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Isolamento de bactérias fecais de amostras de água por filtração
 
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Isolamento de bactérias fecais de amostras de água por filtração

Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner

A qualidade da água destinada ao uso em ambientes agrícolas, recreativos e domésticos é de grande importância devido ao potencial de surtos de doenças transmitidas pela água. Agentes microbianos implicados em tais eventos incluem parasitas, bactérias e vírus que são derramados em alto número nas fezes de pessoas e animais infectados. A transmissão para hospedeiros novos e suscetíveis pode ocorrer através da rota fecal-oral após a ingestão de água contaminada. Portanto, a capacidade de monitorar as fontes de água para a presença de microrganismos patogênicos é significativa para garantir a saúde pública.

Devido ao grande número e variedade de potenciais patógenos fecais-orais que podem estar presentes na água e suas concentrações variáveis, é impraticável e caro ensaio diretamente para cada um deles regularmente. Portanto, os ensaios microbiológicos para monitoramento da qualidade da água empregam bactérias indicadoras de coliformes. Coliformes compreendem, em parte, a microflora intestinal normal de mamíferos de sangue quente, não são patogênicos, e são consistentemente excretados nas fezes. Portanto, a detecção de bactérias coliformes na água significa que ocorreu uma liberação fecal, e que microrganismos patogênicos prejudiciais também podem estar presentes.

Principles

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A técnica de filtragem de membrana é utilizada para avaliar a qualidade microbiológica da água, ensaio para bactérias indicadoras fecais. Uma quantidade de água (por exemplo, 100 mL) é passada através de um filtro de membrana especializado com um tamanho médio mínimo de 0,45 μm, facilitando a captura de bactérias, pois são aproximadamente 1-μm de tamanho. Após a filtragem, a membrana é cuidadosamente aplicada a um meio de cultura agarose especializada, e incubada sob as condições adequadas à cultura dos microrganismos alvo.

Quando aplicada para uso no monitoramento da qualidade da água, a filtragem de membrana é mais ideal para fontes de baixa turbidez, como água potável, piscinas e águas recreativas naturais, como lagos e reservatórios. Águas ricas em material particulado (por exemplo, esgoto bruto) resultarão em incrusção do filtro; portanto, apenas volumes menores (por exemplo, 100 mL) podem ser analisados. A filtragem de membrana também não é prática para fontes de água com grande número de bactérias de fundo (ou não coliformes), o que pode aumentar a dificuldade de enumerar as bactérias coliformes alvo no meio da ágarose após a incubação.

Este vídeo demonstra a coleta de amostras de água potável e água ambiental, a filtragem de membrana das amostras e a enumeração de vários tipos de colônias bacterianas indicadoras fecais utilizando meios de crescimento especializados, incluindo coliformes totais, coliformes fecais e enterococci fecal. Também são mostrados testes realizados para verificar colônias presuntivas.

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Procedure

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1. Coleta e Processamento de Amostras de Água

  1. Coletar várias amostras de água 1-L da fonte de água de teste (por exemplo, fontes de água, piscinas, reservatórios, sistemas de distribuição de água, esgoto bruto ou tratado), e transportar gelo para o laboratório para análise microbiana.
  2. Esterilize ou higienize o conjunto de coletores de filtragem de membrana antes do uso por autoclaving, exposição à radiação UV (2 min) ou ignição por etanol-chama.
  3. Após o resfriamento de todas as peças, conecte corretamente o coletor a uma bomba de vácuo e frasco de resíduo de filtragem de vácuo contendo alvejante.
  4. A chama de etanol esteriliza um par de fórceps e, com eles, remove um filtro de membrana estéril e gridded de sua embalagem. São tipicamente utilizadas membranas de 47 mm de diâmetro com tamanho de poros de 0,45 μm. No entanto, diâmetros alternativos e tamanhos de poros podem ser empregados desde que o tamanho dos poros possa prender suficientemente os microrganismos alvo, e pelo menos 70% da área do filtro é composta por espaço poroso.
  5. Coloque o filtro no centro da área de filtragem da membrana do coletor, e aplique um funil de filtro estéril na unidade e fixá-lo no lugar.
  6. Meça um volume desejado de água de teste (por exemplo, 100 mL) e adicione-a ao funil (uma marca de linha de 100 mL é visível no funil).
  7. Aplique um vácuo parcial [diferencial de pressão de 34 a 51 kPa (kiloPascals)] para desenhar a amostra de ensaio através do filtro. Material sólido total suspenso, incluindo bactérias e matéria orgânica em decomposição, maior do que o tamanho médio do poros do filtro de 0,45 μm estão presos no filtro. Partículas menores, incluindo vírus e sólidos dissolvidos, como pequenas quantidades de matéria orgânica e sais, passarão pela membrana e pelo frasco de vácuo do recipiente de resíduos contendo alvejante.
  8. Após a passagem completa da amostra através do filtro, enxágue o interior do funil com volumes de 20 a 30 mL de água estéril.
  9. Desligo o vácuo e remova o funil do coletor após o fechamento da lavagem final.
  10. Com fórceps esterilizados com chama de etanol, remova imediatamente o filtro de membrana da unidade e coloque-o prontamente no meio de agarose de crescimento adequado para o microrganismo alvo (a Tabela 1 lista as condições recomendadas de mídia de crescimento e incubação para cada um).
  11. Aplique o filtro de membrana na superfície da ágarose com um movimento tipo rolo para garantir o contato completo da membrana com o meio de crescimento e evitar a armadilha das bolhas de ar.
  12. Substitua o funil de filtragem usado por uma unidade estéril entre o processamento de cada amostra e o etanol-higienize o coletor de aço inoxidável, a fim de evitar a contaminação cruzada.

2. Enumeração da Colônia

  1. Após o período de incubação, remova as placas de crescimento da incubadora para enumeração.
  2. Idealmente, realizar a contagem da colônia sob baixa ampliação de energia usando uma fonte de luz branca fria.
  3. Coliformes totais
    1. Colônias coliformes totais são tipicamente rosa a vermelho-escuro na cor com um brilho de superfície metálica. O brilho em si pode cobrir parcial ou completamente a colônia. Morfologias totais de colônia coliformes atípicas podem ser vermelhas, mucoides ou nucleadas sem brilho.
    2. Colônias que são rosa, azul, branca ou incolor enquanto sem brilho são consideradas não coliformes.
  4. Coliformes fecais
    1. Colônias coliformes fecais aparecem como vários tons de azul.
    2. Colônias coliformes não-africanas são cinza para creme na cor.
  5. Enterococci fecal
    1. As colônias de enterococci fecal variam de cor rosa a vermelho escuro.

3. Verificação da Colônia

  1. Coliformes totais
    1. Para uma verificação presença-ausência, cotonete toda a membrana usando um laço inoculante estéril. Para colônias, é preferível verificar pelo menos cinco de morfologias típicas e atípicas.
    2. Transfira a colônia selecionada para um vaso de vidro contendo caldo de lauryl tryptose com um tubo durham. Incubar os tubos inoculados a 35±0,5 °C por 48 h. A presença de turbidez indicando crescimento em conjunto com a produção de gás verifica a colônia como um coliforme.
  2. Coliformes fecais
    1. Transfira colônias de cor azul asepticamente em vasos de vidro contendo meio EC estéril com um tubo durham. Incubar os tubos inoculados a 44,5 ± 0,2 °C por 24 h. A presença de turbidez indicando crescimento em conjunto com a produção de gás verifica a colônia como coliforme fecal.
  3. Enterococci fecal
    1. Colônias de greve tipificando a morfologia de enterococci fecal para isolamento asepticamente no Ágar de Infusão Cérebro-Coração (BHIA), e incubam a 35 ± 0,5 °C por 24 a 48 h.
    2. Transfira o crescimento de uma colônia isolada na BHIA para dois slides de vidro pré-limpos.
    3. Adicione duas a três gotas de peróxido de hidrogênio de 3% para manchas preparadas nos slides. O aparecimento rápido de bolhas indica um resultado "catalase positivo", e o isolado não é uma bactéria estreptococo fecal.
    4. Realize uma mancha gram para testes isolados como "catalase negativo" (sem bolhas observadas). Enterococci fecal são Gram-positivos, vazios, e aparecem principalmente em pares ou cadeias curtas.
Indicador bacteriano fecal Mídia recomendada
(Temperatura de incubação, tempo) 1
Coliformes totais LES Endo Agar (35 ± 5 °C, 24 h)
M-Endo Médio (35 ± 5 °C, 24 h)
Coliformes fecais m-FC Médio (44,5 ± 0,2 °C, 24 h)
Enterococci fecal m Enterococcus Agar (35 ± 0,5 °C, 48 h)

Mesa 1. Mídia de crescimento cultural comumente utilizada para a detecção de indicadores bacterianos fecais em amostras ambientais
1 Conforme recomendado pelos Métodos Padrão para o Exame de Água e Esgoto (American Public Health Asssociation and the American Water Works Association, 22ª Edição, 2012)

A filtragem da membrana e a subsequente cultura de bactérias coletadas é uma técnica útil para avaliar a qualidade e limpeza de uma fonte de água.

A qualidade da água destinada ao uso em ambientes agrícolas, recreativos ou domésticos é de grande importância, devido ao potencial de surtos de doenças transmitidas pela água. Se a água estiver contaminada com matéria fecal de animais ou humanos, então parasitas patogênicos, bactérias ou vírus podem ser espalhados para novos hospedeiros após sua ingestão. O monitoramento das fontes de água para esses organismos causadores de doenças é, portanto, fundamental para garantir a saúde pública.

O número e a variedade de patógenos fecais-orais que podem estar presentes em uma fonte de água torna impraticável o ensaio para cada um de forma independente e regular. Em vez disso, ensaios microbiológicos comuns para a qualidade da água utilizam bactérias indicadoras de coliformes. Para obter mais informações sobre esse processo, consulte o vídeo desta coleção sobre organismos indicadores.

Este vídeo ilustrará o processo de filtragem de membrana em uma amostra de água ambiental, demonstrará como cultivar vários tipos de bactérias indicadoras fecais, incluindo coliformes totais, coliformes fecais e entercocci fecal, e descreverá como verificar a presença de contaminação fecal.

A técnica de filtragem de membrana utiliza pressão negativa para extrair amostras de água através de um filtro e prender bactérias. O filtro é uma membrana especializada com um tamanho médio mínimo de 0,45 μm que permite a captura de bactérias, que normalmente têm cerca de 1 μm de tamanho. Após a filtragem, a membrana é aplicada aos meios de crescimento agarose, e incubada em condições adequadas à cultura dos microrganismos alvo.

Essa técnica é mais ideal para fontes de baixa turbidez, como água potável, piscinas ou lagos e reservatórios. A água rica em conteúdo de material particulado pode resultar em incrusção ou entupimento do filtro, limitando o volume que pode ser processado. Além disso, a filtragem de membrana não é prática para fontes de água que contenham um grande número de bactérias de fundo, ou não coliformes, como o esgoto bruto, pois isso pode aumentar a dificuldade de enumerar coliformes-alvo sobre cultura e incubação.

Uma vez que as amostras bacterianas tenham sido presas no filtro, elas podem ser transferidas para placas de crescimento para determinar os tipos de bactérias indicadoras presentes nas amostras de água. O revestimento em diferentes tipos de mídia seleciona para diferentes tipos bacterianos, e pode permitir uma identificação rápida.

Após o crescimento em placas específicas da cultura, uma confirmação adicional das identidades das bactérias indicadoras pode ser realizada usando técnicas como colher colônias em mídia líquida e usar tubos de Durham para capturar gases, que só devem ser produzidos na presença de coliformes fecais ou coliformes totais. Além disso, a suspeita de enterococci fecal pode ser confirmada por uma combinação de uma coloração gram positiva, juntamente com um teste negativo de peróxido de hidrogênio-catalase.

Agora que estamos familiarizados com os princípios por trás da filtragem de membrana de amostras de água, vamos dar uma olhada em como este procedimento é realizado.

Para iniciar o procedimento, primeiro colete amostras de água de fontes de água de teste. Certifique-se de que as amostras são coletadas em garrafas 1-L estéreis. Uma vez que a coleta esteja completa, coloque as amostras no gelo e transporte-as para o laboratório para análise microbiana.

Para começar a análise, primeiro esterilize um coletor de filtragem de membrana. Em seguida, conecte o coletor a uma bomba de vácuo e frasco de resíduos de filtragem contendo alvejante.

Adoces esterilizadas por etanol e removam uma membrana estéril estéril da embalagem. Coloque o filtro no centro da área de filtragem da membrana do coletor e aplique um funil de filtro estéril na unidade e, em seguida, fixe no lugar.

Meça um volume desejado de água de teste no funil. Aplique um vácuo parcial para desenhar a amostra de ensaio através do filtro. Material sólido suspenso, incluindo bactérias e outras matérias orgânicas, maior que 0,45 μm ficará preso no ou dentro do filtro, enquanto partículas menores, vírus e sólidos dissolvidos passarão para o frasco de resíduos contendo alvejante.

Após a amostra passar pelo filtro, enxágue o interior do funil com 25 mL de água estéril 3 vezes, permitindo que isso passe pelo filtro. Quando a lavagem final estiver completa, desconecte o vácuo e remova o funil do coletor.

Em seguida, o etanol esteriliza as fórceps e remove imediatamente o filtro de membrana da unidade. Coloque-o na placa de crescimento apropriada para o microrganismo alvo usando um movimento de rolagem para garantir o contato completo com a superfície e evitar a captura de bolhas de ar.

Para o processamento de cada outra amostra, higienize o coletor de aço inoxidável e use um funil estéril para evitar contaminação cruzada. Por fim, coloque as placas em uma incubadora para o período de incubação adequado.

Após o período de incubação, remova as placas da incubadora para enumeração. Se possível, realize a contagem da colônia sob ampliação de baixa potência usando uma fonte de luz branca fria. Para determinar coliformes totais, identifique e conte colônias que parecem cor rosa a vermelho escuro, e têm uma superfície metálica cobrindo total ou parcialmente a colônia. Colônias coliformes totais atípicas podem parecer vermelhas, mucoides ou nucleadas sem brilho.

Colônias que parecem azuis, brancas, incolores ou rosas sem brilho são consideradas não coliformes, e não devem ser incluídas na contagem total de coliformes.

Colônias coliformes fecais aparecerão como vários tons de azul, e estas devem ser contadas como uma categoria separada. Colônias coliformes não fecais são tipicamente cinza para creme de cor, e também devem ser registradas em uma categoria individual. Finalmente, as colônias fecais enterococci variam de rosa a vermelho escuro na cor e devem ser contadas separadamente.

Para verificar colônias coliformes totais, aplique um laço inoculante esterilizado e resfriado a uma única colônia de interesse. Transfira a colônia selecionada para um vaso de vidro contendo caldo lauryl tryptose e um tubo durham. Em seguida, coloque as culturas em uma incubadora. A presença de turbidez junto com a produção de gás capturada pelo tubo de Durham verifica a colônia como um coliforme total.

Para verificação de coliformes fecais, transfiticamente transfira colônias de cor azul em vasos de vidro contendo meio EC estéril e um tubo durham. Coloque os tubos inoculados em uma incubadora. Após a incubação, inoculações turvas em conjunto com a produção de gás confirmam que a colônia é um coliforme fecal.

Para confirmar enterococci fecal, transferimos assepticamente colônias suspeitas com a morfologia correta nas placas de Ágar de Infusão Cérebro-Coração, e incubam. Em seguida, transfira o crescimento de uma colônia isolada na BHIA para dois tobogãs de vidro estéreis.

Adicione 2-3 gotas de 3% de peróxido de hidrogênio a uma das lâminas de vidro. A produção rápida de gás indica uma bactéria catalase positiva, como a Citrobacter. Bactérias fecais enterococci são catalase negativa; portanto, não é observado borbulhante. Para colônias catalase-negativas que não exibem borbulhante, realize uma mancha de grama. Como enterococci fecal, estes devem parecer Gram positivo, vazio em forma, e ser agrupados principalmente em pares ou cadeias curtas.

Encontrar qualquer uma dessas bactérias indicadoras em uma fonte de água indica a presença de uma contaminação. Se mais de 5% das amostras forem contaminadas durante um período de um mês, a fonte pode ser considerada imprópria para o consumo humano.

A filtragem da membrana é comumente usada em várias aplicações biológicas, e organismos indicadores fecais também podem ser detectados por outros procedimentos experimentais. Algumas dessas aplicações são exploradas aqui.

A filtragem da membrana também pode ser usada na captura de vírus a partir de amostras de água. Como os vírus normalmente estarão presentes em níveis muito baixos, as amostras de água devem ser concentradas para capturá-las para análise. Vírus capturados podem então ser liberados dos filtros e identificados usando técnicas como ensaios de infectividade da cultura celular ou PCR.

A filtragem de membrana também é utilizada na produção de água de alta pureza para uso industrial ou laboratorial. Muitas indústrias requerem água altamente purificada para seus processos operacionais, e a filtragem de membrana pode servir para remover contaminantes, incluindo metais e sais dissolvidos indesejados da água. Também pode ser usado na dessalinização da água salgada para produzir água potável.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à identificação de organismos indicadores na água por filtragem de membrana. Agora você deve entender como filtrar amostras de água, como cultivar vários tipos de bactérias indicadoras fecais da membrana e como confirmá-las como organismos indicadores. Obrigado por assistir!

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Applications and Summary

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A filtragem da membrana é usada na captura e concentração de vírus da água. Os vírus patogênicos humanos carregam uma carga negativa líquida em soluções aquáticas, e muitas vezes estão presentes em baixos níveis nas fontes de água. Portanto, devem estar concentrados antes da análise. Filtração de membrana é apenas um método de captura para este fim, e emprega um filtro carregado negativamente. As amostras de água (por exemplo, 1-L) de interesse são alteradas com uma solução de sal (por exemplo,cloreto de magnésio) para transmitir uma carga positiva aos vírus, facilitando assim sua adsorção ao filtro de membrana HA carregado negativamente à medida que a água é filtrada. Uma solução de ácido de baixa concentração é usada para enxaguar a membrana e livrá-la do excesso de sais. Uma baixa concentração e volume de hidróxido de sódio é então usado para liberar os vírus do filtro antes de novas concentrações e análises (por exemplo, ensaios de infectidade da cultura celular ou PCR quantitativo).

A filtragem de membrana também é utilizada na produção de água de processo de alta pureza para uso industrial. Muitas indústrias exigem água altamente purificada para seus processos operacionais. A filtragem da membrana (por exemplo, nano-filtração) serve para remover contaminantes, incluindo metais e sais dissolvidos da água. A filtragem da membrana também é usada na dessalinização da água salgada para produzir água potável.

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