Overview
ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ルイーザ Ikner
運命に農業、レクリエーション、および国内設定で使用する水の品質は、水系伝染病の発生のための潜在性のため非常に重要なのです。このようなイベントに関与する微生物のエージェントには、感染した人や動物の糞便で高い数字の小屋は、ウイルス、細菌、寄生虫があります。新しいと影響を受けやすいホストに転送し、汚染された水の摂取により糞便口頭ルート経由で発生します。したがって、病原性微生物の存在のための水の源を監視する機能は公衆衛生を確保するために重要です。
膨大な数と水と可変濃度に存在する潜在的な糞便口頭病原体の様々 な非現実的であり、定期的にそれらの各 1 つの直接分析に高価です。したがって、微生物学的水質モニタリング法は、大腸菌群の指標細菌を採用しています。大腸菌群構成、温血動物哺乳類の正常腸内細菌叢の部分は、非病原性のあるおよび一貫して糞便中に排泄されます。そのため、糞便のリリースが発生したことと、その有害な病原微生物が存在する場合も水で大腸菌群の検出を意味します。
Principles
膜ろ過技術は、糞便指標細菌の試金の水の微生物学的品質を評価するために使用されます。水の量 (例えば100 mL) 彼らは約 1 μ m サイズ、細菌の捕獲を促進する、0.45 μ m の最小平均孔径の特殊な膜フィルターを通過します。濾過膜は慎重に特化したアガロース培養培地に適用、対象微生物を培養する適切な条件下で培養しました。
水質モニタリングでの使用に適用されると、膜ろ過は飲料水、プール、湖や貯水池などの自然のレクリエーション水など低濁度ソースに最も最適です。粒子状物質 (例えば下水) の高い水は、フィルターの目詰まりになりますしたがって、のみ小さいボリューム (例えば100 mL) 分析することができます。膜ろ過はまた背景 (または非大腸菌群) の数が多い細菌をアガロースゲル中次潜伏に大腸菌ターゲットの列挙の難易度を高めることができると水の源のための実用的ではないです。
このビデオは、飲料水や環境水サンプル集、サンプルの膜ろ過、糞便指標細菌のコロニーを大腸菌群、糞便の大腸菌群、糞便の腸球菌など特殊な agarose 成長媒体を使用してのいくつかの種類の列挙体を示しています。試験は推定植民地も表示されることを確認するために、さらに。
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Procedure
1. 水のサンプルの収集と処理
- いくつかの 1 L の水をテスト水の源から採取 (例えば水噴水、プール、貯水池、配水システム、生または扱われた下水)、微生物分析検査室に氷の移動や。
- 滅菌またはオートクレーブで使用、紫外線放射 (2 分)、またはエタノール炎着火への暴露の前に膜ろ過マニホールド アセンブリをサニタイズします。
- すべての部品の冷却、真空ポンプと真空濾過廃棄物フラスコに漂白剤を含むマニホールドを正しく接続します。
- エタノール炎は彼らと鉗子のペアを殺菌、滅菌、グリッドのメンブレン フィルターをパッケージから取り出します。膜孔径 0.45 μ m の直径 47 mm が通常使用されます。ただし、代替の径、孔径が十分にターゲット糖化をわなに掛ける、フィルター領域の少なくとも 70% は、気孔スペースで構成されています、細孔径を用いることができます。
- マニホールド、膜ろ過面積のセンターの上にフィルターを配置単位に漏斗滅菌フィルターを適用し、所定の位置に固定します。
- 試験水の望ましい量測定 (例えば100 mL)、じょうご (100 mL の線マークは目標到達プロセスの表示) に追加。
- フィルターを通してテスト サンプルを描画するために部分的な真空 [34 に 51 kpa (キロ パスカル) は圧力差] を適用します。合計は固体を中断、細菌を含むと腐敗性有機物、フィルターより大きい意味する孔径 0.45 μ m のフィルターに閉じ込められています。小さい粒子の分解された固体膜を介して漂白剤を含む廃棄物コンテナー真空フラスコに少量の有機物と塩の渡すようとウイルスを含みます。
- 次のフィルターを通してサンプルの完全な通路は、滅菌水の 2 〜 3 20-30 mL の容積と目標到達プロセスの内部をすすいでください。
- 電源オフ、真空、最終すすぎの閉鎖時にマニホールドから漏斗を取り外します。
- エタノール火炎滅菌ピンセットでユニットからメンブラン フィルターをすぐに削除し、速やかに (表 1の各推奨成長メディア ・ インキュベーション条件一覧) ターゲット微生物にとって適切な培アガロースに置きます。
- ロール型動き成長媒体、膜の完全な接触を確保するため、気泡の巻き込みを避けるために agarose 表面に膜フィルターを適用します。
- 使用されるろ過漏斗に置き換えて、各サンプルの処理の間に滅菌ユニット、クロス汚染を防ぐためにステンレス鋼のマニホールドをエタノール消毒します。
2. コロニー列挙
- 潜伏期間は、以下の列挙のためのインキュベーターから成長板を削除します。
- 理想的には、クールで白い光源を用いた低消費電力倍率下でコロニー カウントを実行します。
- 大腸菌群
- 合計大腸菌コロニーは通常ピンク色、金属表面の光沢と色の濃い赤。シーン自体が部分的または完全に植民地をカバーします。非定型の合計大腸菌コロニー形態ダークレッド、粘液、または光沢のない核があります。
- ピンク、青、白、または無色で光沢に欠けている、植民地は、大腸菌群以外と見なされます。
- 糞便の大腸菌群
- 糞便の大腸菌群のコロニーは、青の様々 な色合いを表示されます。
- Nonfecal 大腸菌コロニーにクリーム色で灰色であります。
- 糞便の腸球菌
- 濃い赤い色でピンクの糞便の腸球菌コロニーの範囲です。
3. コロニーの検証
- 大腸菌群
- 在・不在が検証のため綿棒滅菌接種を使用して全体の膜はループします。植民地、少なくとも 5 つそれぞれの典型的な非定型の形態を確認することをお勧めします。
- ラウリル tryptose スープ ダーラム管を入れたガラスの容器に選択したコロニーを転送します。48 h の 35±0.5 ° C で接種のチューブを孵化させなさい。ガスの生産と組み合わせて濁度を示す成長の存在は、大腸菌群として植民地を確認します。
- 糞便の大腸菌群
- ダーラム発酵管を無菌の EC 媒体を含んでいるガラス容器に無菌青色のコロニーを転送します。44.5 ± 0.2 ° C 24 時間で接種のチューブを孵化させなさい。ガスの生産と組み合わせて濁度を示す成長の存在は、糞便の大腸菌群として植民地を確認します。
- 糞便の腸球菌
- ストライク コロニー分離無菌に脳心臓注入寒天培地 (BHIA)、糞便の腸球菌形態の類型化と 35 ± 0.5 ° C、24 〜 48 時間で孵化させなさい。
- 2 あらかじめ洗浄し、ガラス スライド上に隔離されたコロニーから BHIA 上の成長を転送します。
- スライドの準備塗抹標本に 3% 過酸化水素の 2 〜 3 滴を追加します。泡の急速な出現が「カタラーゼ肯定的な」結果を示し、分離は糞便連鎖球菌細菌ではないです。
- (気泡が観察なし)「カタラーゼ否定的な」としてテスト菌株のグラム染色を実行します。糞便の腸球菌はグラム陽性、卵形、ペアまたは短い鎖で表示されます。
| 糞便の細菌インジケーター | 推奨メディア (孵化の温度、時間)1 |
| 大腸菌群 | レ遠藤寒天 (35 ± 5 ° C、24 h) M 遠藤媒体 (35 ± 5 ° C、24 h) |
| 糞便の大腸菌群 | m FC 媒体 (44.5 ± 0.2 ° C、24 h) |
| 糞便の腸球菌 | mエンテロコッカス寒天 (35 ± 0.5 ° C、48 h) |
表 1。環境試料中の糞便細菌指標の検出のための一般的に使用される文化成長媒体
1 試験の水と排水の標準的な方法(アメリカ公衆衛生歯内療法と、米国水道協会、22nd版、2012) によって推薦されるように
膜ろ過細菌収集の後培養、品質と水の源の清浄度を評価するために有用な手法です。
運命に農業、レクリエーション、または国内の設定で使用する水の品質は、水系伝染病の発生のための潜在性のための大きい重要性のです。その後、水が人や動物の糞便で汚染されている場合は、彼らの摂取時に新しいホストに病原性寄生虫、細菌、またはウイルスを広がる可能性があります。このような病気の原因となる有機体のための水の源を監視は公衆衛生を確保するため重要なためです。
膨大な数と様々 な水の源であるかもしれない糞便口頭病原体は、それぞれ独立して定期的に分析には非現実的。代わりに、水質の一般的な微生物学的アッセイは、大腸菌群の指標細菌を使用します。このプロセスの詳細については、指標生物にこのコレクションのビデオを参照してください。
このビデオ環境水サンプルの膜ろ過のプロセスを示すため、糞便指標細菌大腸菌群、糞便の大腸菌群、糞便 entercocci などのいくつかの種類を培養する方法を示し、糞便汚染の有無を確認する方法について説明します。
膜ろ過技術は、フィルターやトラップの細菌間で水サンプルを描画する負圧を利用しています。フィルターは約 1 μ m のサイズでは、通常、細菌のキャプチャができる 0.45 μ m の最小平均孔径の特殊な膜です。濾過後、膜は agarose 成長媒体に適用し、対象微生物を培養する適切な条件で培養しました。
この手法は最も低濁度ソース飲料水、スイミング プール、または湖や貯水池などに最適です。粒子状物含有量の高い水は、汚れや処理できる量を制限するフィルターの目詰まりで起因できます。さらに、膜ろ過はこれは文化とインキュベーション ターゲット大腸菌群を列挙することの難しさを増やすことができます、多数の背景、または未処理下水のような非大腸菌群細菌を含む水源の実用的ではありません。
細菌性のサンプルは、フィルターに閉じ込められている、一度は、水試料中の指標細菌の種類を特定する成長板に転送できます。さまざまなメディア タイプのめっきは細菌の種類の選択し、迅速同定可能します。
文化特定板の成長後さらに指標細菌 id の確認ことができます使用して遂行する液体媒体にコロニーを拾うなど糞便大腸菌または大腸菌群の存在下でのみ生成ガスをキャプチャするダーラム管を使用してのテクニック。また、疑いのある糞便の腸球菌は、グラム陽性、負の過酸化水素がカタラーゼ テストと共にの組み合わせによって確認できます。
今では私たちは水試料の膜ろ過原理に精通しているをこの手順を実行する方法を見てをみましょう。
手順を開始まず関心のテスト水の源から水のサンプルを収集します。滅菌の 1 L ボトルに採血を確認します。コレクションが完了すると、氷の上にサンプルを置くし、微生物分析研究室にそれらを輸送します。
分析するには、まず膜ろ過マニホールドを滅菌します。次に、真空ポンプと漂白剤を含む濾過廃棄物フラスコにマニホールドを接続します。
エタノールは、鉗子を火炎滅菌、包装から滅菌グリッド膜を取り外します。マニホールド、膜ろ過面積のセンターの上にフィルターを配置し、単位に漏斗滅菌フィルターを適用場所で確保します。
漏斗に試験水の要求された体積を測定します。フィルターを通してテスト サンプルを描画する部分的な真空を適用します。中断された固体物質、細菌などの有機物、または中の小さい粒子、ウイルス、フィルター内にトラップされます 0.45 μ m より大きい固体を溶解などは、漂白剤を含む廃棄物のフラスコにも通ります。
サンプルは、フィルターを通過した後、リンス 25 ml の滅菌水漏斗のインテリア 3 回、このフィルターを通過することができます。最終すすぎが完了したら、真空を外しマニホールドから目標到達プロセスを削除します。
次に、エタノールは鉗子を火炎滅菌する、すぐにユニットからメンブラン フィルターを削除します。表面に完全な接触を確保し、空気の泡を引っかけないように回転運動を使用してターゲット微生物の適切な成長プレート上に配置します。
さらに各サンプルの処理、ステンレス鋼のマニホールドをサニタイズし、交差汚染を防ぐために滅菌漏斗を使用します。最後に、適切な潜伏期間のインキュベーターにプレートを配置します。
潜伏期間では、次の列挙のためのインキュベーターからプレートを削除します。可能であれば、クールな白色光源を用いた低消費電力倍率下でコロニー カウントを実行します。大腸菌群を決定するには、識別し、ピンク色で濃い赤に表示され、完全にまたは部分的に植民地を覆う金属表面の光沢のあるコロニーをカウントします。非定型の合計大腸菌コロニーは暗い赤、さきか光沢のない核します。
青、白、無色、または光沢なしピンク表示のコロニー非-大腸菌群と見なされます、大腸菌群数には含めない。
糞便の大腸菌群のコロニーは青の様々 な色合いとして表示されます、これらは別のカテゴリーとしてカウントすべき。非糞便の大腸菌群のコロニーは通常クリーム色、グレー、個々 のカテゴリにも記録する必要があります。最後に、糞便の腸球菌のコロニーは、濃い赤い色でピンクからの範囲し、別々 にカウントする必要があります。
合計大腸菌コロニーを確認するには、興味の単一コロニーを滅菌、冷却された接種ループを適用します。ラウリル tryptose スープ、ダーラム管を入れたガラスの容器に選択したコロニーを転送します。次に、インキュベーターに文化を配置します。ダーラム発酵管によってキャプチャされたガスの生産と共に混濁の存在は、合計大腸菌群として植民地を確認します。
糞便の大腸菌検証のため無菌無菌 EC 培地とダーラム発酵管を含むガラス容器に青色のコロニーを転送します。インキュベーターに接種の管を配置します。インキュベーション後、濁った再接種ガスと共に生産を確認する糞便の大腸菌群のコロニー。
糞便の腸球菌を確認するには、無菌脳心臓注入寒天プレートの上に正しい形態と疑われるコロニーを転送し、孵化させなさい。BHIA 上隔離されたコロニーから 2 つの滅菌ガラス スライド上に成長を転送する次に、します。
ガラスのスライドの 1 つに 3% 過酸化水素の 2 〜 3 滴を追加します。急速なガスの生産は、カタラーゼ陽性菌シトロバクター属などを示します。糞便の腸球菌の細菌はカタラーゼ否定的です;したがって、バブルは認められなかった。バブルを表示しないカタラーゼ陰性コロニー、グラム染色を実行します。糞便の腸球菌としてこれらは、形で、グラム陽性、卵形を表示され、ペアで主にグループ化されたまたは短いチェーンする必要があります。
汚染の存在を示す水の源でこれらの指標細菌のいずれかを見つけること。サンプルの 5% 以上が 1 ヶ月にわたって汚染されている場合、ソースは人間の消費のために不適当考慮されるかもしれない。
膜ろ過、生物学的応用の数で使用され、糞便指標生物は、他の実験の手順によっても検出できます。これらのアプリケーションのいくつかはここで検討されています。
膜濾過は、水試料からのウイルスのキャプチャにも使用できます。ウイルスは通常非常に低いレベルで存在する、水試料は、分析のためにそれらをキャプチャするために集中する必要があります。キャプチャされたウイルス、フィルターから解放されることができるし、細胞培養感染性の試金または PCR などの技術を使用して識別されます。
膜濾過法は、工業用又は理化学用の高純度水の生産にも生かされています。多くの産業、オペレーション ・ プロセスの高純度水を必要とし、膜ろ過は不要な溶存金属と水から塩を含む汚染物質を削除するに役立つことができます。また飲料水を生成する海水の淡水化で使用ことができます。
膜ろ過水の指標生物を識別するゼウスの導入を見てきただけ。今理解しておくべき方法膜フィルター水試料膜から糞便指標細菌のいくつかの種類を培養する方法、指標生物としてこれらを確認する方法。見てくれてありがとう!
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Applications and Summary
膜濾過法は、ウイルスのキャプチャと水から濃度で使用されます。ひと病原性ウイルスは水生のソリューションで純負電荷を運ぶし、水の源の低レベルで存在が多い。そのため彼らは分析の前に集中してあります。膜濾過法はこの目的のため 1 台のキャプチャ方法が、負荷電フィルターを採用しています。水試料 (例えば1 L) 興味は食塩水で改正されて (e.g。 塩化マグネシウム) の水を濾過、これにより負荷電 HA メンブレン フィルターへの吸着を促進するウイルスに正電荷を付与します。低濃度の酸水溶液は、膜を洗浄し、余分な塩を取り除くためです。低濃度と水酸化ナトリウムの量は、それ以上の濃度と分析 (例えば細胞培養感染性アッセイまたは量的な PCR) する前にフィルターからウイルスを解放する使用されます。
膜ろ過は、工業用の高純度水の生産にも生かされています。多くの産業は、オペレーション ・ プロセスの高純度水を必要とします。膜濾過法 (例えばナノろ過) 溶存金属を含む汚染物質を除去するのに役立つし、水から塩します。膜濾過法はまた、飲料水を生成する海水の淡水化で使用されます。
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