בידוד חיידקים צואתיים מדגימות מים על ידי סינון

סינון ממברנה ואת פולחן לאחר מכן של חיידקים שנאספו היא טכניקה שימושית כדי להעריך את האיכות והניקיון של מקור מים.

איכות המים המיועדים לשימוש במסגרות חקלאיות, פנאי או ביתיות היא בעלת חשיבות רבה, בשל הפוטנציאל להתפרצויות של מחלות המועברות במים. אם מים מזוהמים בחומר צואתי מבעלי חיים או מבני אדם, טפילים, חיידקים או וירוסים פתוגניים עשויים להתפשט לפונדקאים חדשים עם בליעתם. ניטור מקורות מים עבור אורגניזמים גורמי מחלות כאלה הוא אפוא קריטי כדי להבטיח את בריאות הציבור.

המספר העצום והמגוון של פתוגנים צואה-אוראליים שעשויים להיות נוכחים במקור מים עושה את זה לא מעשי כדי assay עבור כל באופן עצמאי על בסיס קבוע. במקום זאת, בדיקות מיקרוביולוגיות נפוצות לאיכות המים משתמשות בחיידקי אינדיקטור קוליפורם. לקבלת מידע נוסף אודות תהליך זה, עיין בסרטון של אוסף זה על אורגניזמים מחווינים.

וידאו זה ימחיש את תהליך סינון הממברנה על דגימת מים סביבתית, להדגים כיצד תרבית מספר סוגים של חיידקי אינדיקטור צואה כולל קוליפורמים הכוללים, קוליפורמים צואתיים, ו entercocci צואה, ולתאר כיצד לאמת את נוכחותו של זיהום צואה.

טכניקת סינון הממברנה משתמשת בלחץ שלילי כדי לצייר דגימות מים על פני מסנן ולתפוס חיידקים. המסנן הוא קרום מיוחד עם גודל נקבובית ממוצע מינימלי של 0.45 מיקרומטר המאפשר לכידת חיידקים, אשר בדרך כלל סביב 1 מיקרומטר בגודל. לאחר סינון, הממברנה מוחלת על מדיה צמיחה agarose, ודגרה בתנאים המתאימים לתרבות מיקרואורגניזמים היעד.

טכניקה זו היא אידיאלית ביותר עבור מקורות עכוז נמוך כגון מי שתייה, בריכות שחייה, או אגמים ומאגרים. מים גבוהים בתוכן חומר חלקיקי עלולים לגרום לעבירה או לסתימה של המסנן, ולהגביל את הנפח שניתן לעבד. בנוסף, סינון ממברנה אינו מעשי עבור מקורות מים המכילים מספר רב של רקע, או חיידקים שאינם קוליפורם, כמו ביוב גולמי, שכן זה יכול להגביר את הקושי של חלוקת coliforms היעד על תרבות ודגרה.

לאחר דגימות חיידקים נלכדו במסנן, הם יכולים להיות מועברים לוחות צמיחה כדי לקבוע את סוגי חיידקי אינדיקטור נוכח דגימות המים. ציפוי על סוגי מדיה שונים בוחר לסוגי חיידקים שונים, ויכול לאפשר זיהוי מהיר.

לאחר צמיחה על לוחות ספציפיים לתרבות, אישור נוסף של זהויות חיידקי אינדיקטור יכול להתבצע באמצעות טכניקות כגון לקטוף מושבות למדיה נוזלית ושימוש בצינורות דורהאם כדי ללכוד גזים, אשר צריך להיות מיוצר רק בנוכחות קוליפורמים צואה או קוליפורמים הכוללים. בנוסף, enterococci צואה חשוד יכול להיות מאושר על ידי שילוב של כתמי גרם חיובי, יחד עם בדיקת מי חמצן-קטלאז שלילית.

עכשיו שאנחנו מכירים את העקרונות מאחורי סינון הממברנה של דגימות מים, בואו נסתכל על איך הליך זה מתבצע.

כדי להתחיל את ההליך, תחילה לאסוף דגימות מים ממקורות מים לבדוק של עניין. ודא שהדגימות נאספות בבקבוקי 1-L סטריליים. לאחר השלמת האיסוף, הניחו את הדגימות על קרח והעבירו אותן למעבדה לניתוח מיקרוביאלי.

כדי להתחיל בניתוח, תחילה לעקר סעפת סינון ממברנה. לאחר מכן, חברו את הסעפת למשאבת ואקום ובקבוקון פסולת סינון המכיל אקונומיקה.

אתנול מחטא להבה ומסיר קרום מגולע סטרילי מהאריזה. מניחים את המסנן על מרכז אזור סינון הממברנה של הסעפת, ומחילים משפך מסנן סטרילי על היחידה, ולאחר מכן מאובטח במקום.

למדוד את הנפח הרצוי של מי בדיקה לתוך המשפך. יש למרוח ואקום חלקי כדי לצייר את דגימת הבדיקה דרך המסנן. חומר מוצק מושעה, כולל חיידקים וחומר אורגני אחר, גדול מ 0.45 מיקרומטר יהיה לכוד על או בתוך המסנן, בעוד חלקיקים קטנים יותר, וירוסים, מוצקים מומסים יעברו אם כי לתוך בקבוקון הפסולת המכיל אקונומיקה.

לאחר המדגם עבר דרך המסנן, לשטוף את הפנים של משפך עם 25 מ"ל של מים סטריליים 3 פעמים, ומאפשר לזה לעבור דרך המסנן. כאשר השטיפה הסופית הושלמה, לנתק את הוואקום ולהסיר את המשפך מן הסעפת.

לאחר מכן, אתנול לחטא את המלקחיים ומיד להסיר את מסנן הממברנה מהיחידה. הנח אותו על צלחת הצמיחה המתאימה למיקרואורגניזם היעד באמצעות תנועה מתגלגלת כדי להבטיח מגע מלא עם פני השטח ולהימנע מלכידת בועות אוויר.

לעיבוד של כל דגימה נוספת, לחטא את סעפת נירוסטה ולהשתמש משפך סטרילי כדי למנוע זיהום צולב. לבסוף, מניחים את הצלחות לתוך אינקובטור לתקופת הדגירה המתאימה.

לאחר תקופת הדגירה, להסיר את הצלחות מן האינקובטור לספירה. במידת האפשר, בצע את ספירת המושבה תחת הגדלה של צריכת חשמל נמוכה באמצעות מקור אור לבן קריר. כדי לקבוע קוליפורמים הכוללים, לזהות ולספור מושבות שנראות ורודות עד אדומות כהות בצבע, ויש להן גוון משטח מתכתי המכסה באופן מלא או חלקי את המושבה. מושבות קוליפורם מוחלטות לא טיפוסיות עשויות להיראות אדומות כהות, ריריות או מנוכרות ללא ביהוק.

מושבות שנראות כחולות, לבנות, חסרות צבע או ורודות ללא ברק נחשבות ללא קוליפורמים, ואין לכלול בהן את ספירת הקוליפים הכוללת.

מושבות קוליפורם צואתיות יופיעו כגוונים שונים של כחול, ואלה יש לספור כקטגוריה נפרדת. מושבות קוליפורם שאינן צואתיות הן בדרך כלל אפורות לקרם בצבע, ויש לרשום גם בקטגוריה בודדת. לבסוף, מושבות אנתרוקוצ'י צואתיות ינועו בין ורוד לאדום כהה בצבע ויש לספור בנפרד.

כדי לאמת מושבות קוליפורמיות מוחלטות, יש למרוח לולאת חנק מעוקרת מקוררת על מושבה אחת בעלת עניין. מעבירים את המושבה שנבחרה לכלי זכוכית המכיל ציר טריפטוז לאוריל וצינור דורהאם. לאחר מכן, למקם את התרבויות לתוך אינקובטור. נוכחות של עכוז יחד עם הפקת גז שנתפסה על ידי צינור דורהאם מאמתת את המושבה כקולפורם מוחלט.

לאימות קוליפורם צואתי, מעבירים מושבות בצבע כחול לכלי זכוכית המכילים מדיום EC סטרילי וצינור דורהאם. מניחים את הצינורות המחוסנים לתוך אינקובטור. לאחר הדגירה, מחוסנים עטוריים בשילוב עם הפקת גז לאשר המושבה להיות קוליפורם צואה.

כדי לאשר enterococci צואה, aseptically להעביר מושבות חשודות עם המורפולוגיה הנכונה על המוח-לב עירוי אגר לוחות, ודגרה. לאחר מכן, העבר צמיחה ממושבה מבודדת על BHIA על שתי שקופיות זכוכית סטריליות.

הוסף 2-3 טיפות של 3% מי חמצן לאחת מגלשות הזכוכית. ייצור גז מהיר מצביע על חיידק קטלאז חיובי כגון סיטרובקטריה. חיידקי אנטוקוקי צואה הם קטלאז שליליים; לכן, לא נצפה מבעבע. עבור מושבות קטלס שליליות שאינן מציגות מבעבעות, בצעו כתם גרם. כמו אנתרוקוצ'י צואה, אלה צריכים להיראות חיובי גרם, ביצות בצורה, ולהיות מקובצים בעיקר בזוגות או שרשראות קצרות.

מציאת כל חיידקי אינדיקטור אלה במקור מים מצביעה על נוכחות של זיהום. אם יותר מ -5% מהדגימות נמצאו מזוהמות על פני תקופה של חודש, המקור עשוי להיחשב לא מתאים לצריכה אנושית.

סינון ממברנה משמש בדרך כלל במספר יישומים ביולוגיים, ואורגניזמים אינדיקטור צואה ניתן לזהות גם על ידי הליכים ניסיוניים אחרים. חלק מהיישומים האלה נחקרים כאן.

סינון ממברנה יכול לשמש גם ללכוד וירוס מדגימות מים. כמו וירוסים יהיו בדרך כלל נוכחים ברמות נמוכות מאוד, דגימות מים חייב להיות מרוכז על מנת ללכוד אותם לניתוח. לאחר מכן ניתן לשחרר וירוסים שנתפסו מהמסננים, ולזוהה באמצעות טכניקות כגון תתופעות של הדבקה בתרבית תאים או PCR.

סינון ממברנה משמש גם בייצור של מי טוהר גבוה לשימוש תעשייתי או במעבדה. תעשיות רבות דורשות מים מטוהרים מאוד לתהליכים התפעוליים שלהן, וסינון ממברנה יכול לשמש להסרת מזהמים, כולל מתכות ומלחים מומסים לא רצויים מהמים. זה יכול לשמש גם בהתפלה של מי מלח כדי לייצר מים ראויים לשתייה.

הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לזיהוי אורגניזמים אינדיקטוריים במים על ידי סינון ממברנה. עכשיו אתה צריך להבין איך ממברנה לסנן דגימות מים, איך תרבית כמה סוגים של חיידקי אינדיקטור צואה מן הממברנה, וכיצד לאשר אלה כמו אורגניזמים אינדיקטור. תודה שצפיתם!