Overview
Fonte: Laboratório do Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
A cristalografia de raios-X é um método comumente usado para determinar o arranjo espacial dos átomos em um sólido cristalino, que permite a determinação da forma tridimensional de uma molécula ou complexo. Determinar a estrutura tridimensional de um composto é de particular importância, uma vez que a estrutura e a função de um composto estão intimamente relacionadas. Informações sobre a estrutura de um composto são frequentemente usadas para explicar seu comportamento ou reatividade. Esta é uma das técnicas mais úteis para resolver a estrutura tridimensional de um composto ou complexo, e em alguns casos pode ser o único método viável para determinar a estrutura. O crescimento de cristais de qualidade de raios-X é o componente chave da cristalografia de raios-X. O tamanho e a qualidade do cristal são muitas vezes altamente dependentes da composição do composto que está sendo examinado pela cristalografia de raios-X. Tipicamente compostos contendo átomos mais pesados produzem um maior padrão de difração, exigindo cristais menores. Geralmente, cristais únicos com rostos bem definidos são ótimos, e tipicamente para compostos orgânicos, os cristais precisam ser maiores do que aqueles que contêm átomos pesados. Sem cristais viáveis, a cristalografia de raios-X não é viável. Algumas moléculas são inerentemente mais cristalinas do que outras, assim a dificuldade de obter cristais de qualidade de raios-X pode variar entre os compostos. O crescimento de cristais de raios-X é semelhante ao processo de recristalização que é comumente usado para purificar compostos, mas com ênfase na produção de cristais de maior qualidade. Muitas vezes, cristais de maior qualidade podem ser obtidos permitindo que o processo de cristalização prossiga lentamente, o que pode ocorrer ao longo do dia ou meses.
Principles
Há uma série de métodos para o cultivo de cristais de raios-X, como aquecimento e resfriamento, evaporação e difusão de vapor, cada um com suas próprias vantagens e limitações. 1 Descrito aqui é um dos métodos mais úteis para o cultivo de cristais de qualidade de raios-X, difusão líquido-líquido. 2 O crescimento bem sucedido do cristal de raios-X depende da escolha adequada dos solventes. O composto deve ser solúvel em um solvente, mas insolúvel em outro. A difusão líquido-líquido envolve cuidadosamente colocar um solvente de baixa densidade em cima de um solvente de maior densidade em um tubo fino, como um tubo NMR. A taxa de difusão pode influenciar muito o tamanho e a qualidade dos cristais, a difusão rápida favorece cristais menores, enquanto a difusão lenta favorece o crescimento de cristais maiores e de maior qualidade. A utilização de tubos finos, como tubos NMR, retarda a difusão dos solventes, criando assim um ambiente que facilite o crescimento de cristais de maior qualidade. Solventes comumente usados para a camada inferior, na qual o composto é dissolvido, são cloreto de metileno ou clorofórmio. O composto é dissolvido no solvente menos denso, mas isso pode ser problemático, pois o solvente superior pode começar a evaporar antes da formação de cristais. A condição ideal é ter os compostos dissolvidos no solvente mais denso. A camada superior é o anti-solvente ou precipitante. Anti-solventes frequentemente usados são hexano, pentano, éter dietil ou metanol. Uma vez que os dois solventes tenham sido cuidadosamente em camadas, eles são autorizados a difundir lentamente um no outro. O composto torna-se menos solúvel na solução binária, facilitando a formação de cristais de raios-X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. Preparação do tubo de cristal e filtro
- Coloque um tubo de RMN em um frasco de Erlenmeyer.
- Prepare um filtro de pipeta.
- Construa o filtro colocando um pedaço de lenço sem fiapos (1 por 1 a 1 polegada)na pipeta e use uma haste para encaixar firmemente a limpeza na porção de gargalo da pipeta(Figura 1).
- Faça dois filtros de pipeta para cada tubo de cristal necessário.
2. Adicionando a amostra ao tubo de cristal
- Dissolva o composto (tetrafenilaporfirina, 10 mg) em 0,75 mL de solvente (diclorometano).
- Com uma pipeta, adicione suavemente a mistura na parte superior do tubo, passando-a pelo filtro.
- As partículas são filtradas para evitar a criação de locais de nucleação, o que pode levar a pequenos cristais múltiplos em vez dos cristais maiores desejados.
- Uma vez que a amostra tenha sido colocada no tubo de cristal, muito lentamente e suavemente, adicione o anti-solvente (1,5 mL de metanol) ao tubo através de uma nova pipeta de filtro. Permita que o anti-solvente se coloque lentamente na solução adicionada anteriormente (Figura 2). Não use uma lâmpada para empurrar o solvente através da pipeta, em vez disso, deixe o solvente fluir através do filtro por si só.
- Certifique-se de que o solvente de maior densidade seja adicionado primeiro ao tubo de cristal.
- Verifique se os dois solventes estão errados um com o outro. Isso é feito antes da adição do solvente.
- Sele o tubo com uma tampa NMR.
3. Crescimento de Cristal
- Sem fazer com que os dois solventes se misturem, coloque o tubo de cristal em um armário onde eles não serão perturbados.
- O tempo de cristalização vai variar com cada composto, normalmente os tubos de cristal devem ficar imperturbáveis por uma semana.
- Depois de uma semana, inspecione os tubos para o crescimento de cristais.
- O crescimento de cristal normalmente ocorre na interface dos dois solventes.
- Inspecione visualmente os tubos em busca de evidências de crescimento de cristais. Tenha cuidado para não facilitar a mistura dos solventes, caso o composto exija tempo adicional para a formação de cristais.
- Se parece que o crescimento do cristal ocorreu, inspecione ainda mais os tubos usando um microscópio.
4. Seleção de Cristal
- Cristais de difração de raios-X devem ter rostos bem definidos.
- Cristais que se agruparam devem ser evitados, se possível.
- Deixe os cristais no tubo de cristal até que estejam prontos para colher o cristal, imediatamente antes de colocar o cristal no difrítômetro.
- Manter os cristais no tubo garantirá que os cristais permaneçam solvados. A dess solvação pode fazer com que os cristais quebrem, e dificultar a difração do cristal.
Figura 1. Uma imagem do filtro de pipeta. Um pequeno pedaço de lenço sem fiapos foi firmemente preso ao gargalo da pipeta. As soluções são passadas embora estes filtros de pipeta antes de serem introduzidos no tubo de cristal.
Figura 2. Uma vez que a solução contendo composto direcionado é colocada no tubo de cristal, o anti-solvente é lentamente em camadas em cima, passando-o através de um novo filtro de pipeta.
Um único cristal é necessário para a determinação de sua estrutura. A qualidade do cristal influencia fortemente a qualidade e a precisão da determinação estrutural.
Um único cristal é um sólido no qual o arranjo da molécula se repete nas três dimensões. O arranjo espacial dos átomos dentro do sólido cristalino pode ser determinado usando cristalografia de raios-X. Nesta técnica, uma amostra cristalina pura é envolta por um feixe de raios-X. O cristal difraciona os raios-X em um padrão distinto relacionado à estrutura dos cristais e à composição molecular. Se um cristal for formado muito rapidamente, as moléculas podem ser desordenadas, impurezas podem ser incorporadas ao cristal, ou dois ou mais cristais fundidos podem se formar em vez de um único cristal. Portanto, métodos especializados com ênfase no crescimento lento são necessários para produzir cristais de qualidade suficiente para a cristalografia de raios-X.
Este vídeo ilustrará as características desejadas dos cristais de qualidade de raios-X, demonstrará um procedimento para o cultivo deles e introduzirá algumas aplicações dessa técnica em química.
Elétrons dispersam raios-X emitindo uma onda de raios-X esféricas quando atingidos. Se os átomos estão em um arranjo ordenado, a interferência construtiva entre as ondas produz um padrão característico de difração em um detector de raios-X. O cristal é girado dentro do feixe para coletar padrões de difração de múltiplos ângulos. Com padrões suficientes de difração, a estrutura molecular pode ser derivada.
Cristais de qualidade de raios-X geralmente formam formas simétricas e têm rostos suaves e refletidos pela luz. Quando vistos sob um microscópio polarizador, eles serão transparentes, mas a maioria deve ficar escura quando girada 90°. Isso indica uma estrutura altamente ordenada. Para cultivar esses cristais, a difusão líquido-líquido é frequentemente usada. Isso emprega dois solventes miscíveis: um solvente de baixa densidade, ou precipitante, no qual o composto a ser recristalizado é insolúvel; e um solvente de alta densidade em que o composto é solúvel. Normalmente, a razão volumosa de precipitante para solvente é de 2:1.
O precipitante de baixa densidade é colocado em camadas sobre uma solução concentrada do composto no solvente de alta densidade. Com o tempo, o composto se torna menos solúvel à medida que o precipitante se mistura com a solução. Uma interface de solvente menor resulta em uma taxa mais lenta de difusão, produzindo cristais maiores e mais puros. Agora que você entende os princípios do crescimento de cristais de qualidade de raios-X, vamos passar por um procedimento para crescer por difusão líquido-líquido.
Para começar, obtenha os equipamentos necessários encontrados no protocolo de texto. Adquira um solvente para o composto e um precipitante menos denso.
Para preparar um filtro de pipeta, coloque um pequeno pedaço de Kimwipe na parte superior de uma pipeta de vidro e pressione suavemente o papel até a parte inferior do corpo da pipeta usando uma haste ou a haste de outra pipeta, tomando cuidado para não perfurar o papel. Prepare dois filtros de pipeta. Coloque um no tubo NMR. Se necessário, fixe o conjunto com um grampo de laboratório e suporte de anel. Dissolva cerca de 10 mg do composto a ser recristalizado em 0,75 mL de solvente.
Agora, adicione cuidadosamente a solução de amostra no filtro de pipeta. Afixe uma lâmpada na parte superior e aperte lentamente para passar a solução para o tubo NMR para remover impurezas sólidas. Não permita que a lâmpada se expanda de novo enquanto estiver presa, pois a sucção desalojará o papel do filtro.
Em seguida, remova o filtro de pipeta usado e coloque o segundo filtro no tubo NMR. Pipeta aproximadamente 1,5 mL de precipitante no tubo. Deixe o solvente passar pelo filtro por gravidade. De agora em diante, tome cuidado para não perturbar o filtro durante qualquer manipulação. Uma vez que todo o precipitante tenha filtrado no tubo, remova o filtro e tampa o tubo. Coloque-o em um armário ou outro local facilmente verificado onde não será agitado.
Depois de pelo menos um dia, inspecione os tubos para o crescimento de cristais. Se não houver cristais ou os cristais forem muito pequenos, deixe o tubo de amostra intacto. Se os cristais forem visíveis, verifique seu tamanho e forma sem perturbar as camadas de solventes.
Se os cristais forem grandes, bem definidos e não estiverem agrupados, inspecione os cristais sob um microscópio para verificar seu potencial de qualidade de raio-X. Não remova os cristais do tubo até que o diractômetro esteja pronto para iniciar a varredura. Se moléculas de solvente forem incorporadas à estrutura cristalina, permitindo que o cristal seque degradará o cristal. Usando cristalografia de raios-X, verificou-se que a estrutura molecular desses cristais roxos escuros foi verificada como tetrafenilporfirina.
A cristalografia de raios-X é uma ferramenta analítica essencial em química e bioquímica.
Os métodos de recristalização incluem aquecimento e resfriamento, difusão líquido-líquido, difusão de vapor e evaporação lenta. Em evaporação lenta de um único sistema solvente, o composto é dissolvido em uma pequena quantidade de solvente e colocado em um recipiente com um pequeno orifício na tampa. À medida que o solvente evapora, a concentração aumenta até que o composto comece a se cristalizar.
A funcionalidade das proteínas está frequentemente relacionada à sua estrutura. No entanto, proteínas podem ser muito difíceis de cristalizar. Técnicas especializadas devem ser desenvolvidas para cultivar cristais de proteínas de qualidade de raios-X. Aqui, uma gota de solução proteica é misturada com uma gota de precipitante e esta mistura é selada em uma câmara com precipitante puro. À medida que o vapor solvente se difunde para fora da queda, a solubilidade da proteína na queda diminui, e a proteína se cristaliza lentamente. Outra técnica mistura a solução proteica e precipitante sob óleo mineral. Usando essas técnicas, uma variedade de proteínas pode ser cristalizada para análise.
Na difração em pó, cada orientação espacial possível é representada na amostra simultaneamente. A difração em pó não é tão informativa sobre a estrutura como a difração de raios-X de cristal único devido à perda de dados de estrutura tridimensional. Em vez disso, a difração em pó destaca-se na análise de misturas de sólidos cristalinos e na avaliação da cristalina das estruturas amorfas.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE a cristais de crescimento para cristalografia de raios-X. Agora você deve estar familiarizado com as propriedades dos cristais de qualidade de raios-X, um procedimento para enloucoê-los, e algumas aplicações desta técnica em química.
Obrigado por assistir!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
A técnica de difusão líquido-líquido foi utilizada para criar cristais de qualidade de raios-X de tetrafenilaporfirina. Usando diclorometano como solvente e metanol como anti-solvente, os líquidos foram autorizados a difundir lentamente ao longo de uma semana sem serem perturbados. Cristais grandes, bem definidos e escuros roxo-avermelhados formados na interface dos dois solventes(Figura 3). O crescimento dos cristais pode ser observado visualmente. Os cristais cresceram com rostos muito bem definidos, que podem ser vistos com um microscópio.
Figura 3. Cristais de qualidade de difração de raios-X de TPP. Cristais que estão agrupados ou que estão crescendo uns dos outros devem ser evitados. Grandes cristais individuais com rostos bem definidos normalmente produzem melhores resultados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
Cristais de qualidade de raios-X podem ser cultivados por difusão líquido-líquido. A difusão lenta do sistema de solventes binários permite a criação de cristais adequados para difração de raios-X. Este método permite que a rede de cristal se forme lentamente, muitas vezes levando a cristais maiores e mais bem definidos. O uso de tubos de RMN facilita a difusão lenta dos solventes, permitindo um crescimento ideal de cristal. Esse processo pode levar de alguns dias a vários meses. Muitas vezes durante o processo de cristalização, moléculas de solventes são incorporadas à rede cristalina. Assim, é importante evitar permitir que os cristais "sequem". Assim, uma das vantagens da difusão líquido-líquido é que os cristais normalmente crescem na interface dos dois solventes, o que contorna esse fenômeno.
A difusão líquido-líquido é uma das técnicas mais úteis para a produção de cristais de qualidade de raios-X, que é o componente mais essencial da cristalografia de raios-X. A obtenção de cristais de qualidade de raios-X é tipicamente o fator limitante na realização de experimentos de cristalografia de raios-X. A cristalografia de raios-X essencialmente cria uma imagem tridimensional da estrutura de uma molécula, tornando-a o método menos ambíguo para determinar a configuração completa de um composto. Uma vez que a estrutura e a função das moléculas estão intimamente relacionadas, a capacidade de decifrar a estrutura tridimensional de um composto é extremamente útil para uma variedade de aplicações químicas e farmacêuticas. Pesquisadores e empresas farmacêuticas usam a cristalografia de raios-X para determinar a estrutura das proteínas para examinar como pequenas moléculas interagem com enzimas com o propósito de descoberta e design de medicamentos. A cristalografia de raios-X 3-5 também é um dos métodos mais úteis para avaliar complexos metálicos. Esta técnica divulga uma visão valiosa sobre como os metais interagem uns com os outros e seus ligantes. A primeira ligação quintupla identificada entre dois átomos de cromo foi identificada usando cristalografia de raios-X. 6 Esta técnica também pode ser usada para explicar as propriedades luminescentes dos complexos metálicos. 7 A cristalografia também tem sido amplamente utilizada na química ho-guest, pois este método tem sido fundamental para revelar informações valiosas sobre interações não covalentes entre moléculas. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Gilman, J. J., The art and science of growing crystals. Wiley: (1963).
- Orvig, C., A simple method to perform a liquid diffusion crystallization. Journal of Chemical Education 62 (1), 84 (1985).
- Brown, C. S.; Lee, M. S.; Leung, D. W.; Wang, T.; Xu, W.; Luthra, P. et. al. In silico derived small molecules bind the filovirus VP35 protein and inhibit its polymerase co-factor activity. Journal of molecular biology, 426 (10), 2045-2058 (2014)
- Batt, S. M.; Jabeen, T.; Bhowruth, V.; Quill, L.; Lund, P. A.; Eggeling et. al. Structural basis of inhibition of Mycobacterium tuberculosis DprE1 by benzothiazinone inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,109 (28), 11354-9 (2012)
- Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield et al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry 58 (14), 5599-5608 (2015)
- Nguyen, T.; Sutton, A. D.; Brynda, M.; Fettinger, J. C.; Long, G. J.; Power, P. P., Synthesis of a Stable Compound with Fivefold Bonding Between Two Chromium(I) Centers. Science310 (5749), 844-847 (2005).
- Chen, K.; Nenzel, M. M.; Brown, T. M.; Catalano, V. J., Luminescent Mechanochromism in a Gold(I)-Copper(I) N-Heterocyclic Carbene Complex. Inorganic Chemistry 54 (14), 6900-6909.(2015).
- Franco, J. U.; Hammons, J. C.; Rios, D.; Olmstead, M. M., New Tetraazaannulene Hosts for Fullerenes. Inorganic Chemistry49 (11), 5120-5125 (2010).
