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Administração Composta III

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidade de Notre Dame, IN

Existem muitas rotas comumente usadas para administração composta em ratos e ratos de laboratório. No entanto, certos protocolos podem exigir o uso de rotas menos utilizadas, incluindo injeções intradérmicas, intranasais e intracranianas. O treinamento especializado é essencial para que esses procedimentos sejam realizados com sucesso. A justificativa para essas rotas pode precisar ser fornecida para obter a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

Principles

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As linjeções intraderma são entregues nas camadas externas da derme, sob a camada superior da pele (a epiderme). Esta rota de injeção é geralmente reservada para a avaliação de inflamação, diagnósticos de fluxo sanguíneo cutâneo ou reações alergênicas a um antígeno.

Embora frequentemente utilizado para a entrega local de vacinas ou spray descongestionante, a administração intranasal também pode ser usada para a entrega do sistema nervoso sistêmico e central (CNS). A mucosa que reveste a cavidade nasal tem um rico suprimento de vasos sanguíneos e nervos que permitem uma rápida absorção sistêmica e direcionamento direto ao SNC. Substâncias compostas por pequenas moléculas lipofílicas têm uma taxa de absorção muito maior do que aquelas que contêm moléculas maiores. 2

Embora a anestesia não seja necessária para este procedimento, pode facilitar a colocação adequada do composto nas nares, garantindo uma dosagem precisa. Foi demonstrado que animais anestesiados têm cinco vezes maior entrega de uma droga ao cérebro em comparação com um animal consciente. 2 Ratos não sineques são muito resistentes à administração intranasal. No entanto, há um estudo que demonstrou técnicas eficazes de entrega para administração intranasal de ratos em movimento livre. 3 Além disso, os animais de alerta podem tentar morder a ponta da pipeta, ou agulha, dificultando a entrega da substância.

As vantagens para a administração intranasal são que essa técnica requer treinamento mínimo e habilidade, e não é invasiva ao animal. No entanto, devido à possibilidade de aerossolização, o uso de um armário de biossegurança e proteção ocular é aconselhado, especialmente quando se trabalha com um animal consciente. Além disso, para evitar afogar os animais, deve ser utilizada a menor dose possível. Se em qualquer momento durante este procedimento cianose, respiração bucal ou outros sinais de angústia forem vistos no animal, o procedimento deve ser abortado imediatamente.

Injeções intracranianas em camundongos adultos e ratos empregam o uso de equipamentos estereotaxicos para garantir o posicionamento adequado e a profundidade da injeção. No entanto, em camundongos de 3 a 28 dias de idade, e ratos de até 14 dias de idade, o crânio é fino o suficiente para injetar diretamente através dele; é muito frágil para suportar o dispositivo estereotaxic. Os filhotes de rato ou rato devem ficar com a mãe até o procedimento, e devem ser devolvidos a ela o mais rápido possível assim que o procedimento for concluído. Os cuidados pós-injeção incluem monitoramento contínuo em uma fonte de calor até que sejam observados movimentos e comportamentos normais, incluindo enfermagem. A principal razão para usar essa técnica é fornecer agentes farmacológicos ao sistema nervoso central que requerem que a barreira hematoencefálica seja atravessada, ou para evitar os efeitos envolvidos na rota sistêmica. 1

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Procedure

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1. Administração intradérmica

  1. A maioria das injeções intradérmicas são compostos aquosos. As soluções devem ser fisiologicamente tamponadas para ter um pH neutro, a fim de evitar necrose tecidual no local da injeção.
  2. A faixa de tamanho da agulha é de 25-30, a menor possível.
  3. A faixa de dose por local de injeção é de 50-100 μL. A injeção de volumes excessivos pode resultar em necrose no local da injeção ou vazamento do composto para fora do local devido à pressão.
  4. Para uma colocação precisa da agulha no espaço intradérmico, é necessário anestesiar tanto ratos quanto ratos. A anestesia por inalação permite uma rápida indução e recuperação; no entanto, a anestesia injetável tem a vantagem de fornecer tempo suficiente para a preparação da área e realizar a injeção. 1
  5. Remova o cabelo no local da injeção através do uso de um creme depilatório ou raspando a área.
  6. Remova completamente qualquer creme depilatório residual ou detritos capilares.
  7. Aplique um antisséptico tópico, como uma solução de iodo, solução de clorexidina ou álcool.
  8. Procedimentos administrativos
    1. Estique a pele esticada entre o polegar e o dedo indicador. Isso proporciona estabilidade à pele ao posicionar a agulha.
    2. Coloque a agulha em cima da pele.
    3. Insira suavemente a agulha na pele entre a epiderme e a derme. Avance a agulha logo depois do bisel.
    4. Injete a substância lentamente. A injeção do composto criará uma bolha, ou pequena bolha, na pele.
    5. Faça uma pausa após a injeção para permitir que a pele se estique e ajuste antes de retirar a agulha.
  9. Precauções
    1. Puxar para trás no êmbolo não é necessário.
    2. Se a agulha for inserida no espaço subcutâneo, nenhuma sangria será formada. Injetar muito profundamente resulta em uma injeção subcutânea.
    3. Evite borrar ou limpar a área, pois isso pode fazer com que o composto vaze do local da injeção.
    4. Ao realizar múltiplas injeções, espaça-as para que os blebs não se sobreponham.

Figure 1
Figura 1. Injeção intradérmica em camundongos.

2. Administração Intranasal

  1. Equipamento
    1. Use uma pipeta de unidade de micropipetamento que pode ser calibrada para fornecer um volume preciso.
    2. As pontas de pipeta descartáveis devem ser usadas para evitar contaminação cruzada. Seringas de tb, agulhas cegas e tubos flexíveis também podem ser usados para dosagem.
    3. Os volumes totais de injeção para ratos não devem exceder 40-100 μL, e devem ser dados em gotas de 6-10 μL. Para camundongos, o volume total máximo é de 24 μL, dado em quedas de 3-4 μL.
  2. Administração em animais conscientes
    1. A contenção manual em animais conscientes requer que a cabeça seja relativamente imóvel para que a ponta da pipeta ou a agulha cega possa ser colocada perto o suficiente das nares para entregar o composto, mas não tão perto a fim de cutucar ou dilacerar o tecido nasal.
    2. Contenha o animal e segure-o em uma posição vertical.
    3. Coloque uma pequena gota de um composto líquido na abertura nasal. O animal deve inalar a gota.
    4. Administre um volume adicional, alternando nares até que todo o volume tenha sido dado.
    5. Ao administrar volumes maiores, é importante não restringir o peito durante a contenção. A compressão torácica impede a capacidade do animal de respirar fundo o suficiente para atrair o líquido para os brônquios e pulmões.

Figure 2
Figura 2. Administração intranasal em camundongos conscientes.

  1. Administração em animais inconscientes
    1. O uso de anestésicos de inalação permite um animal imobilizado durante a abordagem e entrega do composto. Isso elimina a possibilidade de o animal morder o equipamento de dosagem, a perda do composto devido ao empurrão da cabeça e lesão no tecido nasal do animal, olhos ou pele facial. O animal também é menos propenso a cheirar e pulverizar o composto das nares após a administração.
    2. Coloque o animal na posição supina. A posição da cabeça influencia a colocação da solução nas nares. Foi demonstrado que a posição ideal para a entrega do CNS é com o supino animal; isso permite uma melhor absorção. 2
    3. Administre metade do composto diretamente em um lado da abertura nasal, cronometrando-o com inalação. Então, vire o animal.
    4. Como acima, administre a outra metade do volume na outra abertura nasal.

Figure 3
Figura 3. Administração intranasal em ratos inconscientes.

3. Administração intracraniana em camundongos e ratos neonatais

  1. Camundongos ou ratos devem ser anestesiados para injeções intracranianas.
Rato Rato
Idade (dias) Medidor de agulha (g) Idade (dias) Medidor de agulha (g)
0-7 29-30 0-5 27-29
7-14 27 5-10 25-27
14-28 25 10-14 25
Idade (dias) Comprimento da agulha (mm) Idade (dias) Comprimento da agulha (mm)
0-7 2 0-4 2-3
7-14 3 4-7 3
14-21 4 7-10 4
21-28 5 10-14 5
Idade (dias) Volume (μL) Idade (dias) Volume (μL)
0-5 <20 1-3 <20
6-20 <60 4-10 <60
20-28 <100 11-14 <100

Mesa 1. Medidor de agulha, comprimento da agulha e volume máximo de administração intracraniana conforme a idade de ratos e ratos. 4

  1. Equipamento
    1. Determine o medidor de agulha correto e o volume máximo de administração conforme a Tabela 1.
    2. Prepare um protetor de agulha antes de anestesiar o animal.
      NOTA: A profundidade de injeção da agulha é controlada através do uso de um protetor que é criado com a tampa da agulha.
      1. Para criar o protetor, uma agulha é medida contra a tampa da agulha, e uma marca é colocada na tampa para indicar onde cortar. O corte deve ser feito para que 2 a 5 mm da agulha sejam expostos quando a tampa for substituída na agulha.
      2. O comprimento da agulha exposta deve ser longo o suficiente para penetrar na pele e no crânio, e alcançar a profundidade desejada no cérebro.
      3. Os comprimentos da agulha necessários para ratos e ratos estão listados na Tabela 1.
    3. Uma fonte de aquecimento é necessária para prevenir hipotermia nos filhotes. Existem vários tipos: uma almofada de aquecimento elétrica em baixo, uma manta de água circulante ou uma bolsa de calor de reação química reutilizável.
  2. Restrição
    1. Filhotes de rato e rato com 10 dias ou mais não requerem anestesia para este procedimento. Contê-los manualmente segurando-os logo atrás da cabeça e puxando a pele caudally para colocar leve pressão sobre os ombros.
    2. Anesthetize filhotes com mais de 10 dias de idade com inalação de isoflurano. Conecte uma câmara de indução a um vaporizador de precisão ou um pote de sino com uma bola de algodão encharcada com isoflurano. Uma vez que o filhote é imobilizado, a anestesia é eficaz por cerca de 40 segundos, o que proporciona tempo suficiente para a injeção.
  3. Técnica de injeção
    1. Desenhe a substância na seringa e coloque a tampa/agulha sobre a agulha.
    2. O volume de injeção recomendado como o volume máximo por rato ou rato neonatal é de 100 μL, e que para desmamar ou camundongos mais velhos é de até 300 μL.
    3. Para injetar no córtex cerebral de recém-nascidos, insira a agulha 5 mm atrás do olho, aproximadamente 3 mm fora da linha média do crânio.
    4. O local de injeção do rato desmamar é aproximadamente a meio caminho entre o olho e a orelha, e apenas fora da linha média.

Figure 4
Figura 4. Administração intracraniana em um filhote de rato.

Às vezes, diferentes abordagens experimentais exigem o uso de rotas menos comumente empregadas de administração composta em roedores. Intradérmico, intranasal e intracraniano são três dessas rotas alternativas que os pesquisadores biomédicos usam em laboratórios hoje.

Como o nome sugere, intradérmico está entregando compostos nas camadas externas da dermis. A Intranasal está colocando a solução nas nares do animal. E intracraniano envolve inserir a agulha diretamente no cérebro do roedor.

O treinamento especializado é essencial para a realização desses procedimentos com sucesso. Aqui, primeiro ilustraremos as considerações para cada um desses métodos e, em seguida, vamos demonstrar as técnicas que ajudarão você a aprender os procedimentos, garantindo a segurança do animal e o sucesso do experimento.

Vamos começar com a discussão de quando essas rotas são geralmente empregadas e coisas que se deve ter em mente antes de começar a executar essas técnicas de administração especializadas.

As injeções intradérmicas são usadas para entregar um artigo no espaço entre a epiderme e a derme Esta rota é geralmente reservada para a avaliação de inflamação, diagnóstico de fluxo sanguíneo cutâneo ou reações alergênicas a um antígeno. Semelhante a outras rotas, a solução intradérmica também deve ser preparada utilizando a técnica estéril. E deve ser fisiologicamente tamponado para ter um pH neutro, a fim de evitar necrose tecidual no local da injeção. Um sistema sem cubos com uma agulha calibre 25-30 é frequentemente usado para esta injeção. Este sistema ajuda na preservação do volume de administração, que está na faixa de 50-100 microliters por local de injeção. O excesso de injeção pode resultar em necrose ou vazamento de composto indesejável devido à pressão.

A rota intranasal é frequentemente escolhida para a entrega local de vacinas ou spray descongestionante, bem como a entrega sistêmica e CNS. A mucosa que reveste a cavidade nasal tem um rico suprimento de vasos sanguíneos e nervos que permitem uma rápida absorção sistêmica e direcionamento direto ao SNC. Este é um método não invasivo que requer treinamento mínimo e habilidade, e equipamento simples - uma micropipette calibrada e algumas dicas descartáveis. Os volumes de administração para ratos não devem exceder 40-100 microlitres dados em 6-10 microliteres-drops. E para camundongos, o volume total máximo é de 24 microliters dados em 3-4 microliter-drops.

Embora a anestesia não seja necessária para este procedimento, ela tem algumas vantagens sobre a administração intranasal em animais conscientes 1) facilita a colocação adequada do composto nas nares, garantindo dosagem precisa 2) elimina a possibilidade de o animal morder o equipamento de dosagem 3) garante que não haja lesão no tecido nasal do animal, olhos, ou pele facial devido ao empurrão da cabeça, e 4) animal é menos propenso a cheirar e pulverizar o composto das nares após a administração.

Injeções intracranianas em camundongos adultos e ratos empregam o uso de equipamentos estereotaxicos, que é descrito em um vídeo na coleção "Essenciais da Neurociência". O equipamento garante o posicionamento adequado e a profundidade correta da injeção. Aqui, vamos nos concentrar na entrega intracraniana em camundongos e ratos neonatais em que o crânio é fino o suficiente para injetar diretamente através dele, e pode ser muito frágil para suportar o dispositivo estereotaxico. Os principais objetivos desta técnica são entregar agentes farmacológicos cns diretamente ao CNS, e evitar os efeitos encontrados através de qualquer rota sistêmica. O medidor de agulha, comprimento e volume de administração são determinados com base na espécie e na idade dos filhotes. Note que à medida que a idade do animal aumenta, o número de medidor diminui, o comprimento da agulha necessário aumenta, e o volume máximo recomendado de administração também aumenta.

Com essa informação de fundo em mente, vamos nos aprofundar nos procedimentos desses métodos de injeção. A primeira é a técnica de administração intradérmica. Este procedimento deve ser realizado em animais anestesiados. Reveja outro vídeo desta coleção para entender os procedimentos de indução e manutenção da anestesia.

Uma vez que o animal é anestesiado, raspe o local da injeção usando uma navalha elétrica ou um creme depilatório. Com uma gaze umedecida pela água, remova completamente o cabelo persistente do local. Em seguida, com outra gaze pad, aplique uma solução antisséptica tópica na área raspada. Para a administração, estabilize primeiro a pele no local da injeção, esticando-a entre o polegar e o dedo indicador.

Agora coloque a agulha bisbida sobre a pele e insira-a suavemente logo após o bisel para que a abertura seja entre a epiderme e as camadas de derme. Em seguida, injete lentamente e note que ele cria uma bolha na pele. Se a agulha for inserida muito profundamente, então nenhuma bolha será formada. Depois de injetar, faça uma pausa para permitir que a pele se estique e ajuste e, em seguida, retire a agulha lentamente. Não puxe para trás no êmbolo a qualquer momento, pois você desenharia o tecido e causaria trauma no local da injeção. Além disso, não limpe ou limpe o local da injeção, pois isso pode causar o vazamento da substância injetada. Ao realizar múltiplas injeções, certifique-se de espaça-las o suficiente para que os blebs não se sobreponham uns aos outros.

Em seguida, vamos aprender o procedimento de administração intranasal em animais conscientes e anestesiados.

Para animais acordados, contenha-os esmagando a pele na nuca e, em seguida, segure o animal em uma posição vertical com a cabeça imobilizada. Tenha cuidado para não restringir o peito, pois isso pode impedir a capacidade do animal de respirar fundo o suficiente para atrair o líquido para os pulmões. Usando uma micropipette, administre parte da solução colocando uma pequena gota de líquido na abertura nasal. O animal vai inalar a gota. Repita este processo, alternando entre as duas aberturas nasais até que todo o volume a ser administrado tenha sido dado. Recordação - o volume total de administração não deve exceder 24 μl e 100 μl em camundongos e ratos, respectivamente.

Para camundongos e ratos anestesiados, coloque o animal em posição de recumbência dorsal. Esta posição é ideal para a entrega de CNS, pois permite uma melhor absorção do composto. Gire a cabeça do animal e administre metade do composto diretamente em um lado da abertura nasal, cronometrando-a com inalação. Então, gire a cabeça do animal para a próxima administração. Após 2 respirações ou mais, administre o volume restante na segunda abertura nasal. Após a administração completa, devolva o animal de volta à sua gaiola.

Em seguida, vamos rever o procedimento de administração intracraniana para camundongos e ratosneonatais. Antes de iniciar o procedimento, coloque a gaiola com os filhotes e a represa em uma almofada de aquecimento elétrica definida para baixo. Certifique-se de que uma parte da gaiola está fora da almofada de aquecimento. Isto é para prevenir hipotermia e, ao mesmo tempo, permitir que a represa se afaste do calor se ela desejar. Em seguida, selecione um medidor de agulha apropriado para a idade do animal. Lembre-se, o medidor de agulha; comprimento da agulha, que é usado para controlar a profundidade da agulha durante a injeção intracraniana; e o volume da administração... todos variam com a idade e espécie do animal.

O comprimento é ajustado usando um protetor. Para preparar este protetor, meça a agulha correta contra sua tampa e faça uma marca. Em seguida, coloque uma segunda marca na tampa para indicar onde ela será cortada. A distância entre as duas marcas é o comprimento da agulha desejado. Então, corte a tampa com uma lâmina de barbear. Não use tesouras, pois elas esmagarão a tampa e não produzirão um corte de nível limpo. Este é o "protetor de agulhas". Descarte a agulha usada para criar o protetor, pois não é mais estéril, e, em vez disso, insira uma nova agulha no protetor e certifique-se de que o comprimento correto seja exposto. Em seguida, usando uma agulha diferente presa à seringa adequada, desenhe a substância de injeção. Uma agulha diferente é usada para fazer isso, porque a colocação na rolha irá embotar significativamente essas agulhas de bitola fina, o que não é ideal para administração intracraniana. Em seguida, coloque a seringa cheia na agulha com o protetor. Agora o sistema está pronto para uma injeção.

Para filhotes com mais de 10 dias de idade, administre anestesia por inalação. Filhotes com menos de 10 dias de idade não precisam ser anestesiados. Para realizar a injeção, primeiro localize o local, que é 5 mm atrás do olho e aproximadamente 3 mm fora da linha média do crânio. Em seguida, insira a agulha na profundidade permitida pelo protetor de agulha. Então, injete de forma lenta e constante para evitar traumas no cérebro. Remova a agulha imediatamente e com muito cuidado para evitar lesões no tecido cerebral. Por fim, coloque o animal de volta com a represa para permitir a recuperação adequada.

Agora vamos rever alguns experimentos que estão sendo conduzidos em laboratórios hoje que utilizam essas rotas incomuns de administração.

Uma injeção intradérmica é frequentemente usada para estudar a reação inflamatória da pele. Neste experimento, os pesquisadores usaram esse método para injetar um alérgeno em um ouvido e uma substância neutra no ouvido oposto de um rato pré-sensibilizado. Em seguida, eles entregaram um corante azul no sistema circulatório do animal para examinar as mudanças na permeabilidade vascular devido à injeção de alérgeno.

Como mencionado anteriormente, uma das aplicações da administração intranasal é a administração da administração. Aqui, os cientistas usaram essa rota para fornecer uma vacina contra gripe atenuada geneticamente modificada ao vivo no tipo selvagem e camundongos transgênicos e estudaram imunidade mucosa através da produção de um tipo específico de células T.

Por fim, essas pesquisas biomédicas usaram a administração intracraniana para implantar células cancerígenas em camundongos imunocomprometidos, a fim de criar um modelo de tumor cerebral humano. A eficácia da injeção foi então analisada utilizando-se um sistema de imagem in vivo.

Você tem jus assistiu o vídeo de JoVE sobre alguns dos métodos especiais de administração composta em ratos e ratos de laboratório. Agora você deve entender quando esses procedimentos são úteis, as considerações que você deve ter em mente antes e ao executar essas técnicas, e as etapas processuais essenciais para garantir que a administração tenha um impacto mínimo na saúde do animal e nos dados experimentais a serem coletados. Como sempre, obrigado por assistir!

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Applications and Summary

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A administração de compostos em animais pode ter um efeito significativo tanto no bem-estar do animal quanto no resultado dos dados experimentais e do valor científico. O método adequado de entrega é essencial para o sucesso do experimento. Muitos fatores devem ser considerados para determinar o melhor caminho, incluindo o objetivo científico do estudo, o pH da substância, o volume de dosagem necessário, a viscosidade da substância e o bem-estar dos animais. A perícia técnica também é um requisito para todos os métodos de injeção.

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References

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  2. Dhuria, S.V., Hanson, L.R., and Frey II, W.H. 2010. Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99: 1654-1673.
  3. Stevens, J., Suidgeest, E, Van der Graaf, P.H., Danhof, M., and De Lange, E.C. 2008. Development and evaluation of a new, minimal-stress animal model for intranasal administration in freely moving rats. Poster presentation at American Association of Pharmaceutical Scientists Annual Meeting, Atlanta, Georgia.
  4. Morton, D.A., Jennings, M., Buckwell, A., Ewbank, R., Godfrey, C., Holgate, B., Inglis, I., James, R., Page, C., Sharman, I., Verschoyle, R., Westall, L., and Wilson, A.B. 2001. Refining procedures for the administration of substances Report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Members of the Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals. 35: 1-41.

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