Overview
资料来源： 实验室的博士伊恩胡椒和博士查尔斯称-亚利桑那大学
演示作者： 路易莎 Ikner
注定要在农业、 娱乐，和国内的设置中使用的水的质量具有重要的意义，因势而为水性疾病的爆发。微生物制剂卷入这类事件包括寄生虫、 细菌和脱落的病毒在粪便中的受感染的人和动物的高数量。传输到新的和易受影响的主机然后可能通过粪-口途径摄入被污染的水后出现。因此，能够监控水源为病原微生物的存在是为了确保公共卫生重大。
由于数量和各种潜在的粪-口病原体，可能会出现在水和它们变的浓度，它是不切实际和昂贵，直接为每一条进行定期检测。因此，微生物检测方法研究水质监测采用细菌大肠菌群指标。大肠菌群组成、 在第一部分，肠道正常菌群的温血哺乳动物、 具有非致病性的和一贯地排泄的粪便。因此，水中大肠菌群的检测手段，粪便释放发生，和有害病原微生物可能也会出现。
Principles
膜过滤技术用于评估水的微生物质量测定粪便指标细菌。水的数量 (如100 毫升) 通过与 0.45 µ m，协助捕获的细菌，因为他们是大约 1 µ m 的大小最小平均孔径专门的膜过滤器。后过滤，膜是仔细适用于专门的琼脂培养基和培养适当培养目标微生物的条件下。
当用于水质监测中的应用，膜过滤是最理想的低浊度来源饮用水、 游泳池和自然休闲水体如湖泊和水库等。水中颗粒物 （如未经处理的污水） 高将导致污垢的过滤器;因此，只有小卷 (如100ml) 可以进行分析。膜过滤也是不实用的水源与大量的背景 （或非大肠菌群） 细菌，可以增加难度的枚举目标大肠菌群对琼脂糖中等以下孵化的。
该视频演示的饮用水和环境水样收集、 膜过滤的样品，以及列举的几种类型的粪便指标细菌菌落使用专门的琼脂糖增长媒体包括总大肠菌群、 粪大肠菌群和粪肠球菌。为了验证推定殖民地也会显示进一步进行试验。
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Procedure
1.水样本采集和处理
- 从测试水源收集几个 1-L 水样 (如水喷泉、 游泳池、 水库、 配水系统，生食或处理后的污水)，和微生物分析实验室的冰上运输。
- 灭菌或消毒膜过滤多方面的大会之前，使用高压蒸汽灭菌，暴露于紫外线辐射 （2 分钟） 或乙醇火焰点火。
- 冷却时的所有零件，正确连接到真空泵和真空过滤废物瓶含漂白剂的流形。
- 乙醇-火焰消毒一双钳和与他们，从袋中取出一个不育、 网格膜滤器。通常用于膜 0.45 微米孔隙大小直径 47 毫米。然而，交替直径和孔径大小，可规定，孔径大小可以充分诱捕目标 microorganism(s)，并至少 70%的筛选区域组成的孔隙空间。
- 将筛选器放置的中心流形，膜过滤面积和适用于单位的无菌过滤漏斗、 安全到位。
- 测量测试水所需的体积 (如100ml) 并将它添加到漏斗 （100 毫升线标记是在漏斗上可见的）。
- 为了画测试样品通过过滤器应用局部真空 [压差的 34 至 51 kPa （千帕）]。总悬浮固体物质，包括细菌和腐烂的有机物，大于该筛选器的意思是 0.45 微米的孔径大小受困于对该筛选器。更小的粒子，包括病毒和溶解性固体，如少量的有机物质和盐，会通过通过膜和废物容器真空瓶含漂白剂。
- 之后的样品通过筛选器的完整通道，冲洗漏斗与两至三 20-30 毫升容量的无菌水的内部。
- 断电的真空和删除关闭的最后一次漂洗后流形的漏斗。
- 与乙醇火焰消毒钳，立即从设备上卸下滤膜和迅速将其放置到适当增长琼脂糖凝胶介质目标微生物 （表 1列出了每个推荐的增长媒体和孵化条件）。
- 适用于琼脂糖表面与滚式运动，确保膜的生长介质，完全接触，避免卡压征的气泡膜过滤器。
- 用一个无菌的单位之间的每个示例中，处理取代使用的过滤漏斗和乙醇消毒不锈钢流形，防止交叉污染。
2.菌落计数
- 后潜伏期，从孵化器枚举删除生长板。
- 理想情况下，执行在低功率放大使用冷色的白光光源下菌落计数。
- 总大肠菌群
- 大肠菌群细菌总数是通常粉色到深红色的颜色与金属表面的光泽。光泽本身可能部分或完全覆盖殖民地。非典型总大肠菌群菌落形态可能是暗红色，粘液，或有核无光泽。
- 而缺乏光泽是粉色、 蓝色、 白色或无色的殖民地被视为非大肠菌群。
- 粪大肠菌群
- 粪大肠菌群菌落出现各种色调的蓝色。
- Nonfecal 大肠殖民地是奶油色的灰色。
- 粪肠球菌
- 粪肠球菌殖民地范围从粉红到深红的颜色。
3.殖民地核查
- 总大肠菌群
- 存在没有核查，棉签使用无菌的接种环全膜法。为殖民地，它是最好验证至少五个每个的典型及非典型形态。
- 将选定的殖民地转移到含月桂 tryptose 发酵液与达勒姆管玻璃容器。孵育 35±0.5 ° C 48 小时接种的管。浊度指示增长结合气体生产存在验证殖民地作为大肠菌群。
- 粪大肠菌群
- 无菌转入殖民地蓝色的玻璃容器达勒姆管无菌 EC 中等。孵育 44.5 ± 0.2 ° C 24 小时接种的管。浊度指示增长结合气体生产存在验证殖民地为粪大肠菌群。
- 粪肠球菌
- 罢工殖民地典型化粪肠球菌形态分离菌上脑心输液琼脂 (BHIA)，和孵育于 35 ± 0.5 ° C 为 24 到 48 小时。
- 两个预清洗的玻璃幻灯片，增长从孤立的殖民地转移上应用。
- 向准备涂片在幻灯片上添加 3%的双氧水两到三滴。泡沫的迅速出现表示"过氧化氢酶试验阳性"结果，和分离不是粪链球菌细菌。
- 执行一种革兰氏染色分离物检测作为"过氧化氢酶阴性"（观察无气泡）。粪肠球菌是革兰氏阳性菌，卵球形，并且主要在成对或短链出现。
| 粪便细菌指标 | 媒体推荐 （孵化温度、 时间）1 |
| 总大肠菌群 | LES 远藤琼脂 （35 ± 5 ° C，24 小时） M-远藤介质 （35 ± 5 ° C，24 小时） |
| 粪大肠菌群 | m-FC 介质 （44.5 ± 0.2 ° C，24 小时） |
| 粪肠球菌 | 米肠球菌琼脂 （35 ± 0.5 ° C，48 小时） |
表 1。常用生长培养基测定环境样品中的粪便细菌指标
1根据 （美国公共卫生来调停和美国水工程协会，22nd版，2012年）考试的水和废水标准方法的建议
膜过滤和后续培养细菌收集是一个有用的技术评估的质量和清洁的水源。
注定要在农业、 娱乐，或国内的设置中使用的水的质量具有重要的意义，因势而为水性疾病的爆发。如果水与粪便污染问题从动物或人类，然后致病性寄生虫、 细菌或病毒可能传播到新主机上它们的摄入。监测这种引起疾病的生物体的水源因此关键是要确保公共卫生。
数量和种类的水源中可能存在的粪-口病原体是不切实际测定每个独立和定期的基础上。相反，常见微生物化验水质利用细菌大肠菌群指标。有关此过程的详细信息，请参阅上指示生物的此集合的视频。
此视频将说明过程中膜过滤对环境水样，演示如何培养几种类型的细菌粪便指标包括总大肠菌群、 粪大肠菌群和粪 entercocci，并描述如何核实存在的粪便污染。
膜过滤技术利用负压若要绘制水样横过筛选器和陷阱的细菌。筛选器是专门的膜最小平均孔隙大小为 0.45 μ m，可以将捕获的细菌，通常是约 1 微米的大小。后过滤，膜应用于琼脂培养基，并孵化条件下适当培养目标微生物。
这种技术是最理想的低浊源，如饮用水、 游泳池、 或湖泊、 水库。水中颗粒物含量高会导致污染或堵塞的过滤器，可以处理的成交额有所限制。此外，膜过滤是不实用的水源含大量的背景或非大肠菌群细菌，像未经处理的污水，因为这可以增加难度的枚举目标大肠菌群对文化和孵化。
一旦细菌样品被困在筛选器中，他们可以转移到生长板来确定类型的细菌指标目前水样品中。镀上不同的媒体类型选择不同的细菌类型，并可以允许快速鉴定。
后文化具体板上的增长，进一步的指标细菌身份确认可以进行使用摘殖民地成液体介质和使用达勒姆管来捕获气体，只应在粪大肠菌群或总大肠菌群存在生产等技术。此外，怀疑粪肠球菌可以证实的革兰氏染色阳性，以及负面的过氧化氢过氧化氢酶试验的组合。
现在，我们都熟悉膜过滤的水样背后的原则，让我们看看如何进行此过程。
开始执行程序，首先感兴趣的测试水来源收集水样本。确保样品采集在无菌 1 升瓶。一旦收集完成后，把样品放在冰上，运到微生物分析实验室。
要开始分析，第一次消毒膜过滤流形。接下来，连接到真空泵和过滤废物瓶含漂白剂的流形。
乙醇火焰消毒钳，从袋中取出不育的网格膜。将筛选器放置的流形，膜过滤面积中心并将无菌过滤漏斗应用到单位，然后安全到位。
测量出测试水入漏斗所需体积。应用局部的真空装置，使试验样品通过过滤器。悬浮固体物质，包括细菌和其他有机物质，大于 0.45 μ m 将被困或内的筛选器，而更小的颗粒，病毒，和溶解性固体将进入虽然含漂白剂的废瓶。
样品已通过筛选器后，冲洗漏斗的内部用无菌水 25 毫升 3 次，允许这通过筛选。完成最后一次漂洗时，断开真空和删除流形的漏斗。
接下来，乙醇火焰消毒钳，并立即从设备上卸下滤膜。把它放到适当增长板为目标微生物利用滚动运动，确保完整接触的表面，避免捕获气泡。
为每个进一步的样品处理、 消毒不锈钢流形，并使用一个无菌的漏斗，防止交叉污染。最后，在适当的潜伏期进入孵化器放置钢板。
后潜伏期，从孵化器枚举删除板。如果可能的话，执行在低功率放大使用一个很酷的白色光源下菌落计数。若要确定总大肠菌群，识别和计数菌落出现粉红色到呈暗红色，并有完全或部分覆盖殖民地金属表面的光泽。非典型的大肠细菌总数可能出现暗红色，粘液，或有核无光泽。
出现蓝色、 白色、 无色，或粉红色无光泽的殖民地被视为非大肠菌和不应列入总大肠菌群计数。
粪大肠菌群菌落将显示为深浅不一的蓝色，并且这些应算作一个单独的类别。非粪大肠菌群菌落典型灰色到奶油色，而且还应记录在一个单独的类别。最后，粪肠球菌殖民地将范围从粉红到深红的颜色，并应分开计算。
若要验证大肠细菌总数，不适用于灭菌和冷却的接种环感兴趣一单菌落。将所选的殖民地转移到含月桂 tryptose 肉汤和达勒姆管玻璃容器。接下来，放入孵化器的文化。随着天然气产量达勒姆管被俘虏的浊度的存在作为总大肠菌群验证殖民地。
为粪大肠菌群的核查，无菌转入殖民地蓝色的玻璃容器灭菌 EC 培养基和达勒姆管。将接种的管放入孵化器。孵化后混浊的接种与气体一起生产确认的殖民地是粪大肠菌群。
若要确认粪肠球菌，无菌转移疑似的殖民地与脑心浸液琼脂板上正确的形态和孵化。接下来，转移对应用两个无菌玻璃幻灯片从孤立的群体生长。
将 2-3 滴的 3%的双氧水添加到一个玻璃载玻片。气体快速生产指示如柠檬酸的过氧化氢酶阳性细菌。粪肠球菌细菌是过氧化氢酶阴性;因此，观察到不冒泡。对于不显示冒泡的过氧化氢酶阴性殖民地，执行一种革兰氏染色。粪肠球菌，这些应该出现克积极，卵形，以及被分组大多成对或短链。
在水源中找到任何这些细菌指标指示存在的污染。如果超过 5%的样本被发现在一个月内污染，源可能会被视为适宜供人食用。
膜过滤常用的在生物学上的应用，数目和粪便指示生物也可以通过其他实验程序检测。这些应用程序的一些探讨在这里。
膜过滤法也可以用于病毒捕获从水样。由于病毒将通常会出席非常低的水平，水样必须集中以捕获它们以供分析。捕获的病毒然后可以免除了筛选器，并确定使用单元格文化感染力化验或 PCR 等技术。
膜过滤也利用在工业或实验室用高纯水的生产。很多行业的业务过程，需要高度纯净的水和膜过滤可去除污染物，包括有害的溶解态的重金属和水中的盐。它也可以在咸水淡化用来生产饮用水。
你刚看了朱庇特的简介滤膜法确定指标生物在水中。你现在应该明白如何膜滤膜水样品、 如何培养几种类型的粪便指标细菌从膜，以及如何确认这些作为指示生物。谢谢观赏 ！
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Applications and Summary
膜过滤用于病毒捕获和水中的浓度。人类致病病毒带净负电荷在水生的解决方案中，并且存在经常在水源水中的低水平。因此，他们必须集中分析前。膜过滤是一个捕获方法为此目的，但和雇用一个负电荷的筛选器。水样 （如1-L） 感兴趣的修正与盐溶液 (例如.氯化镁) 传授正电荷的病毒，从而促进及其吸附到负电荷的医管局膜过滤器，过滤水。低浓度酸性溶液用于冲洗膜和摆脱多余的盐。低浓度和体积的氢氧化钠然后用于释放病毒从过滤器前进一步的浓度和分析 （例如单元格文化感染力化验或定量聚合酶链反应）。
膜过滤也利用高纯工艺用水的工业生产中。很多行业需要高度纯净的水为其运营流程。膜过滤 （例如纳米过滤） 是用来去除污染物包括溶解态的重金属和从水盐。膜过滤也淡化了的咸水用于生产饮用水。
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