Overview
מקור: קיי סטיוארט, RVT, RLATG, CMAR; ואלרי א. שרודר, אר.די.ג'י, אר-אל-ג'י. אוניברסיטת נוטרדאם, IN
ישנם מסלולים נפוצים רבים לניהול מורכב בעכברים במעבדה וחולדות. פרוטוקולים עשויים, עם זאת, לדרוש את השימוש במסלולים פחות נפוצים: תוך לב, footpad, וזריקות רטרו-מסלולית. הכשרה מיוחדת חיונית להליכים אלה להתבצע בהצלחה. ייתכן שיהיה צורך בהצדקה למסלולים אלה כדי לקבל אישור של ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC).
Principles
ניהול תוך-לב שימש במגוון יישומים, כולל פיתוח מודל בעלי חיים של גרורות סרטן העצם, כמו גם בדיקה של ההשפעות של לידה תוך-לבבית ישירה על התוצאה של אוטם שריר הלב. הליך זה נעשה לעתים קרובות באמצעות אולטרסאונד כדי להנחות את המחט למיקום הנכון בלב. 2 עם זאת, כאשר מבוצע כראוי ניצול נכון של ציוני דרך נכונה, הליך זה יכול להתבצע ללא שימוש ויזואליזציה אולטרסאונד.
בשל האופי החדיר של ההליך, השימוש בהזרקה תוך-לבבית חייב להיות מוצדק מדעית בפרוטוקול IACUC. רק זריקת הישרדות אחת צריכה להיות מותרת. הליך זה מחייב שימוש בהרדמה כללית, משאיפה או להזרקה, בהתאם להנחיות שנקבעו בתוך הארגון. בחירת מחט צריך להיות הגודל הקטן ביותר האפשרי שיאפשר את הצמיגות של החומר מוזרק; בדרך כלל, מחט 27-30 מד משמש. נפחי הזרקה נעים בין 100 μL למקסימום של 300 μL.
זריקות תוך ורידי בזנב של עכברים הן מאתגרות ולעתים קרובות לא מוצלחות. מסלול חלופי של ניהול תוך ורידי הוא דרך מקלעת רטרו-מסלולית. בעוד טכניקה זו מחייבת אימון ומיומנות לבצע, מחקרים הראו כי יש שיעור הצלחה גבוה יותר עם הזרקת רטרו-מסלולית מאשר עם הזרקת וריד זנב לרוחב. 3, 4, 5 הרדמה נדרשת כדי למנוע מהעכבר לזוז במהלך ההליך. הרדמה משאיפה כללית המועברת באמצעות צנצנת פעמון או תא אינדוקציה המחובר לאידוי מדויק יעילה. עם זאת, אם ייעשה שימוש במשאף, שימו לב כי החיה תתחיל להתאושש במהירות ברגע שהיא תוסר מהתא, ולכן יש להיות מוכנים לבצע את ההזרקה. הרדמה אופטלמית אקטואלית (טטרקאין או פרופראקאין) מומלצת כאשר יש לבצע זריקות מרובות.
המבנה ורידי מסלולית של העכבר והחולדה שונים. לעכבר יש סינוס או התכנסות של מספר כלי שיט, כולל הווריד העל-עורי, וריד האף הגבי, הווריד הפלפבריאלי הנחות, והוורידים הטמפורליים השטחיים הממלאים את החלל במסלול סביב העין. באזור מסלול החולדה, יש רשת או מקלעת של כלי שיט. כמו עם כל הזריקות, המחט שנבחרה צריכה להיות בגודל הקטן ביותר האפשרי; בדרך כלל מחט 27-30 מד. למרות שהיו דיווחים על אמצעי אחסון גדולים יותר, הנפח המרבי הוא 150 μL לעין. 3, 4, 5 זריקה אחת לכל עין, ליום, מומלץ, עם סך של שתי זריקות לכל עין עבור הליכי הישרדות. כמו כן, צריך להיות לפחות מרווח של יום אחד בין זריקות. עבור הליך לאurvivival, אמצעי אחסון עד 500 μL יכול להינתן.
למרות המחלוקת, השימוש כרית כף הרגל כאתר הזרקה עדיין נדרש עבור כמה מחקרים. הוכח כי כאשר מוזרק דרך כרית הרגל, תגובת הנוגדנים בזני עכבר מסוימים הייתה חזקה משמעותית מאשר כאשר מוזרק לתוך למשכן. 6 כל בעלי החיים חייבים להיות במעקב צמוד לסימני כאב, רמת צריכת מזון, ועל אמביציה נורמלית. השחתה עצמית של כף הרגל יכולה להתרחש במידה של כף הרגל נהרסת. זה סימן לכאב כרוני. כל בעל חיים המפגין השחתה עצמית צריך להיקרא מיד לידיעת הצוות הווטרינרי.
מדידות Footpad צריך להיעשות מדי יום ברגע נפיחות ברורה התרחשה. נקודות הקצה חייבות להיות במקומן בהתאם להנחיות IACUC. בדרך כלל, החיה חייבת להיות מורדמת כאשר הנגע או הגידול מפריע ליכולתו של בעל החיים לטבול או להגיע למזון ומים. אמצעי האחסון המרבי שניתן להזריק למשטח רגליים הוא 50 μL. מחט 29-30 מד מומלץ עבור הזרקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הזרקת תוך לב
- ציוני דרך ומיצוב: מקם את העכבר או החולדה בנסיגה רוחבית ימנית (כאשר הצד השמאלי פונה כלפי מעלה) או בנסיגה הגבית, וזיהה את ציוני הדרך.
- מקם את הלב בערך ברמה עם נקודת המרפק ובדיוק משמאל בעצם החזה.
- הכנס את המחט בין הצלעות בנקודת המרפק.
- בחיה בנסיגה הגבית, הכנס את המחט לחזה במקביל לשולחן.
- בחיה בנסיגה לרוחב, הכנס את המחט לתוך החזה בניצב לשולחן.
- הזרקת המאמר
- ודא שיש תנועה מינימלית של המחט ברגע שהוא מוכנס לתוך הלב כדי למנוע את השריר מלהיות קרוע ולגרום לדימום לתוך שק קרום הלב, כמו זה פוגע בתפקוד הלב.
- שאפו את המזרק כדי לקבוע מיקום נכון. לעתים קרובות יש הבזק של דם לתוך הרכזת של המזרק.
- החזק את המזרק כך היד לא ממוקמת מחדש על המזרק להזרקה לאחר המחט כבר ממוקם בלב.
- הזריקו את המאמר בצורה איטית ויציבה.
- למשוך את המחט לאט כדי למזער את הדימום.
- עכברים שחווים מצוקה נשימתית, התקף, כיחלון, אטקסיה ממושכת או המשך אחר הקשור לטראומה בהזרקה חייבים להיות מוערכים על ידי הצוות הווטרינרי ולה מורדם על פי המלצתם.
איור 1. הזרקת תוך לב בעכברים.
2. הזרקה תוך ורידי תוך ורידי תוך שימוש מקלעת רטרו-מסלולית
- ציוני דרך ומיצוב הזרקה
- מניחים את החיה על משטח שטוח בנסיגה לרוחב.
- הכנס את המחט לתוך הקנתוס המהודל של העין בזווית של 45° לאף.
- עומק המחט חייב להיות מספיק כדי לחדור את רקמות הלחמית ולקדם מאחורי מסלול העין לתוך מקלעת העין. בעת הצבת המחט, זה לא צריך להיתקל העצם בחלק האחורי של המסלול.
- הנח את האצבע המורה על החלק העליון של הראש עם האגודל על הלסת.
- יש למשוך בעדינות אחורה ולמטה כדי להדק את העור ולבלט את גלגל העין.
- יש להחריד לא להפעיל לחץ על קנה הנשימה ולהגביל את זרימת האוויר.
- זריקה
- מניחים את המחט מאחורי העין ולא תוך עינית.
- ודא כי המחט יש תנועה מינימלית פעם מוכנס לתוך מקלעת רטרו-מסלולית, או כלי השיט יהיה לקרוע גרימת דימום ואובדן של הסוכן לתוך הרקמות מאחורי העין. החזק את המזרק כך היד לא ממוקמת מחדש על המזרק להזרקה לאחר המחט כבר ממוקם מקלעת רטרו-מסלולית.
- אל תשאף עם המזרק, כפי שאתה תמוטט את כלי הדם.
- הזריקו את המאמר בצורה איטית ויציבה.
- למשוך את המחט ולהפעיל לחץ אור על העין כדי לשלוט דימום כדי לספק hemostasis.
- עכברים שחווים נפיחות, דלקת הלחמית או המשך אחר הקשור לטראומה בהזרקה חייבים להיות מוערכים על ידי הצוות הווטרינרי ומטופלים או מורדם על פי המלצתם
איור 2. הזרקת מסלול רטרו בעכברים.
3. הזרקת משטח רגליים
- לאיפוק, מניחים את החיה בצינור איפוק עם רגל אחורית אחת מבודדת, ומתארכים על ידי אחיזת העור מעל המחניק.
- לנגב את הרגל עם מים או אלכוהול כדי להסיר פסולת לפני ההזרקה.
- הזרקה תת עורית למרכז כף הרגל האחורית ויוצרת bleb קטן באתר ההזרקה. כדי למנוע את כלי הדם הפועל באורך כף הרגל, להזריק ממש את קו האמצע במקביל לכלי.
איור 3. הזרקת משטח רגליים בעכברים וחולדות.
תוך-לב, רטרו מסלולית ורגליים הן חלק משיטות ההזרקה המיוחדות שחוקרים ביו-רפואיים משתמשים בהן לניסויים המחייבים אספקת תרכובות במסלולים לא טיפוסיים אלה.
הזרקה תוך-לבבית מעבירה את התרכובת לחדר השמאלי ומאפשרת לחומר להיכנס ישירות למחזור העורקים. המסלול מסלולי רטרו הוא חלופה הזרקת וריד הזנב והוא משמש כדי לספק את המתחם לתוך זרימת הוורידים. והזרקת משטח רגליים כרוכה בניהול תת עורי של המאמר לתוך הרגל האחורית של החיה. וידאו זה ימחיש את השיקולים, הנהלים והיישומים של טכניקות הזרקה מיוחדות אלה.
בואו נתחיל עם קצת מידע רקע ודברים שצריך לשקול לפני תחילת הליכי הממשל האלה.
ניהול תוך-לב נעשה לעתים קרובות באמצעות אולטרסאונד כדי להנחות את המחט למיקום הנכון בלב. עם זאת, אם בוצע כראוי ניצול נכון של ציוני דרך נאותים, הממשל יכול להתבצע ללא שימוש ויזואליזציה אולטרסאונד. שימו לב כי ההליך מחייב שימוש בהרדמה כללית, ורק זריקה אחת לכל בעל חיים מותרת להליכי הישרדות. בדרך כלל מחט 27-30 מד משמש עבור הזרקה זו ואת הנפח המרבי של הממשל הוא 100 ו 300 microliters עבור עכברים וחולדות, בהתאמה.
להזרקה תוך ורידי דרך מסלול המסלול רטרו, יש הבנה הוגנת של המבנה ורידי מסלולית. לעכבר יש סינוס שבו מספר ורידים- כלומר האף העל-עורי, הפלפברל הנחות, והזמן-התכנסות השטחי. בעוד בחולדות, יש רשת או מקלעת של כמה ורידים. ההזרקה מתבצעת לתוך הסינוס או מקלעת ישירות. כמו תוך לב, הליך זה דורש גם שימוש בהרדמה כללית, ורק זריקה אחת לכל עין ליום מומלצת עם סך של שתי זריקות לכל עין להליכי הישרדות. כמו עם כל הזריקות, המחט בגודל הקטן ביותר צריך להיבחר - בדרך כלל 27-30 מד-ואת הנפח המרבי המומלץ הוא 150 μL לכל עין.
למרות המחלוקת, השימוש בהזרקת footpad עדיין נדרש עבור כמה מחקרים, הקשורים בדרך כלל דלקת וגידול. שים לב כי הזריקות ניתן לבצע רק על רגל אחת, אף פעם לא דו-לרוחב. ואת מדידות footpad צריך להיעשות מדי יום ברגע נפיחות ברורה התרחשה. מחט 29-30 מד מומלץ עבור ההזרקה ואת הנפח המרבי המומלץ הוא 50 μL. לאחר כל זריקה, כל בעלי החיים חייבים להיות במעקב צמוד עבור סימנים של כאב, רמת צריכת המזון, עבור אמביציה נורמלית. בדרך כלל יש להרדים את החיה כאשר הנגע או הגידול מפריע ליכולתו של בעל החיים לטבול או להגיע למזון ומים.
עכשיו בואו ללמוד את הליכי ההזרקה, החל עם הזרקת תוך לב. אנחנו להדגים את ההליך בעכבר, אבל ציוני הדרך והפרוטוקול לחולדה דומים.
הצעד הראשון הוא להכין את המזרק. זכור מחט 29 מד ומזרק 1 סמ"ק מתאים לעכברים. והנפח המרבי להזרקת תוך-לב הוא 100 מיקרוליטרים. בעת ציור הפתרון, להשאיר כמות קטנה של אוויר בין הבוכנה לבין חומר ההזרקה. זה כדי לאפשר לדם להיכנס למזרק כפי שהוא ממוקם לתוך הלב.
כדי להתחיל, מרדים את החיה באמצעות הרדמה משאף או הרדמה להזרקה. סקור את השיקולים לשמירה על הרדמה כללית בסרטון אחר של אוסף זה. לאחר מכן, מקם את החיה בתנוחת חזרה הגב על פלטפורמה מבודדת. לאחר מכן, להדביק את forelimbs לפלטפורמה ומניחים חתיכת קלטת אופקית על פני הבטן מעל הירכיים. זאת כדי לייצב עוד יותר את החיה ולהימנע מכל תנועה לאחר המחט הוכנסה. לאחר מכן, באמצעות ספוגית, הרטיב את החזה של החיה עם 70% אלכוהול.
כדי לאתר במדויק את אתר ההזרקה, תחילה אתר את קסיפיד ואת העצם מנובריום. לאחר מכן, מצא את נקודת האמצע בין שני ציוני הדרך. 1-2 מ"מ משמאל לנקודה זו, הוא ציון הדרך החדרת מחט. באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה, יש למרוח יוד פובידון כדי לסמן את אתר החדרת המחט.
כדי להזריק, לכוון את המחט בניצב לשולחן, ולהכניס אותו לעומק של כ 2 מ"מ. לאחר מכן, להחיל לחץ גב קל מאוד על הבוכנה. דם מחומצן אדום בוהק צריך להיכנס לרכזת המזרק, מה שמאשר מיקום נכון. החזק את המזרק באותה נקודה והזריק את החומר לאט ובהתמדה במהלך 30 עד 60 שניות. הזרקה מהירה יכולה לגרום לגוש התאים וסתימת העורקים, הלם למערכת בשל טמפרטורת החומר להיות נמוך משמעותית מטמפרטורת הגוף, או הרחבת החדר ושיבוש קצב הלב.
לאחר שהחומר פינה את המזרק, הסר לאט ובזהירות את המחט ללא כל תנועה לרוחב שכן זה יכול לפגוע בשרירי הלב. לאחר מכן שחררו מיד את הקלטת מהניפים והבטן והניחו את החיה במצב נוטה בכלוב נקי עם מצעים עמוקים מספיק כדי לשמש שכבה מבודדת. שים לב כי מחצית מכלוב ההתאוששות הזה נמצא על מקור חימום והחיה המהממת ממוקמת בצד המחומם של הכלוב. זה מונע היפותרמיה, וככל שבעל החיים מתאושש מההרדמה הוא יוכל לזוז מהצד המחומם כרצונו.
לאחר מכן, בואו ללמוד את השיטה להזרקה תוך ורידי ניצול מקלעת רטרו-מסלולית בחולדות. שוב, אנו להדגים את ההליך על עכבר, אבל ציוני הדרך ואת הפרוטוקול עבור חולדות דומים.
חבר את המחט המתאימה למזרק שנבחר ומלא את חומר ההזרקה. זכור, בדרך כלל אחד ישתמש מחט 27-30 מד עם המזרק הקטן ביותר האפשרי ונפח מרבי של 150 microliters.
כדי להתחיל את ההליך, תחילה יש להרסם את החיה. לאחר מכן, מניחים אותו על משטח שטוח בתנוחת נסיגה לרוחב. עכשיו הניחו את האצבע המורה על החלק העליון של הראש והאגודל על הלסת, ומשוך בעדינות אחורה ולמטה. זה כדי להדק את העור ולבלט את גלגל העין. יש להחריד לא להפעיל לחץ על קנה הנשימה ולהגביל את זרימת האוויר. אם מתכננים זריקות מרובות, להחיל הרדמה אופטלמית אקטואלי, כמו טטרקאין או פרופרקאין.
הכנס את המחט לתוך הקנתוס המהודל של העין בזווית של 45° לאף. העומק חייב להיות מספיק כדי לחדור את רקמות הלחמית ולהתקדם למסלול העין לתוך הסינוס. זה לא צריך להיתקל בעצם בחלק האחורי של המסלול. כדי למנוע קרע של כלי הדם, ודא כי המחט יש תנועה מינימלית פעם מוכנס. אל תשאף, כי זה ימוטט את הכלים. הזריקו את המאמר בצורה איטית ויציבה. לאחר מכן, למשוך את המחט בעדינות ולהפעיל לחץ אור על העין כדי לשלוט דימום ולספק hemostasis.
לבסוף, בואו לסקור את שיטת הזרקת footpad בעכברים וחולדות. כדי להתחיל, חבר את המחט המתאימה ומלא את המזרק בנפח הנכון. הליך זה יכול להיעשות בבעלי חיים מודעים.
מניחים את החיה בצינור ריסון עם רגל אחורית אחת מבודדת ומורחבת על ידי אחיזת העור מעל המחניק. לנגב את הרגל עם מים או אלכוהול כדי להסיר פסולת לפני ההזרקה. כדי למנוע את כלי הדם הפועל לאורך כף הרגל, ציון הדרך הזרקה הוא במרכז, אבל רק את קו האמצע, קרוב יותר לבהונות.
מניחים את המחט משופעת באתר ההזרקה ומכוונות אותה לכיוון העקב. הזרק את המאמר לאט ובהתמדה כדי למנוע התנערות מהירה של רקמות כף הרגל. זה יגרום למשטח הרגליים להתנפח כשחומר ההזרקה ממלא את החלל התת עורי הזה. על רגלו של בעל חיים קטן הנפיחות מההזרקה יכולה להאריך לעקב, ואילו אצל חיה גדולה יותר זה יהיה מקומי יותר.
לאחר ההזרקה, יש לבחון את בעלי החיים מדי יום ואם קיים נפיחות מתמשכת או אם יש נגעים או גידולים כתוצאה מהפרוטוקול הניסיוני, אז, באמצעות קליפר, לבצע את מדידת footpad. מכשיר זה מודד את עובי כף הרגל במילימטרים ומסייע בכמות הנפיחות.
עכשיו בואו נדון בכמה ניסויים לדוגמה המשתמשים בזריקות תוך-לבביות, רטרו מסלוליות ומשטח רגליים.
אחד היישומים הרבים של מתן תוך לב הוא פיתוח מודל בעלי חיים של גרורות סרטן. כאן, החוקרים השתמשו בדרך זו כדי להזריק תאים סרטניים בעלי נטייה להתיישבות העצם. בימים שלאחר מכן, הם חקרו גידול בעצמות באמצעות רנטגן וטכניקות הדמיה פלואורסצנטיות. במחקר אחר, המסלול מסלולי רטרו שימש להזרקת נוגדנים ספציפיים כי תווית נויטרופילים. לאחר מכן, בעזרת הדמיה תוך-וינטלית, הצליחו המדענים לעקוב אחר דפוס הנדידה של התאים המסומנים.
לבסוף, חוקרים לעתים קרובות להשתמש הזרקת footpad כדי לנתח תגובה דלקתית. בניסוי זה, החוקרים בודדו תאים חד-גרעיניים של דם היקפי מדגימות דם אנושיות, ערבבו אותם עם אנטיגנים שונים לבדיקה והזריקו את הפתרונות למשטח הרגליים של החיה. לבסוף, הם ביצעו מדידות כף הרגל כדי לכמת את תגובת הנפיחות עקב אנטיגנים שונים.
הרגע צפית בפרק האחרון של JoVE על טכניקות הניהול המורכבות הרגילות והמתמחות.
רק לסיכום, בחלק הראשון סקרנו את מסלול ההורות הנפוץ ביותר. בפרק השני דנו בהליכים היכנסו ואקטואליים. הפרק השלישי עסק בסט הראשון של הליכים לא טיפוסיים כמו תוך-עורית, תוך-גולגולתית וטריעית ביילודים. לבסוף, כאן דנו בשלושה מסלולים נוספים שחוקרים ביו-רפואיים משתמשים בהם במעבדות למטרות ספציפיות.
לאחר צפייה בסדרה זו אתה צריך הבנה הרבה יותר טובה של טכניקות ניהול שונות ואתה צריך גם לדעת את השיקולים הכלליים והספציפיים הקשורים לפרוטוקולים אלה של ניהול מורכב כמו תמיד, תודה על הצפייה!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
ניהול תרכובות לבעלי חיים יכול להיות בעל השפעה משמעותית הן על רווחת החיה והן על התוצאה של הנתונים הניסיוניים והערך המדעי. שיטת המסירה הנכונה חיונית להצלחת הניסוי. גורמים רבים חייבים להיחשב כדי לקבוע את המסלול הטוב ביותר, כולל המטרה המדעית של המחקר, ה- pH של החומר, נפח המינון הנדרש, צמיגות החומר, ואת הרווחה של בעלי החיים. מומחיות טכנית היא גם דרישה לכל שיטות ההזרקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Morton, D.A., Jennings, M., Buckwell, A., Ewbank, R., Godfrey, C., Holgate, B., Inglis, I., James, R., Page, C., Sharman, I., Verschoyle, R., Westall, L., and Wilson, A.B. 2001. Refining procedures for the administration of substances Report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Members of the Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals. 35. 1-41
- Prendiville , T.W., Qing, M., Lin, Z., Zhou, P., He, A., and Pu, W.T. 2014. Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice. Journal of Visualized Experiments. 90 | e51566.
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H.D., Huizing, M., and Hoogstraten-Miller, S. 2001. Retro-orbital injection in mice. Lab Animal. 40:5. 155-171.
- Steel, C., Stephens, A., Hahto, S., Singletary, S., Ciavarra, R. 2008. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim. 37. 26-31.
- Timm, K.I. 1989. Orbital venous anatomy of the Mongolian gerbil, with comparison to the mouse, hamster, and rat. Laboratory Animal Science. 39:3. 262-265.
- Kamala, T. 2007. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. Journal of Immunological Methods. 328. 204-214.
