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Preparazione del campione per la caratterizzazione analitica
 
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Preparazione del campione per la caratterizzazione analitica

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia

La preparazione del campione è il modo in cui un campione viene trattato per prepararsi all'analisi. Un'attenta preparazione del campione è fondamentale nella chimica analitica per generare con precisione un campione standard o sconosciuto per una misurazione chimica. Gli errori nei metodi di chimica analitica sono classificati come casuali o sistematici. Gli errori casuali sono errori dovuti al cambiamento e sono spesso dovuti al rumore nello strumento. Gli errori sistematici sono dovuti a distorsioni dello sperimentatore o strumentali, che introducono un offset nel valore misurato. Gli errori nella preparazione del campione sono errori sistematici, che si propagano attraverso l'analisi, causando incertezza o imprecisioni attraverso curve di calibrazione improprie. Gli errori sistematici possono essere eliminati attraverso una corretta preparazione del campione e un uso corretto dello strumento. Una scarsa preparazione del campione a volte può anche causare danni allo strumento.

Principles

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Per fare una soluzione, si deve considerare la solubilità della sostanza che viene misurata. Il composto di interesse deve dissolversi nel solvente per creare una soluzione. La solubilità è un fattore di interazioni intermolecolari dell'analita con il solvente e spesso può essere manipolata cambiando il tipo di solvente o il pH.

Il primo passo per fare un campione è scegliere la vetreria adeguata e creare una soluzione. La maggior parte dei campioni in fase liquida sono realizzati in palloni volumetrici. I palloni volumetrici sono fatti per contenere un certo volume di liquido ad una data temperatura (normalmente 20 °C) e sono calibrati per essere precisi meno dello 0,02% se si tratta di vetreria di classe A. I palloni volumetrici sono molto più precisi per misurare i liquidi rispetto ai cilindri graduati.

Per creare una soluzione di un solido, il solido deve prima essere accuratamente ammassato con una scala calibrata. Tuttavia, la massa di alcuni reagenti e precipitati può cambiare perché sono igroscopici e assorbono acqua. Se il reagente ha acqua adsorbita è impossibile utilizzare il peso molecolare non idratato per ottenere il corretto numero di nei. Per rimuovere l'acqua adsorbita, i solidi termicamente stabili vengono essiccati in un forno a ~ 110 ° C. I reagenti solidi e i precipitati vengono quindi conservati in un essiccatore contenente un essiccante che assorbe l'acqua presente.

Se il campione da diluire è un liquido, normalmente viene utilizzata una pipetta per misurarlo. Una pipetta di trasferimento in vetro è in genere calibrata per fornire un volume accurato e l'ultima goccia rimane nella pipetta e non deve essere espulsa. Una pipetta di misurazione avrà più marcature su di essa - simile a una buretta - ed è meno accurata ma più versatile di una pipetta di trasferimento. I volumi più piccoli possono essere misurati utilizzando micropipetter variabili, con punte di plastica usa e getta, e questi sono disponibili in volumi da 1 a 5.000 μL. I micropipetteri devono essere calibrati ogni 6 mesi in modo che mantengano la precisione. Se la plastica è un problema, piccole microsiringhe possono anche essere utilizzate per misurare i volumi nella gamma di microlitteri.

Dopo che una soluzione è stata fatta ci sono altri elementi di preparazione del campione che possono essere pertinenti. Qualsiasi campione con solido rimasto nel liquido deve essere filtrato. La filtrazione tradizionale utilizza una configurazione con una carta da filtro che si trova in un imbuto di vetro fritto sopra un pallone filtrante con un braccio dove è possibile tirare il vuoto. Questo tipo di filtraggio viene utilizzato per raccogliere un precipitato in esperimenti come l'analisi gravimetrica. I campioni più piccoli che devono essere analizzati possono essere puliti tramite filtraggio a siringa in cui il campione viene caricato in una siringa e quindi fatto passare attraverso un filtro polimerico con risoluzione fino a 0,2 nm. Inoltre, sono disponibili filtri di centrifuga in cui il campione viene caricato in un tubo di microcentrifuga con un filtro, il tubo viene posto in una centrifuga e il liquido filtrato si trova nella parte inferiore dopo la centrifugazione. I filtri di spin vengono anche utilizzati per concentrare analiti più grandi, come le proteine. I filtri a siringa e spin sono utili per filtrare contaminanti e altri solidi che potrebbero interferire con lo strumento o la misurazione. Il tipo di filtrazione utilizzato dipende dalla quantità di campione e dalla dimensione del solido che deve essere filtrato.

La preparazione del campione può anche comportare l'estrazione o la preconcentrazione di un campione. Quando si studiano gli ioni metallici, la chelazione può essere utilizzata per l'estrazione selettiva. Gli ioni metallici si legano a un agente chelante e quindi il complesso chelato può essere estratto. Gli agenti mascheranti vengono utilizzati prima della chelazione per legare uno specifico ione metallico che non viene poi chelato dall'agente chelante. Una reazione chimica di demascheramento viene utilizzata per rilasciare lo ione metallico specifico in soluzione. Il mascheramento consente una preparazione del campione più specifica e la protezione di alcuni ioni metallici.

La solubilità è la quantità di sostanza che si dissolverà in un liquido. Generalmente, se meno di 0,1 g si dissolvono in 100 ml di solvente, una sostanza è considerata insolubile. La solubilità dipende dalle interazioni intermolecolari con l'analita e quindi, la regola generale della solubilità è "come si dissolve come". Le sostanze polari tendono a dissolversi bene nei solventi polari mentre gli analiti non polari si dissolvono bene nei solventi non polari. La solubilità dei solidi in un liquido è generalmente maggiore a temperature più elevate, a causa dell'energia aggiunta e del movimento molecolare.

La chelazione è realizzata da ligandi multidentati che hanno più siti di legame per una molecola. L'agente chelante più comune per gli ioni metallici è l'acido etilendiammidentetraacetico (EDTA), che è esadentato e si lega attraverso 2 atomi di azoto e 4 atomi di ossigeno. Ha 6 protoni acidi che può perdere con la formazione del complesso metallo-EDTA. La costante di formazione per il legame è specifica del pH e il pH viene spesso regolato per regolare la specificità della reazione di chelazione.

Poiché l'EDTA può essere complesso con molti metalli diversi, è necessario mascherare per eseguire l'analisi di un metallo specifico. Prima dell'aggiunta dell'agente chelante, viene aggiunto un agente mascherante per proteggere lo ione di interesse dalla reazione con l'EDTA. La costante di formazione per il complesso agente mascherante-metallo deve essere maggiore della costante di formazione per il complesso EDTA-metallo in modo che l'EDTA non reagisca. Ad esempio, le maschere al fluoro Al3+ e Fe3+. Il cianuro è un altro agente mascherante comune che non reagisce con Mg2+,Ca2+o Pb2+ ma reagisce con altri metalli come Cd2+,Hg2+,Fe2+,Fe3+eNi+. Il cianuro può formare un gas tossico a basso pH, quindi dovrebbe sempre essere usato in una soluzione superiore a pH 11. Il demasking rilascia lo ione metallico mascherato; ad esempio il cianuro può essere demasked da una reazione chimica con formaldeide. Il mascheramento e il demasking consentono la selettività per la misurazione di componenti di miscele complesse.

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Procedure

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1. Creare una soluzione da un solido

  1. Scegli la vetreria corretta per fare la soluzione.
  2. Pulire accuratamente la vetreria tramite un bagno acido dell'1% HCl o HNO3 insieme al sapone per rimuovere eventuali impurità (avvertenza di sicurezza: con qualsiasi acido forte usare guanti, occhiali e altri dispositivi di protezione individuale appropriati).
  3. Risciacquare più volte la vetreria con acqua distillata. Asciugare in forno se necessario.
  4. Per creare una soluzione da un solido, ammassare la quantità corretta di solido.
  5. Mettere il solido nel matraccio volumetrico e poi riempire circa 3/4 di solvente.
  6. Ruotare per sciogliere completamente il solido prima di riempire completamente il matraccio volumetrico.
  7. Riempire il pallone volumetrico fino alla linea. Il menisco dovrebbe semplicemente toccare la linea di riempimento. Quindi invertire il matraccio più volte con il cappuccio acceso per mescolare ulteriormente, se necessario.

2. Fare una soluzione da un liquido

  1. Scegli la vetreria corretta per fare la soluzione. Per consegnare un liquido utilizzando una pipetta di trasferimento, riempire la pipetta alla linea utilizzando una lampadina a pipetta.
  2. Rilasciare il liquido nel matraccio volumetrico per preparare la soluzione. Non soffiare fuori l'ultima goccia.
  3. Riempire il pallone volumetrico fino alla linea in modo che il menisco tocchi la linea. Mescolare la soluzione invertendo più volte.

3. Filtraggio

  1. Per una configurazione del pallone filtrante, posizionare un pezzo di carta da filtro sul filtro in vetro fritto.
  2. Attaccare il filtro in vetro fritto a un pallone filtrante.
  3. Attaccare un vuoto al braccio del pallone filtrante. Una trappola può anche essere utilizzata per impedire a qualsiasi liquido di entrare nel vuoto.
  4. Accendere il vuoto e versare il campione attraverso la carta da filtro.
  5. Filtrare fino a quando non rimane una polvere secca. Continuare ad asciugare il campione in un forno se si desidera un precipitato secco.
  6. Per il filtro della siringa, aggiungere il campione a una siringa pulita con un'estremità Luer lock.
  7. Avvitare il filtro della siringa nel lucchetto Luer. Spingere lo stantuffo sulla siringa e raccogliere il liquido dopo il filtro.
  8. Per un filtro di centrifuga, pre-risciacquare il filtro con tampone o acqua ultrapura.
  9. Inserire il filtro di centrifuga in un tubo di microcentrifuga.
  10. Caricare il campione sopra il filtro e tappare il tubo.
  11. Mettere il tubo in una centrifuga, assicurandosi di bilanciarlo correttamente con un altro tubo sull'altro lato e centrifugare per 10-30 minuti, a seconda del tipo di filtro di rotazione.
  12. Rimuovere il filtro e il liquido sul fondo è la soluzione filtrata.
  13. Se il campione non può passare attraverso la membrana , come una grande proteina - rimarrà nella parte superiore del filtro. In questo caso, capovolgere il filtro, metterlo in un nuovo tubo e girare di nuovo. Questo produrrà un campione concentrato.

4. Mascheramento e chelatazione

  1. Per mascherare e chelatare, regolare il pH a un valore appropriato in base alle costanti di formazione dell'agente mascherante e dell'agente chelante.
  2. Aggiungere l'agente mascherante alla soluzione e lasciarlo reagire per almeno 10 minuti con lo ione metallico scelto.
  3. Aggiungere il reagente chelante. Per l'EDTA, in genere forma un complesso 1: 1 con lo ione metallico, quindi aggiungi tante moli di EDTA quante ne saranno chelate.
  4. Dopo la chelazione, demask aggiungendo una sostanza chimica che reagirà con lo ione metallico mascherato. La sostanza mascherata può quindi essere analizzata o recuperata per precipitazione.

Una corretta preparazione del campione è un primo passo fondamentale in tutti i tipi di analisi chimiche.

Un'adeguata preparazione del campione è essenziale per ridurre il potenziale di errore. L'errore può essere mitigato in diversi modi: dalla selezione di vetreria adeguata all'attenzione a cifre significative nei calcoli.

Per molti strumenti analitici deve prima essere preparata una soluzione uniforme del campione di interesse. Il processo di dissoluzione – in cui un soluto si dissolve in un solvente – consente la formazione di una soluzione omogenea che può quindi essere ritirata per l'uso in una o più analisi.

Tuttavia, il campione disciolto richiede spesso ulteriori fasi di preparazione prima di essere pronto per l'analisi. Queste tecniche come la filtrazione, l'estrazione o la chelazione possono anche essere eseguite prima dell'analisi.

Questo video dimostrerà alcuni passaggi chiave nella corretta preparazione del campione per il successivo uso chimico.

Gli errori possono essere classificati come sistematici o casuali. Gli errori casuali sono associati a cambiamenti imprevisti, come le condizioni ambientali come il vento.

Gli errori sistematici sono associati a bias dello sperimentatore o dello strumento. Questi errori nella preparazione del campione possono essere evitati assicurando che sia la procedura che i dispositivi, come una bilancia o una pipetta, siano utilizzati correttamente.

Quando si prepara una soluzione campione, la scelta del solvente è importante e può essere basata sui requisiti dello strumento utilizzato. Alcuni strumenti richiedono solventi acquosi mentre altri richiedono solventiorganici. È necessario che il campione si dissolva nel liquido selezionato. La solubilità è un fattore di interazioni intermolecolari dell'analita con il solvente e spesso può essere manipolata modificando il tipo di solvente, la temperatura o il pH.

Una soluzione campione deve avere una concentrazione accurata. Per preparare la soluzione, il campione solido viene pesato su una bilancia analitica anziché su una bilancia di carico dall'alto standard per una maggiore precisione. Se il campione solido è igroscopico e contiene umidità, potrebbe essere necessario asciugarlo in un forno o in un essiccatore prima di pesarlo.

Se il campione è liquido, può essere misurato in peso o volume. Quando si utilizzano misurazioni del volume, assicurarsi di utilizzare un pallone volumetrico poiché è possibile introdurre errori quando si utilizzano altri oggetti di vetro di misurazione come un cilindro volumetrico con grandi graduazioni. In alternativa, è possibile utilizzare una pipetta volumetrica in vetro. Questi sono in genere calibrati per fornire un volume accurato con l'ultima goccia rimanente nella pipetta.

Per preparare la soluzione, il campione accuratamente misurato viene sciolto in un matraccio volumetrico. Inizialmente, utilizzare meno del volume finale di solvente per sciogliere il campione. Dopo aver mescolato aggiungere ulteriore solvente con attenzione per portare la soluzione al suo volume finale.

Dopo aver sciolto la maggior parte del campione nel solvente potrebbero essere ancora presenti solidi che devono essere rimossi prima dell'analisi. Questi solidi indesiderati possono essere rimossi mediante filtrazione per evitare di danneggiare lo strumento.

In alcuni casi, un metallo disciolto deve essere legato a un altro composto – chiamato agente chelante – per essere rilevato. Questo processo è chiamato chelazione. Quando le specie indesiderate si legano anche all'agente chelante, devono essere mascherate.

Questo viene fatto aggiungendo un agente mascherante che inibisce la chelazione di alcuni metalli. Ciò impedisce che i metalli indesiderati vengano rilevati. Il demasking dei composti interferenti può quindi essere eseguito per rilasciare gli ioni metallici e consentire la loro analisi.

Ora che le basi della preparazione del campione sono state delineate, diamo un'occhiata a come viene eseguito in laboratorio.

Per iniziare, selezionare un pallone volumetrico di dimensioni appropriate.

Immergere il matraccio volumetrico e il tappo in acido cloridrico all'1% per rimuovere eventuali cationi adsorbiti. Rimuovere il pallone e il tappo dopo l'immersione durante la notte.

Quindi, lavare il matraccio volumetrico e il tappo con sapone e acqua deionizzata, quindi risciacquare abbondantemente.

Asciugare il matraccio e il tappo in un forno di essiccazione fino a completa asciugatura.

Una volta raffreddato il matraccio, pesare il campione richiesto e aggiungerlo al pallone. Registrare la massa del campione utilizzato.

Aggiungere circa 3/4 del volume di solvente al matraccio, mettere il tappo in posizione e ruotare delicatamente per sciogliere i solidi.

Aggiungere il resto del solvente fino a quando il menisco non tocca il segno di taratura sul matraccio. Tappare il pallone e invertirlo più volte per mescolare accuratamente.

Per rimuovere i solidi non disciolti, caricare il campione in una siringa, posizionare un filtro a siringa sulla punta e premere lo stantuffo per spingere il campione attraverso il filtro. Il campione raccolto è ora completamente preparato e pronto per l'analisi.

Se il campione da analizzare è un liquido piuttosto che un solido, può essere misurato volumetricamente utilizzando una pipetta. Iniziando con un matraccio e un tappo volumetrici puliti, aggiungere un volume appropriato del campione al matraccio e registrare il volume.

Aggiungere il solvente e terminare la preparazione del campione come si fa per i campioni solidi.

Se il campione disciolto richiede chelazione e mascheramento del metallo, ad esempio in un'analisi complessometrica del calcio in presenza di ferro, regolare il campione a un pH appropriato aggiungendo la base.

Aggiungere l'agente mascherante al cianuro per proteggere il ferro dalla chelazione. Lasciare che reagisca per almeno 10 minuti.

Aggiungere EDTA per chelare il calcio e lasciarlo mescolare. Usa abbastanza per formare un complesso 1:1. Il campione è ora pronto per la determinazione del calcio.

Per utilizzare lo stesso campione per l'analisi del ferro, demask il ferro aggiungendo formaldeide e mescolare. Il campione è ora pronto per l'analisi del ferro.

La preparazione del campione è un passo importante in quasi tutti gli esperimenti e i metodi analitici utilizzati dai chimici.

I fusi gassosi industriali possono essere utilizzati come fonte di anidride carbonica per la coltivazione di microalghe. Per capire se la contaminazione da metalli pesanti da parte del gas è un problema, le alghe coltivate in questo esempio sono state analizzate per il contenuto di metalli pesanti.

Dopo il periodo di crescita le alghe sono state raccolte dal fluido del bioreattore mediante centrifugazione e liofilizzazione prima di iniziare il processo di preparazione del campione.

Le alghe essiccate sono state digerite utilizzando calore, acido nitrico e perossido di idrogeno al fine di preparare una soluzione omogenea adatta all'analisi chimica. In questo esempio, il contenuto di metalli pesanti nelle alghe essiccate è stato analizzato utilizzando la spettrometria plasma-massa accoppiata induttivamente o ICP-MS.

La tecnica ha rilevato contemporaneamente 12 metalli nel campione senza interferenze e ha rivelato che i contaminanti metallici dei gas di combustione sono finiti nella biomassa delle alghe.

Una corretta preparazione del campione è importante anche quando si studiano materiali complessi come il suolo utilizzando la spettroscopia di assorbimento atomico.

In questo esperimento, un campione di terreno essiccato è stato prima pesato su una bilancia analitica. È stato quindi aggiunto a un tubo di digestione con acqua 1: 1 e acido nitrico concentrato usando una pipetta.

Dopo diverse fasi di digestione il campione è stato filtrato per rimuovere eventuali solidi, quindi è stato raccolto in un pallone volumetrico. È stata aggiunta acqua aggiuntiva per diluire la soluzione per l'analisi.

I poliesteri lipidici costituiscono i componenti strutturali di parti delle pareti cellulari. Al fine di studiare queste sostanze chimiche utilizzando GC-MS, il tessuto vegetale è stato prima raccolto e pesato.

Dopo varie fasi di lavorazione e asciugatura, è stata aggiunta una miscela 1:1 di toluene ed eptano per sciogliere il campione secco.

Il flaconcino è stato inserito nel vassoio di caricamento automatico di un GC-MS per l'analisi.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla preparazione dei campioni. Ora dovresti capire le basi della preparazione di campioni solidi e liquidi per l'analisi successiva.

Grazie per l'attenzione!

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I filtri di spin sono spesso utilizzati nelle analisi biologiche per ripulire i campioni. Se i detriti cellulari della lisi cellulare sono un problema, il campione può essere filtrato e il filtrato nella parte inferiore sarà privo di particelle. Se si desidera concentrare una proteina o un altro analita più grande, è possibile utilizzare un filtro con una piccola membrana di pori che la proteina non può attraversare. Dopo il filtraggio di spin le molecole più piccole saranno nel filtrato nella parte inferiore e verranno scartate. Quando il filtro viene invertito e filato di nuovo in un altro tubo, può essere rilasciato dal filtro e raccolto in forma concentrata. I filtri a siringa vengono spesso utilizzati per rimuovere particelle di polvere e altre piccole particelle dai campioni di cromatografia, poiché le particelle potrebbero ostruire la colonna e causare problemi con lo strumento.

L'EDTA viene spesso utilizzato per le titolazioni per determinare il contenuto di metallo. Il numero di moli di EDTA aggiunti è uguale al numero di moli di metallo. La chelazione viene anche utilizzata per le estrazioni nell'analisi dei metalli in traccia. Chelatare un metallo neutralizzerà la carica e permetterà di estrarlo in un solvente organico se l'agente chelante ha un gruppo idrofobo. Il mascheramento impedisce a un metallo di essere chelato e quindi di essere estratto. Questo metodo può essere utilizzato per la pulizia del campione o la preconcentrazione di metalli in traccia.

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