260 יכול לתת מידה של היחס בין חלבון ל- DNA במדגם.
הניתוחים הפשוטים ביותר מודדים את אורך הגל של הספיגה אורך גל אחד בכל פעם. עם זאת, מידע כימי נוסף קיים אם מדידות נעשות אורכי גל רבים בו זמנית. מכשירים במערך דיודות לוכדים את כל האור המועבר, מפצלים את האור לצבעים שונים באמצעות מנסרה או סורג הולוגרפי, ואז ספיגה באורכי גל שונים נלכדת במערך ליניארי של פוטודיודות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא שימושית למדידת מולקולות רבות ושונות בו זמנית.
איור 3. ספקטרום UV-Vis של חלבון. השיא ב 280 ננומטר מעיד על חלבון. השיא ב 450 נובע מספיגת קבוצת heme בציטכרום C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
