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Somministrazione composta IV

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

Ci sono molte vie comunemente usate per la somministrazione di composti in topi e ratti di laboratorio. I protocolli possono, tuttavia, richiedere l'uso delle vie meno comunemente usate: iniezioni intracardiache, footpad e retro-orbitali. La formazione specializzata è essenziale affinché queste procedure vengano eseguite con successo. Potrebbe essere necessario fornire una giustificazione per questi percorsi per ottenere l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).

Principles

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La somministrazione intracardiaca è stata utilizzata in una varietà di applicazioni, tra cui lo sviluppo di un modello animale di metastasi del cancro osseo, nonché un esame degli effetti della consegna intracardiaca diretta sull'esito dell'infarto miocardico. Questa procedura viene spesso eseguita attraverso l'uso di un'ecografia per guidare l'ago nella posizione corretta nel cuore. 2 Tuttavia, se eseguita correttamente utilizzando i punti di riferimento appropriati, questa procedura può essere eseguita senza l'uso della visualizzazione ad ultrasuoni.

A causa della natura invasiva della procedura, l'uso dell'iniezione intracardiaca deve essere scientificamente giustificato in un protocollo IACUC. Deve essere consentita una sola iniezione di sopravvivenza. Questa procedura richiede l'uso di un anestetico generale, inalante o iniettabile, secondo le linee guida stabilite all'interno di un'organizzazione. La selezione dell'ago dovrebbe essere la dimensione più piccola possibile che consentirà la viscosità del materiale iniettato; generalmente, viene utilizzato un ago calibro 27-30. I volumi di iniezione vanno da 100 μL a un massimo di 300 μL.

Le iniezioni endovenose nella coda dei topi sono sia impegnative che spesso infruttuose. Una via alternativa di somministrazione endovenosa è attraverso il plesso retro-orbitale. Mentre questa tecnica richiede allenamento e abilità per eseguire, gli studi hanno dimostrato che c'è un tasso di successo più elevato con l'iniezione retro-orbitale rispetto all'iniezione della vena laterale della coda. 3, 4, 5 L'anestesia è necessaria per impedire al mouse di muoversi durante la procedura. L'anestesia inalante generale erogata tramite un barattolo a campana o una camera di induzione collegata a un vaporizzatore di precisione è efficace. Tuttavia, se verrà utilizzato un inalatore, essere consapevoli del fatto che l'animale inizierà a riprendersi rapidamente una volta rimosso dalla camera, quindi si deve essere pronti per eseguire l'iniezione. Un anestetico oftalmico topico (tetracaina o proparacaina) è raccomandato quando devono essere eseguite iniezioni multiple.

La struttura venosa orbitale del topo e del ratto è diversa. Il topo ha un seno o convergenza di diversi vasi, tra cui la vena sopraorbitale, la vena nasale dorsale, la vena palpebrale inferiore e le vene temporali superficiali che riempiono lo spazio nell'orbita intorno all'occhio. Nell'area orbitale del ratto, c'è una rete o un plesso di vasi. Come per tutte le iniezioni, l'ago selezionato deve essere la dimensione più piccola possibile; generalmente un ago calibro 27-30. Sebbene ci siano state segnalazioni di volumi maggiori, il volume massimo è di 150 μL per occhio. 3, 4, 5 Si raccomanda un'iniezione per occhio, al giorno, con un totale di due iniezioni per occhio per le procedure di sopravvivenza. Inoltre, ci dovrebbe essere almeno un intervallo di un giorno tra le iniezioni. Per una procedura non di somministrare, possono essere somministrati volumi fino a 500 μL.

Nonostante le polemiche, l'uso del foot pad come sito di iniezione è ancora richiesto per alcuni studi. È stato dimostrato che quando iniettato attraverso il cuscinetto del piede, la risposta anticorpale in alcuni ceppi di topo era significativamente più forte rispetto a quando iniettato nel garretto. 6 Tutti gli animali devono essere attentamente monitorati per segni di dolore, livello di consumo di cibo e per la normale deambulazione. L'automutilazione del piede può verificarsi nella misura in cui il piede viene distrutto. Questo è un segno di dolore cronico. Qualsiasi animale che dimostri automutilazione dovrebbe essere immediatamente richiamato all'attenzione del personale veterinario.

Le misurazioni della pedana devono essere eseguite quotidianamente non appena si è verificato un evidente gonfiore. Gli endpoint devono essere in atto secondo le linee guida IACUC. Generalmente, l'animale deve essere eutanasia quando la lesione o il tumore interferisce con la capacità dell'animale di deambulare o raggiungere cibo e acqua. Il volume massimo che può essere iniettato in un footpad è di 50 μL. Per l'iniezione è consigliato un ago calibro 29-30.

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Procedure

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1. Iniezione intracardiaca

  1. Punti di riferimento e posizionamento: posiziona il mouse o il ratto in posizione laterale destra (con il lato sinistro rivolto verso l'alto) o in reclinazione dorsale e identifica i punti di riferimento.
    1. Posizionare il cuore approssimativamente a livello con la punta del gomito e appena a sinistra dello sterno.
    2. Inserire l'ago tra le costole nel punto del gomito.
    3. In un animale in reclinenza dorsale, inserire l'ago nel torace parallelamente al tavolo.
    4. In un animale in posizione reclinale laterale, inserire l'ago nel torace perpendicolarmente al tavolo.
  2. Iniezione dell'articolo
    1. Assicurarsi che ci sia un movimento minimo dell'ago una volta inserito nel cuore per evitare che il muscolo venga strappato e causi sanguinamento nel sacco pericardico, poiché ciò compromette la funzione cardiaca.
    2. Aspirare la siringa per determinare il corretto posizionamento. C'è spesso un lampo di sangue nel mozzo della siringa.
    3. Tenere la siringa in modo che la mano non venga riposizionata sulla siringa per iniezione una volta che l'ago è stato posizionato nel cuore.
    4. Iniettare l'articolo in modo lento e costante.
    5. Prelevare lentamente l'ago per ridurre al minimo il sanguinamento.
    6. I topi che soffrono di difficoltà respiratoria, convulsioni, cianosi, atassia prolungata o altre sequele correlate al trauma da iniezione devono essere valutati dal personale veterinario ed eutanasizzati secondo la loro raccomandazione.

Figure 1
Figura 1. Iniezione intracardiaca nei topi.

2. Iniezione endovenosa utilizzando il plesso retro-orbitale

  1. Punti di riferimento e posizionamento dell'iniezione
    1. Posizionare l'animale su una superficie piana in posizione laterale.
    2. Inserire l'ago nel canthus mediale dell'occhio con un angolo di 45° rispetto al naso.
    3. La profondità dell'ago deve essere sufficiente per penetrare nei tessuti congiuntivali e avanzare dietro l'orbita oculare e nel plesso oculare. Quando si posiziona l'ago, non dovrebbe incontrare l'osso nella parte posteriore dell'orbita.
    4. Posiziona l'indice sulla parte superiore della testa con il pollice sulla mascella.
    5. Tirare delicatamente indietro e verso il basso per stringere la pelle e sporgere il bulbo oculare.
    6. Fare attenzione a non esercitare pressione sulla trachea e limitare il flusso d'aria.
  2. Iniezione
    1. Posizionare l'ago dietro l'occhio e non per via intraoculare.
    2. Assicurarsi che l'ago abbia un movimento minimo una volta inserito nel plesso retro-orbitale, o i vasi si rompono causando sanguinamento e perdita dell'agente nei tessuti dietro l'occhio. Tenere la siringa in modo che la mano non venga riposizionata sulla siringa per iniezione una volta che l'ago è stato posizionato nel plesso retro-orbitale.
    3. Non aspirare con la siringa, poiché collasserà i vasi.
    4. Iniettare l'articolo in modo lento e costante.
    5. Prelevare l'ago e applicare una leggera pressione sull'occhio per controllare il sanguinamento e fornire emostasi.
    6. I topi che soffrono di gonfiore, congiuntivite o altre sequele correlate al trauma da iniezione devono essere valutati dal personale veterinario e trattati o eutanasizzati secondo la loro raccomandazione

Figure 2
Figura 2. Iniezione orbitale retrò nei topi.

3. Iniezione di footpad

  1. Per la moderazione, metti l'animale in un tubo di ritenuta con un piede posteriore isolato ed estendi afferrando la pelle sopra il soffocamento.
  2. Pulire il piede con acqua o alcool per rimuovere i detriti prima dell'iniezione.
  3. Iniettare per via sottocutanea nel centro del piede posteriore formando una piccola bleb nel sito di iniezione. Per evitare il vaso sanguigno che corre per tutta la lunghezza del piede, iniettare appena fuori dalla linea mediana parallela alla nave.

Figure 3
Figura 3. Iniezione di footpad in topi e ratti.

Intracardiaco, retro orbitale e footpad sono alcuni dei metodi di iniezione specializzati che i ricercatori biomedici utilizzano per esperimenti che richiedono la consegna di composti attraverso queste vie atipiche.

Un'iniezione intracardiaca fornisce il composto nel ventricolo sinistro consentendo alla sostanza di entrare direttamente nella circolazione arteriosa. La via orbitale retrò è un'alternativa all'iniezione della vena della coda e viene utilizzata per consegnare il composto nella circolazione venosa. E un'iniezione di footpad comporta la somministrazione sottocutanea dell'articolo nel piede posteriore dell'animale. Questo video illustrerà le considerazioni, le procedure e le applicazioni di queste speciali tecniche di iniezione.

Iniziamo con alcune informazioni di base e cose che si dovrebbero considerare prima di iniziare queste procedure di amministrazione.

La somministrazione intracardiaca viene spesso effettuata attraverso l'uso di un'ecografia per guidare l'ago nella posizione corretta nel cuore. Tuttavia, se eseguita correttamente utilizzando i punti di riferimento appropriati, l'amministrazione può essere eseguita senza l'uso della visualizzazione ad ultrasuoni. Si noti che la procedura richiede l'uso di un anestetico generale e solo un'iniezione per animale è consentita per le procedure di sopravvivenza. Generalmente per questa iniezione viene utilizzato un ago calibro 27-30 e il volume massimo di somministrazione è di 100 e 300 microlitri per topi e ratti, rispettivamente.

Per l'iniezione endovenosa attraverso la via retro-orbitale, si dovrebbe avere una buona comprensione della struttura venosa orbitale. Un topo ha un seno in cui convergono diverse vene, vale a dire il sopraorbitale, il nasale dorsale, il palpebrale inferiore e il temporale superficiale. Mentre nei ratti, c'è una rete o plesso di diverse vene. L'iniezione viene eseguita direttamente nel seno o nel plesso. Come l'intracardiaco, questa procedura richiede anche l'uso di anestesia generale e si raccomanda solo un'iniezione per occhio al giorno con un totale di due iniezioni per occhio per le procedure di sopravvivenza. Come per tutte le iniezioni, deve essere selezionato l'ago di dimensioni più piccole, generalmente calibro 27-30, e il volume massimo raccomandato è di 150 μL per occhio.

Nonostante le polemiche, l'uso dell'iniezione di footpad è ancora richiesto per alcuni studi, tipicamente legati all'infiammazione e alla crescita del tumore. Si noti che le iniezioni possono essere eseguite solo su un piede, mai lateralmente. E le misurazioni del footpad dovrebbero essere fatte ogni giorno non appena si è verificato un evidente gonfiore. Per l'iniezione è consigliato un ago calibro 29-30 e il volume massimo raccomandato è di 50 μL. Dopo qualsiasi iniezione, tutti gli animali devono essere attentamente monitorati per segni di dolore, livello di consumo di cibo e per la normale deambulazione. Generalmente l'animale deve essere eutanasia quando la lesione o il tumore interferisce con la capacità dell'animale di deambulare o raggiungere il cibo e l'acqua.

Ora impariamo le procedure di iniezione, a partire dall'iniezione intracardiaca. Dimostreremo la procedura in un topo, ma i punti di riferimento e il protocollo per un ratto sono simili.

Il primo passo è preparare la siringa. Ricordiamo che un ago calibro 29 e una siringa da 1 cc sono appropriati per i topi. E il volume massimo per l'iniezione intracardiaca è di 100 microlitri. Quando si disegna la soluzione, lasciare una piccola quantità di aria tra lo stantuffo e il materiale di iniezione. Questo per consentire al sangue di entrare nella siringa mentre viene inserito nel cuore.

Per iniziare, anestetizzare l'animale usando anestetici inalanti o iniettabili. Rivedi le considerazioni per il mantenimento dell'anestesia generale in un altro video di questa raccolta. Quindi, posizionare l'animale in posizione di reclinata dorsale su una piattaforma isolata. Quindi, fissare gli arti anteriori alla piattaforma e posizionare un pezzo di nastro orizzontalmente attraverso l'addome sopra i fianchi. Questo per stabilizzare ulteriormente l'animale ed evitare qualsiasi movimento una volta inserito l'ago. Successivamente, usando un tampone, bagnare il petto dell'animale con il 70% di alcol.

Per individuare il sito di iniezione, individuare prima lo xifoide e il manubrio sterno. Quindi, trova il punto intermedio tra i due punti di riferimento. 1-2 mm a sinistra di questo punto, è il punto di riferimento per l'inserimento dell'ago. Utilizzando un applicatore con punta di cotone, applicare lo iodio povidone per contrassegnare il sito di inserimento dell'ago.

Per iniettare, dirigere l'ago perpendicolarmente al tavolo e inserirlo alla profondità di circa 2 mm. Quindi, applicare una leggera contropressione allo stantuffo. Un sangue rosso vivo ossigenato dovrebbe entrare nel mozzo della siringa, che conferma il corretto posizionamento. Tenere la siringa nello stesso punto e iniettare il materiale lentamente e costantemente nel corso di 30-60 secondi. L'iniezione rapida può provocare l'aggregazione delle cellule e l'intasamento delle arterie, uno shock al sistema dovuto alla temperatura della sostanza significativamente inferiore alla temperatura corporea o un'espansione del ventricolo e un'interruzione del ritmo cardiaco.

Una volta che il materiale ha eliminato la siringa, rimuovere lentamente e con attenzione l'ago senza alcun movimento laterale in quanto ciò può danneggiare i muscoli cardiaci. Quindi rilasciare immediatamente il nastro dalle zampe anteriori e dall'addome e posizionare l'animale in posizione prona in una gabbia pulita con lettiera sufficientemente profonda da fungere da strato isolante. Si noti che metà di questa gabbia di recupero si trova su una fonte di riscaldamento e l'animale anestetizzato si trova sul lato riscaldato della gabbia. Ciò previene l'ipotermia e, man mano che l'animale si riprende dall'anestesia, sarà in grado di spostarsi dal lato riscaldato come desiderato.

Successivamente, impariamo il metodo per l'iniezione endovenosa utilizzando il plesso retro-orbitale nei ratti. Ancora una volta, dimostreremo la procedura su un mouse, ma i punti di riferimento e il protocollo per i ratti sono simili.

Attaccare l'ago appropriato alla siringa selezionata e riempire il materiale di iniezione. Ricorda, generalmente si userebbe un ago calibro 27-30 con la siringa più piccola possibile e un volume massimo di 150 microlitri.

Per iniziare la procedura, prima anestetizzare l'animale. Quindi, posizionarlo su una superficie piana in posizione di reclina laterale. Ora posiziona il dito indice sulla parte superiore della testa e il pollice sulla mascella e tira delicatamente indietro e verso il basso. Questo per stringere la pelle e sporgere il bulbo oculare. Fare attenzione a non esercitare pressione sulla trachea e limitare il flusso d'aria. Se si pianificano iniezioni multiple, applicare anestetico oftalmico topico, come tetracaina o proparacaina.

Inserire l'ago nel canthus mediale dell'occhio con un angolo di 45° rispetto al naso. La profondità deve essere sufficiente per penetrare nei tessuti congiuntivali e avanzare nell'orbita oculare e nel seno. Non dovrebbe incontrare l'osso nella parte posteriore dell'orbita. Per evitare la rottura dei vasi sanguigni, assicurarsi che l'ago abbia un movimento minimo una volta inserito. Non aspirare, in quanto ciò farà collassare le navi. Iniettare l'articolo in modo lento e costante. Quindi, prelevare delicatamente l'ago e applicare una leggera pressione sull'occhio per controllare il sanguinamento e fornire emostasi.

Infine, esaminiamo il metodo di iniezione della pedana nei topi e nei ratti. Per iniziare, attaccare l'ago appropriato e riempire la siringa con il volume corretto. Questa procedura può essere eseguita in animali coscienti.

Metti l'animale in un tubo di contenimento con un piede posteriore isolato ed esteso afferrando la pelle sopra il soffocamento. Pulire il piede con acqua o alcool per rimuovere i detriti prima dell'iniezione. Per evitare il vaso sanguigno che corre per tutta la lunghezza del piede, il punto di riferimento dell'iniezione è al centro, ma appena fuori dalla linea mediana, più vicino alle dita dei piedi.

Posizionare la smussatura dell'ago nel sito di iniezione dirigendolo verso il tallone. Iniettare l'articolo lentamente e costantemente per evitare una rapida distensione dei tessuti del piede. Ciò causerà il gonfiamento del footpad mentre il materiale di iniezione riempie lo spazio sottocutaneo. Sul piede di un piccolo animale il gonfiore dell'iniezione può estendersi al tallone, mentre in un animale più grande sarà più localizzato.

Dopo l'iniezione, osservare quotidianamente gli animali e se è presente gonfiore persistente o se ci sono lesioni o tumori a seguito del protocollo sperimentale, quindi, utilizzando una pinza, eseguire la misurazione del footpad. Questo strumento misura lo spessore del piede in millimetri e aiuta nella quantificazione del gonfiore.

Ora discutiamo alcuni esperimenti di esempio che utilizzano iniezioni intracardiache, orbitali retrò e footpad.

Una delle molte applicazioni della somministrazione intracardiaca è lo sviluppo di un modello animale di metastasi tumorali. Qui, i ricercatori hanno usato questo percorso per iniettare cellule tumorali che possiedono propensione alla colonizzazione ossea. Nei giorni seguenti, hanno studiato la crescita del tumore nelle ossa usando tecniche di imaging a raggi X e fluorescenza. In un altro studio, la via orbitale retrò è stata utilizzata per iniettare anticorpi specifici che etichettano i neutrofili. Quindi, con l'aiuto dell'imaging intravitale, gli scienziati sono stati in grado di tracciare il modello di migrazione delle cellule etichettate.

Infine, i ricercatori usano spesso l'iniezione di footpad per analizzare la risposta infiammatoria. In questo esperimento, i ricercatori hanno isolato le cellule mononucleate del sangue periferico da campioni di sangue umano, le hanno mescolate con diversi antigeni di prova e hanno iniettato le soluzioni nella pedana dell'animale. Infine, hanno eseguito misurazioni del piede per quantificare la risposta al gonfiore dovuta a diversi antigeni.

Hai appena visto l'ultima puntata di JoVE sulle solite e specializzate tecniche di amministrazione composta.

Giusto per ricapitolare, nella prima parte abbiamo esaminato la via parenterale più comune. Nel secondo capitolo, abbiamo discusso le procedure enterali e topiche. La terza puntata ha affrontato la prima serie di procedure atipiche come intradermica, intranasale e intracranica nei neonati. Infine, qui abbiamo discusso tre percorsi aggiuntivi che i ricercatori biomedici utilizzano nei laboratori per scopi specifici.

Dopo aver visto questa serie dovresti avere una comprensione molto migliore delle diverse tecniche di somministrazione e dovresti anche conoscere le considerazioni generali e specifiche relative a questi protocolli di somministrazione composta Come sempre, grazie per aver guardato!

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Applications and Summary

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La somministrazione di composti negli animali può avere un effetto significativo sia sul benessere dell'animale che sull'esito dei dati sperimentali e sul valore scientifico. Il corretto metodo di consegna è essenziale per il successo dell'esperimento. Molti fattori devono essere considerati per determinare la via migliore, tra cui l'obiettivo scientifico dello studio, il pH della sostanza, il volume di dosaggio richiesto, la viscosità della sostanza e il benessere degli animali. La competenza tecnica è anche un requisito per tutti i metodi di iniezione.

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References

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Transcript

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