Overview
출처: 박사의 실험실.B 질 벤턴 - 버지니아 대학
자외선가 시동(UV-Vis) 분광법은 매우 다재다능하고 거의 모든 분자를 검출할 수 있기 때문에 가장 인기 있는 분석 기술 중 하나입니다. UV-Vis 분광법을 사용하면 UV-Vis 광이 샘플을 통과하고 샘플에 의한 빛의 투과를 측정합니다. 송신(T)에서 흡광도는 A=로그(T)로 계산할 수 있다. 흡광도 스펙트럼은 상이한 파장에서 화합물의 흡광도를 나타낸다. 모든 파장에서의 흡광도의 양은 분자의 화학 적 구조에 기인한다.
UV-Vis는 질적 방식으로 사용될 수 있으며, 기능성 군을 식별하거나 흡광도 스펙트럼을 일치시킴으로써 화합물의 정체성을 확인할 수 있다. 또한 분석물의 농도가 맥주법을 사용하여 흡수와 관련이 있기 때문에 정량적 방식으로 사용될 수 있습니다. UV-Vis 분광법은 샘플, 물 분석 및 많은 유형의 크로마토그래피에 대한 검출기로 DNA 또는 단백질의 양을 정량화하는 데 사용됩니다. 화학 반응의 운동학은 또한 시간이 지남에 따라 반복UV-Vis 측정을 취하여 UV-Vis 분광법으로 측정됩니다. UV-Vis 측정은 일반적으로 분광계로 촬영됩니다. UV-Vis는 또한 많은 화합물을 검출할 수 있기 때문에 크로마토그래피와 같은 다른 분석 기술에 매우 인기 있는 검출기입니다.
일반적으로 UV-Vis는 가장 민감한 분광법이 아니며, 많은 빛이 짧은 경로 길이에 흡수되지 않기 때문입니다. 형광과 같은 그밖 분광법은 더 높은 감도가 있습니다, 그러나 대부분의 분자가 형광이 아니기 때문에 일반적으로 적용되지 않습니다. UV-Vis는 적외선 분광법과 같은 다른 흡광도 측정에 유사한 민감성을 가집니다.
Principles
UV-Vis는 대부분의 분자가 UV-Vis 파장 범위에서 흡수하기 때문에 종종 일반적인 기술이라고 합니다. UV는 100-400 nm에서 확장되며 400-700 nm에서 가시 스펙트럼을 확장합니다. 100-200 nm 범위는 깊은 UV라고합니다. 광원은 이 범위에 대해 찾기가 더 어렵기 때문에 UV-Vis 측정에는 일상적으로 사용되지 않습니다. 일반적인 UV-Vis 분광기는 170-375nm의 빛을 생산하는 UV용 중수소 램프와 350-2,500nm의 빛을 생성하는 눈에 보이는 텅스텐 필라멘트 램프를 사용합니다.
광자 분자에 부딪히고 흡수되면 분자는 더 흥분된 활기찬 상태로 승진됩니다. 자외선은 전자를 더 높은 전자 상태로 촉진하는 충분한 에너지를 가지고 있으며, 가장 높은 점유 분자 궤도(HOMO)에서 가장 낮은 비어 있는 분자 궤도(LUMO)에 이르기까지. 호모와 LUMO의 에너지 차이를 밴드 갭이라고 합니다. 일반적으로 이러한 궤도는 결합 및 결합 방지라고 합니다. 광자의 에너지는 광자 흡수를 위한 밴드 간격과 정확히 일치해야 합니다. 따라서, 다른 화학 구조를 가진 분자는 다른 에너지 밴드 간격 및 다른 흡수 스펙트럼을 갖는다. UV-Vis 범위에 속하는 가장 일반적인 전환은 π-π*와 n-π*입니다. 파이 궤도는 이중 결합으로 인해 발생하고, n 궤도는 비 결합 전자입니다. 파이 스타는 안티 본드 파이 궤도입니다. 따라서, 최고의 UV-Vis 흡수는 이중 결합을 포함하는 분자에 의한 것입니다. 접합이라고 불리는 서로 인접한 Pi 궤도는 일반적으로 흡수를 증가시킵니다. 단일 채권과 관련된 시그마-σ* 전환은 에너지가 높고 깊은 UV에 떨어지므로 일상적인 사용에 덜 유용합니다. UV-Vis 구조에 넓은 밴드 또는 어깨의 모양은 약간 다른 에너지의 별도의 에너지 밴드 간격으로 이어지는 분자의 수많은 진동 및 회전 상태 때문입니다.
가시 적인 지역에서 흡수 하는 분자에 대 한, 화합물은 종종 색깔 표시 됩니다. 그러나, 일반적인 오해는 화합물에 대한 피크 흡수(λmax)의파장이 나타나는 색이라는 것이다. 빨간색으로 나타나는 화합물은 스펙트럼의 적색 영역에서 많은 흡수를 하지 않습니다. 대신, 빨간색으로 보이는 화합물의 λ최대값은 녹색입니다. 화합물의 색상은 빛의 파장이 시료를 통해 선택적으로 전달되기 때문에 발생하므로 흡수되지 않습니다. 컬러 휠은 관찰된 색상에서 휠을 가로질러 직접 색상이 가장 흡수되는 색상이기 때문에 화합물이 흡수할 색상과 λmax의 범위를 결정하는 데 도움이 됩니다.
흡수는 맥주의 법칙, a=θbC를 따르며, ε 어금니 감쇠 계수이고, b는 경로 길이이고, C는 농도입니다. 어금니 감쇠 계수는 주어진 파장에서 흡수하는 개별 화합물의 특성이며, 이 성질은 기능성 군, 컨쥬게이션 등에 기인한다. 화합물이 높은 감쇠 계수를가지고 있지 않은 경우, 흡광도를 높이기 위해 적절한 그룹으로 태그될 수 있습니다. 경로 길이는 일반적으로 큐벳의 크기와 관련이 있으며 표준 분광계에서 1cm입니다.
UV-Vis는 전통적인 분광계에서 부터 현대판 판독기까지 다양한 계측기에서 수행됩니다. 흡광도 파장을 필터 또는 모노크로마토르를 사용하여 선택해야 합니다. 단색로마토르는 빛의 파장을 공간적으로 분리한 다음 원하는 빛의 파장이 있는 출구 슬릿을 배치하는 장치입니다. 단색광제는 전체 흡광도 스펙트럼을 제공하기 위해 스캔할 수 있습니다. 또는 다이오드 어레이 계측기는 모든 색상의 빛이 시료를 통해 전달될 수 있게 하고, 빛은 공간적으로 서로 다른 파장으로 분리되고 포토다이오드를 사용하여 감지됩니다. 다이오드 어레이 계측기는 전체 스펙트럼을 더 빠르게 수집하지만 더 복잡하고 더 비쌉습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. 분광계 교정
- UV-Vis 분광기를 켜고 램프가 적절한 기간(약 20분)동안 예열하여 안정화되도록 합니다.
- 큐벳을 샘플용 용매로 채우고 외부가 깨끗한지 확인합니다. 이것은 빈 역할을하고 용매에 의한 산란 또는 흡수로 인한 가벼운 손실을 설명하는 데 도움이됩니다.
- 큐벳을 분광계에 놓습니다. 큐벳은 핸들링(홈일 수 있음)을 위한 양면을 가지고 있으며 빛을 비추기 위한 것이 아니기 때문에 큐벳을 올바르게 정렬해야 합니다.
- 빈 공간을 읽으십시오. 흡수도는 최소화해야 하지만, 흡수도는 향후 샘플에서 빼야 합니다. 일부 계측기는 빈 데이터를 저장하고 빼기 작업을 자동으로 수행할 수 있습니다.
2. 흡광스펙트럼 수행
- 큐벳을 샘플로 채웁니다. 전송이 정량적인지 확인하려면 큐벳을 샘플로 두 번 헹구고 약 3/4 전체를 채웁니다. 외부가 지문 등을 깨끗하게 하고 있는지 확인하십시오.
- 큐벳을 분광기에 올바른 방향으로 배치합니다.
- 큐벳을 덮어 주변 광을 방지합니다.
- 악기가 다른 파장을 통해 스캔하고 흡수도를 수집 할 수 있도록하여 흡수 스펙트럼을 수집합니다. 파장 범위는 특정 샘플에 대한 정보로 설정할 수 있지만 200-800 nm의 범위는 표준입니다. 다이오드 어레이 계측기는 한 번의 실행으로 전체 흡광도 스펙트럼을 수집할 수 있습니다.
- 수집된 흡수 스펙트럼으로부터, 흡수도 최대(λmax)를결정한다. 스펙트럼의 컬렉션을 반복하여 λ 최대값에서 오차 추정치를얻습니다.
- 교정 곡선을 만들려면 다양한 농도 샘플의 UV-Vis 스펙트럼을 수집합니다. 분광계는 종종 선형 범위에서 제한되며 1.5보다 큰 흡광도 값을 측정할 수 없습니다. 샘플의 흡광도 값이 계측기의 선형 범위 외부에 있는 경우 샘플을 희석하여 선형 범위 내에서 값을 가져옵니다.
3. UV-비스 분광기와 운동 실험
- UV-Vis는 시간이 지남에 따라 흡광도의 변화를 검사하여 운동 실험에 사용할 수 있습니다. 운동 학 실험의 경우 샘플을 초기 읽기로 하십시오.
- 시약을 빠르게 추가하여 화학 반응을 시작합니다.
- 잘 저어서 샘플과 섞습니다. 소량이 추가되면 큐벳에서 이 작업을 수행할 수 있습니다. 또는 시약을 시료와 혼합하여 큐벳에 빠르게 붓습니다.
- 시간이 지남에 따라 관심 있는 단량에 대 한 λ최대에서 흡광도측정. 측정 중인 시약을 사용하는경우(즉, 흡수시약이 적기 때문에 흡수성이 올라가고 있음), 부패는 반응의 순서를 나타냅니다.
- 교정 곡선을 사용하여, 흡수성 값을 농도로 변환, 시간 대 Aalyte 농도의 플롯을 합니다. 거기에서,이 그래프는 반응 속도 상수를 결정하기 위해 적절한 방정식에 맞을 수 있습니다.
자외선가 보이는 또는 UV-Vis, 분광법은 실험실에서 가장 인기있는 분석 기술 중 하나입니다.
UV-Vis 분광법에서, 빛은 UV 또는 가시 스펙트럼에 있는 특정 파장에서 견본을 통과합니다. 시료가 일부 빛을 흡수하는 경우 모든 빛이 통과되거나 전달되는 것은 아닙니다. 전송은 입사 광에 전달된 빛의 강도의 비율이며, 흡광도와 상관관계가 있다. 흡광도는 정량적 방식으로 사용될 수 있으며, 시료의 농도를 얻을 수 있다. 또한 임광도 스펙트럼이라고 하는 파장의 범위에 걸쳐 측정된 흡광도를 공표된 데이터에 일치시킴으로써 질적 방식으로 사용될 수 있다. 이 비디오는 UV-Vis 분광법을 소개하고, 견본 집중 및 반응 운동학을 결정하는 실험실에서 그것의 사용을 보여줍니다.
광자 분자에 부딪히고 흡수되면 분자는 지상 상태에서 더 높은 에너지 상태로 승진합니다. 둘 사이의 에너지 차이는 밴드 갭입니다. 광자의 에너지는 광자흡수를 위해서는 밴드 갭과 정확히 일치해야 합니다. 화학 구조는 대역 간격을 결정합니다. 따라서 분자는 각각 고유한 흡광도 스펙트럼을 가지고 있습니다.
흡수력은 흡광도가 경로 길이와 농도의 배율 감쇠 계수시간과 동일한 맥주의 법칙을 따릅니다. 어금니 감쇠 계수는 특정 파장의 빛을 흡수하는 개별 화합물의 능력과 관련이 있다. 경로 길이는 일반적으로 표준 큐벳의 경우 1cm인 시료를 통해 빛으로 이동한 거리를 말합니다. 맥주의 법칙은 흡수성이 알려지거나 교정 곡선을 사용할 수 있는 경우 시료 농도를 계산하는 데 사용될 수 있습니다.
UV-Vis는 대부분의 분자가 UV 가시 파장 범위에서 빛을 흡수하기 때문에 종종 일반적인 기술이라고합니다. UV 범위는 100~400nm에서 연장되며, 가시 스펙트럼은 400~700nm입니다. 그러나, 대부분의 분광광계는 이 범위의 광원이 비싸기 때문에 100-200 nm의 깊은 UV 범위에서 작동하지 않습니다. 대부분의 UV-Vis 분광기는 170-375 nm의 빛을 생산하는 UV 범위에 대 한 중테리움 램프를 사용 하 여, 그리고 350-2,500 nm에서 빛을 생산 하는 가시 범위에 대 한 텅스텐 필라멘트 램프.
광원은 일반적으로 파장 범위가 넓은 램프이기 때문에 특정 흡광파장이 필터 또는 단색으로도를 사용하여 선택됩니다. 단색로마토르는 빛의 파장을 공간적으로 분리한 다음 원하는 빛의 파장이 있는 출구 슬릿을 배치하는 장치입니다. 단색소는 파장 범위에서 스캔하여 전체 흡광도 스펙트럼을 제공할 수 있습니다. 이것은 분자의 넓은 범위를 정량화하고 확인하는 데 유용한 기술을 만든다.
이제 UV-Vis 분광기의 기본이 설명되었으므로 실험실에서 간단한 UV-Vis 실험을 살펴볼 수 있습니다.
측정을 시작하기 전에 분광계를 켜고 램프가 적절한 시간 동안 워밍업하여 안정화할 수 있도록 합니다.
깨끗한 큐벳을 샘플 용매로 채우고, 지문을 제거하기 위해 보풀이 없는 종이로 외부를 닦아 빈 칸을 준비합니다.
큐벳이 빔 경로에서 홈이 있는 측면과 적절하게 정렬되었는지 확인하고 분광계에 삽입합니다. 주변 광이 시스템에 들어오는 것을 방지하기 위해 뚜껑을 고정합니다.
한 파장에서 또는 파장 범위에서 공백의 흡광도를 측정합니다. 샘플의 흡광도에서 빼야 하므로 흡광도를 기록하거나 저장하십시오.
다음으로 빈 칸을 버리고 큐벳을 샘플로 두 번 헹둡다. 그런 다음, 샘플로 가득 3/4에 대한 큐벳을 채웁니다. 큐벳의 바깥쪽을 다시 닦아 지문이 깨끗하고 없는지 확인합니다.
큐벳을 분광계에 올바른 방향으로 배치하고 뚜껑을 고정합니다.
공백과 동일한 파장 또는 파장 범위에서 흡광도 측정 또는 스펙트럼을 수집합니다. 기기가 자동으로 그렇게하지 않는 경우 빈 스펙트럼 또는 측정을 뺍니다.
수집된 흡수 스펙트럼에서 흡수도 최대 또는 λ최대를 결정한다.
샘플에서 의 당분물의 양을 정량화하려면 알려진 다량의 다량의 다양한 것을 사용하여 교정 곡선을 만듭니다. 교정 곡선을 구성하고 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 이 컬렉션의 비디오 "교정 곡선"을 참조하십시오.
흡광도 측정은 또한 반응 전반에 걸쳐 화합물 농도의 증가 또는 감소를 측정하여 반응 운동학을 계산하는 데 사용될 수 있다. 이 경우 시료의 초기 판독을 복용하여 시작, 이 경우 청색 염료, 반응 전에 흡수도 최대.
다음으로, 이 경우 시약, 표백제를 신속하게 추가하여 화학 반응을 시작합니다. 잘 저어서 샘플과 섞이게 됩니다.
시간이 지남에 따라 최대 흡광도에서 흡광도를 측정합니다.
청색 염료 샘플의 초기 흡광도 스펙트럼이 도시된다. 배경 색상은 가시 스펙트럼의 빛의 색상을 표시합니다. 파란색 염료는 약 630 nm에서 최대 출력을 가지고 있습니다.
청색 염료와 표백제 사이의 반응의 운동은 시간이 지남에 따라 측정되었다. 표백제와 반응하기 때문에 청색 염료의 흡수도는 시간이 지남에 따라 감소합니다. 흡광도는 300s 이후 0에 가까워지며 반응이 거의 완료되었음을 나타냅니다. 운동 과 반응에 대한 자세한 내용은 JoVE 과학 교육 비디오 "반응 비율 법"을 참조하십시오.
UV-Vis 분광법은 샘플을 식별하거나 정량화하기 위해 다양한 연구 분야에서 많이 사용됩니다.
예를 들어, UV-Vis 분광법은 생물학적 분야에서 크게 사용되어 샘플에서 단백질의 양을 정량화합니다. 브래드포드 분석은 종종 염료의 도움으로 단백질을 정량화하는 데 사용됩니다. 첫째, 알려진 단백질 농도의 교정 곡선이 제조되며, 전형적으로 소세럼 알부민 또는 BSA를 이용하여 제조된다. 그런 다음 쿠마시 블루 얼룩은 각 표준과 샘플에 추가됩니다. 단백질 염료 복합체의 흡수도는 595nm에서 측정됩니다.
대안적으로, 단백질은 280 nm에서 그들의 흡수도에 의해 직접 측정될 수 있습니다. 이 예에서, 단백질 농도는 초저용량 분광광계를 사용하여 정량화된다. 많은 단백질의 경우, 1의 흡수도는 1 mg/mL의 농도와 상관관계가 있습니다.
UV-Vis 분광법은 또한 세포 배양에서 세균 세포의 양을 정량화하기 위하여 이용됩니다. 이 측정을 위해, 흡광도, 또는 광학 밀도는 600 nm에서 측정됩니다. 전형적으로, 1의 OD600 측정은 mL 당 8 x 108 세균 세포의 존재를 나타낸다. 배양 성장을 통해 세포 밀도를 측정하면 세균 성장 곡선의 측정을 가능하게 하며, 배양이 기하급수적인 성장 단계에 있는 시기를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
질소 산화물 및 이산화질소, 또는 NOx는자동차 배기의 부산물이며, 해로운 열대 오존을 형성하기 때문에 환경에 해로울 수 있다. NOx는 설파닐산과 낮잠-에틸렌디아민의 용액으로 반응하여 측정할 수 있다. 결과 용액은 분홍색 색의 아조 염료 분자이며, 그 강도는 NOx 농도와 직접 상관 관계가 있습니다. 이러한 농도는 UV-Vis 분광광계를 사용하여 결정할 수 있습니다.
당신은 방금 자외선 분석법에 대한 JoVE의 소개를 지켜보았습니다. 이제 UV-Vis 작동의 기본 사항, UV-Vis를 사용하여 샘플을 측정하는 방법 및 흡광도를 샘플 농도와 상호 연관시키는 방법을 이해해야 합니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
UV-Vis는 유색 화합물의 스펙트럼을 얻기 위해 사용될 수있다. 도 1A에서,청색 염료의 흡광스펙트럼이 도시된다. 배경은 가시 스펙트럼의 빛의 색상을 보여줍니다. 파란색 염료는 주황색/빨간색의 λ최대 흡광도를 가지고 있습니다. 도 1B는 녹색에 λ최대가 있는 적색 염료의 스펙트럼을 나타낸다.
운동학은 시간이 지남에 따라 한 파장에서 흡광도의 플롯에서 측정 될 수있다. 도 2는 표백제와 반응할 때 파란색 염료(630 nm)의 흡광도 플롯을 나타낸다.
그림 1. UV-비스 흡광도 스펙트럼. A. 파란색 염료 #1 주황색/빨간색의 최대 흡광도를 가합니다. B. 붉은 염료 #40 녹색에 최대 흡광도가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 운동용 UV-Vis. 표백제와 반응할 때 파란색 염료의 흡수성이 #1. 곡선은 지수 붕괴와 맞을 수 있으며, 이는 첫 번째 순서 역학을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
UV-Vis는 많은 화학 적 분석에 사용됩니다. 대부분의 단백질이 280 nm에서 강하게 흡수되기 때문에 용액에서 단백질의 양을 양량화하는 데 사용됩니다. 도 3은 혈중으로 인해 280과 450에서 높은 흡광도를 가지는 사이토크롬 C의 예를 나타낸다. UV-Vis는 또한 모든 염기가 260 nm에서 강하게 흡수되기 때문에 샘플에서 DNA의 양을 정량화하는 표준 기술로 사용됩니다. RNA와 단백질은 또한 260 nm에서 흡수되기 때문에 다른 파장의 흡광도는 간섭을 확인하기 위해 측정할 수 있습니다. 특히, 단백질은 280 nm에서 강하게 흡수되므로 280/260의 흡광도 비율은 샘플에서 DNA에 대한 단백질 의 비율을 측정할 수 있습니다.
대부분의 간단한 분석은 한 번에 하나의 파장을 측정합니다. 그러나, 측정이 동시에 많은 파장에서 이루어지는 경우에 더 많은 화학 정보가 존재합니다. 다이오드 어레이 계측기는 전송되는 모든 빛을 캡처하고, 프리즘 또는 홀로그램 격자를 사용하여 빛을 다른 색상으로 분할한 다음, 다른 파장에서 흡수성이 선형 광다이오드 배열에 포착됩니다. 이 방법의 장점은 많은 다른 분자를 동시에 측정하는 데 유용하다는 것입니다.
그림 3. 단백질의 UV-Vis 스펙트럼. 280 nm의 피크는 단백질을 나타냅니다. 450에서 피크는 사이토크롬 C에서 헴 그룹의 흡수성 때문입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
