물 샘플에서 분변 박테리아 여과 분리

멤브레인 여과 및 수집 된 박테리아의 후속 배양은 수원의 품질과 청결을 평가하는 유용한 기술입니다.

농업, 레크리에이션 또는 국내 설정에 사용 하기 위해 운명 물의 품질 은 매우 중요 한, 물인 질환의 발생에 대 한 잠재력으로 인해. 물이 동물이나 인간에게서 배설물로 오염되는 경우에, 그 때 병원성 기생충, 박테리아, 또는 바이러스는 그들의 섭취에 새로운 호스트로 퍼질 수 있습니다. 따라서 이러한 질병을 유발하는 유기체에 대한 수원을 모니터링하는 것은 공중 보건을 보장하는 데 매우 중요합니다.

수원으로 존재할 수 있는 배설구 병원균의 깎아지른 듯한 수와 다양성은 각각의 독립적으로 그리고 정기적으로 분석하는 것이 비현실적입니다. 대신, 수질에 대한 일반적인 미생물 학적 분석은 대장균 표시기 박테리아를 활용합니다. 이 과정에 대한 자세한 내용은 표시기 유기체에 대한 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.

이 비디오는 환경 물 샘플에 막 여과의 과정을 설명하고, 총 대장균, 대변 대장균 및 대변 성균을 포함한 여러 유형의 배설물 표시기 박테리아를 배양하는 방법을 설명하고 배설물 오염의 존재를 확인하는 방법을 설명합니다.

멤브레인 여과 기술은 부정적인 압력을 사용하여 필터및 트랩 박테리아에 걸쳐 물 샘플을 그립니다. 필터는 0.45 μm의 최소 평균 기공 크기를 가진 특수 멤브레인으로, 일반적으로 약 1 μm 크기의 박테리아를 포획할 수 있습니다. 여과 후, 멤브레인은 아가로즈 성장 배지에 적용되고 대상 미생물을 배양하는 데 적합한 조건에서 배양된다.

이 기술은 식수, 수영장, 호수 및 저수지와 같은 낮은 탁도 공급원에 가장 이상적입니다. 미립자 물질 함량이 높은 물은 필터의 파울링 또는 막힘으로 인해 처리될 수 있는 부피를 제한할 수 있습니다. 또한, 멤브레인 여과는 배양 및 배양시 표적 대장균을 열거하는 어려움을 증가시킬 수 있기 때문에 원시 하수와 같은 많은 수원을 포함하는 수원 또는 비 대장균 박테리아에 실용적이지 않습니다.

일단 세균성 견본이 필터에 갇혀 있으면, 그(것)들은 물 견본에 존재하는 표시기 박테리아의 모형을 결정하기 위하여 성장 판으로 옮겨질 수 있습니다. 다른 미디어 유형에 도금은 다른 세균성 유형을 선택하고, 빠른 식별을 허용 할 수 있습니다.

배양 특정 플레이트에 대한 성장 후, 지표 박테리아 정체성의 추가 확인은 액체 매체로 식민지를 따기와 같은 기술을 사용하여 수행 할 수 있으며, 더럼 튜브를 사용하여 가스를 캡처할 수 있으며, 이는 배설물 대장균 또는 총 대장균의 존재에서만 생성되어야합니다. 또한, 의심되는 대변 장구균은 음의 과산화수소-카탈라제 시험과 함께 양수 그램 염색의 조합에 의해 확인될 수 있다.

이제 우리는 물 샘플의 막 여과 뒤에 원리를 잘 알고, 이 절차가 수행되는 방법을 살펴 보자.

절차를 시작하려면 먼저 관심있는 시험 수원에서 물 샘플을 수집합니다. 멸균 1-L 병에 샘플을 채취하십시오. 수집이 완료되면 샘플을 얼음 에 넣고 미생물 분석을 위해 실험실로 운반하십시오.

분석을 시작하려면 먼저 멤브레인 여과 매니폴드를 살균하십시오. 다음으로, 진공 펌프와 표백제가 들어있는 여과 폐기물 플라스크에 매니폴드를 연결합니다.

에탄올 화염 제거 봉제 봉제 및 포장에서 멸균 격자 멤브레인을 제거합니다. 필터를 매니폴드의 멤브레인 여과 영역 의 중앙에 놓고 멸균 필터 깔때기를 장치에 적용한 다음 제자리에 고정합니다.

원하는 양의 테스트 워터를 깔때기에 측정합니다. 부분 진공을 적용하여 필터를 통해 테스트 샘플을 그립니다. 박테리아 및 기타 유기물을 포함한 정지된 고체 물질은 0.45 μm 이상인 필터 안팎에 갇혀 있으며, 작은 입자, 바이러스 및 용존 고형체는 표백제가 들어있는 폐기물 플라스크에 전달됩니다.

샘플이 필터를 통과 한 후, 멸균 물의 25 mL로 깔때기의 내부를 3 번 헹구어 필터를 통과 할 수 있습니다. 최종 헹구기가 완료되면 진공을 분리하고 매니폴드에서 깔때기를 제거합니다.

다음으로, 에탄올 화염 살균 포셉은 즉시 장치에서 멤브레인 필터를 제거합니다. 압연 동작을 사용하여 대상 미생물에 적합한 성장 판에 놓아 표면과의 완전한 접촉을 보장하고 기포를 포획하지 마십시오.

각 추가 시료의 처리를 위해 스테인레스 스틸 매니폴드를 살균하고 멸균 깔때기를 사용하여 교차 오염을 방지합니다. 마지막으로, 적절한 인큐베이션 기간 동안 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

인큐베이션 기간에 따라 열거하기 위해 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 가능하면 시원한 백색 광원을 사용하여 저전력 배율하에서 콜로니 카운트를 수행하십시오. 총 대장균을 결정하려면 분홍색으로 어두운 빨간색으로 보이는 식민지를 식별하고 계산하고 금속 표면이 식민지를 완전히 또는 부분적으로 덮습니다. 비정형 총 대장균 콜로니는 광택없이 어두운 빨간색, 점막, 또는 핵으로 나타날 수 있습니다.

광택없이 파란색, 흰색, 무색 또는 분홍색으로 나타나는 식민지는 비 대장균으로 간주되며 총 대장균 수에 포함되어서는 안됩니다.

배설물 대장균 콜로니는 다양한 파란색 음영으로 나타나며, 이들은 별도의 범주로 계산되어야합니다. 비 배설물 대장균 콜로니는 일반적으로 회색에서 크림색으로, 또한 개별 범주에 기록되어야 합니다. 마지막으로, 배설물 엔토구치 콜로니는 분홍색에서 어두운 빨간색에 이르기까지 다양하며 별도로 계산해야합니다.

총 대장균 식민지를 확인하려면 소독되고 냉각된 접종 루프를 단일 콜로니콜로 적용합니다. 선택한 식민지를 월계수 트립토제 국물과 더럼 튜브가 들어 있는 유리 용기로 옮는다. 다음으로 문화를 인큐베이터에 넣습니다. 더럼 튜브에 의해 캡처 된 가스 생산과 함께 탁도의 존재는 총 대장균으로 식민지를 확인합니다.

배설물 대장균 검증을 위해, 무균 EC 배지와 더럼 튜브를 포함하는 유리 용기에 색으로 파랑을 무균 적으로 옮기. 접종된 튜브를 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이션 후, 편탁증은 가스 생산과 함께 식민지를 배설물 대장균으로 확인한다.

대변 장구균을 확인하기 위해, 무균뇌 심장 주입 Agar 플레이트에 올바른 형태와 의심 식민지를 전송하고, 인큐베이션. 다음으로, BHIA의 고립된 식민지에서 두 개의 멸균 유리 슬라이드로 성장을 이송합니다.

유리 슬라이드 중 하나에 과산화수소 3 % 2-3 방울을 추가합니다. 급속가스 생산은 시트로박터와같은 카탈라제 양성 박테리아를 나타낸다. 대변 장구균 박테리아는 카탈라아제 음성; 따라서 버블링이 관찰되지 않습니다. 버블블링을 표시하지 않는 카탈라제 네거티브 콜로니의 경우 그램 얼룩을 수행하십시오. 대변 장구균으로, 이들은 그람 양성 나타납니다, 모양에 없는, 쌍 또는 짧은 사슬에 주로 그룹화.

수원에서 이러한 지표 박테리아를 찾는 것은 오염의 존재를 나타냅니다. 샘플의 5% 이상이 1개월 동안 오염된 것으로 밝혀지면, 이 공급원은 인간의 소비에 적합하지 않은 것으로 간주될 수 있다.

막 여과는 일반적으로 다수의 생물학적 응용 분야에서 사용되며, 대변 표시기 유기체는 다른 실험 적 절차에 의해 검출 될 수있다. 이러한 응용 프로그램 중 일부는 여기에서 탐색됩니다.

막 여과는 또한 물 샘플에서 바이러스 포획에 사용할 수 있습니다. 바이러스는 일반적으로 매우 낮은 수준에 존재하기 때문에, 물 샘플은 분석을 위해 그들을 캡처하기 위해 집중해야합니다. 포획된 바이러스는 필터로부터 방출될 수 있고, 세포 배양 감염성 소법 또는 PCR과 같은 기술을 사용하여 식별될 수 있다.

멤브레인 여과는 또한 산업 또는 실험실 사용을 위한 고순도 물의 생산에 활용된다. 많은 산업에서 는 운영 공정을 위해 고도로 정제된 물을 필요로 하며, 멤브레인 여과는 원치 않는 용존 금속과 물에서 소금을 포함한 오염 물질을 제거하는 역할을 할 수 있습니다. 또한 식수를 생산하기 위해 바닷물의 담수화에 사용할 수 있습니다.

막 여과에 의해 물에서 지표 유기체를 식별하는 JoVE의 소개를 방금 지켜보았습니다. 이제 막 필터 물 샘플을 하는 방법, 멤브레인에서 대변 표시기 박테리아의 여러 종류를 배양 하는 방법, 그리고 표시기 유기 체로 이들을 확인 하는 방법. 시청해 주셔서 감사합니다!