Overview
מקור: המעבדה של ד"ר ג'ימי פרנקו - מכללת מרימק
קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא שיטה המשמשת בדרך כלל לקביעת הסידור המרחבי של אטומים במוצק גבישי, המאפשר קביעת הצורה התלת ממדית של מולקולה או קומפלקס. קביעת המבנה התלת מימדי של תרכובת היא בעלת חשיבות מיוחדת, שכן המבנה והתפקוד של המתחם קשורים קשר הדוק. מידע על המבנה של המתחם משמש לעתים קרובות כדי להסביר את ההתנהגות שלה או תגובתיות. זוהי אחת הטכניקות השימושיות ביותר לפתרון המבנה התלת מימדי של מתחם או מורכב, ובמקרים מסוימים זו עשויה להיות השיטה היחידה בת קיימא לקביעת המבנה. גידול גבישים באיכות קרני רנטגן הוא המרכיב העיקרי בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. גודלו ואיכותו של הגביש תלויים לעתים קרובות מאוד בהרכב המתחם הנבדק על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. בדרך כלל תרכובות המכילות אטומים כבדים יותר לייצר דפוס עקיפה גדול יותר, ובכך דורשים גבישים קטנים יותר. בדרך כלל, גבישים בודדים עם פרצופים מוגדרים היטב הם אופטימליים, ובדרך כלל עבור תרכובות אורגניות, הגבישים צריכים להיות גדולים יותר מאלה המכילים אטומים כבדים. ללא גבישים מעשיים, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן אינה ריאלית. חלק מהמולקולות הן גבישיות יותר מטבען מאחרות, ולכן הקושי להשיג גבישים באיכות קרני רנטגן יכול להשתנות בין תרכובות. הצמיחה של גבישי רנטגן דומה לתהליך של recrystallization המשמש בדרך כלל לטיהור תרכובות, אבל עם דגש על ייצור גבישים באיכות גבוהה יותר. לעתים קרובות, גבישים באיכות גבוהה יותר ניתן להשיג על ידי מתן אפשרות לתהליך התגבשות להמשיך לאט, אשר עלול להתרחש במהלך יום או חודשים.
Principles
ישנן מספר שיטות לגידול גבישי רנטגן, כגון חימום וקירור, אידוי, ו דיפוזיה אדים, כל אחד עם היתרונות והמגבלות שלו. 1 המתוארת כאן היא אחת השיטות השימושיות ביותר לגידול גבישים באיכות קרני רנטגן, דיפוזיה נוזלית נוזלית. 2 צמיחת גביש רנטגן מוצלחת תלויה בבחירה הנכונה של ממיסים. המתחם חייב להיות מסיס בממס אחד אבל מסיס באחר. דיפוזיה נוזלית-נוזלית כרוכה בשכבות בזהירות ממס בצפיפות נמוכה על גבי ממס בצפיפות גבוהה יותר בצינור דק, כגון צינור NMR. קצב הדיפוזיה יכול להשפיע מאוד על גודלם ואיכותם של הגבישים - דיפוזיה מהירה מעדיפה גבישים קטנים יותר, בעוד דיפוזיה איטית מעדיפה את הצמיחה של גבישים גדולים ואיכותיים יותר. ניצול של צינורות דקים, כגון צינורות NMR, מאט את התפשטות הממסים, ובכך יוצר סביבה המאפשרת צמיחה של גבישים באיכות גבוהה יותר. ממיסים נפוצים עבור השכבה התחתונה, אשר המתחם מומס, הם מתילן כלוריד או כלורופורם. המתחם מומס בממס פחות צפוף, אבל זה יכול להוכיח בעייתי כמו הממס העליון יכול להתחיל להתאדות לפני היווצרות הגביש. המצב האופטימלי הוא שהתרכובות יתמוססו בממס הצפוף יותר. השכבה העליונה היא אנטי ממס או משקעים. בשימוש תכוף נגד ממסים הם hexane, pentane, אתר diethyl, או מתנול. לאחר שני הממיסים כבר בשכבות בקפידה, הם רשאים לפזר לאט אחד לתוך השני. המתחם הופך פחות מסיס בתמיסה הבינארית, להקל על היווצרות גבישי רנטגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הכנת צינור הבדולח והמסנן
- מניחים צינור NMR בבקבוק ארלנמייר.
- הכן מסנן פיפטה.
- בנו את המסנן על ידי הנחת חתיכת מגבון ללא מוך (1 אינץ' על 1 אינץ') בפיפטה, ולאחר מכן השתמשו במוט כדי לתקוע בחוזקה את המגבון בחלק צוואר הבקבוק של הפיפטה(איור 1).
- הפוך שני מסנני פיפטה לכל צינור גביש צורך.
2. הוספת הדגימה לצינור הקריסטל
- ממיסים את התרכובת (טטרפנילפורפירין, 10 מ"ג) ב-0.75 מ"ל של ממס (דיכלורומתאן).
- עם פיפטה, מוסיפים בעדינות את התערובת לחלק העליון של הצינור, על ידי העברתו דרך המסנן.
- החלקיקים מסוננים כדי למנוע יצירת אתרי התגרענות, אשר יכול להוביל גבישים מרובים קטנים במקום גבישים יחיד גדול יותר הרצוי.
- לאחר המדגם הונח בצינור הגביש, לאט ובעדינות רבה, להוסיף את אנטי ממס (1.5 מ"ל של מתנול) לצינור באמצעות pipette מסנן חדש. אפשרו לאנטי-ממס לשכב באיטיות על הפתרון שנוסף בעבר (איור 2). אין להשתמש בנורה כדי לדחוף את הממס דרך הפיפטה, במקום זאת לאפשר לממס לזרום דרך המסנן בפני עצמו.
- ודא כי ממס של צפיפות גבוהה יותר מתווסף צינור הגביש הראשון.
- בדוק כי שני הממסים הם miscible אחד עם השני. זה נעשה לפני הוספת הממס.
- לאטום את הצינור עם כובע NMR.
3. צמיחת קריסטל
- מבלי לגרום לשני הממיסים להתערבב, מניחים את צינורות הקריסטל בארון שבו הם לא יופרעו.
- זמן ההתגבשות ישתנה עם כל תרכובת - בדרך כלל צינורות הקריסטל צריכים להישאר ללא הפרעה במשך שבוע.
- לאחר שבוע, לבדוק את הצינורות לצמיחת גביש.
- צמיחת גביש מתרחשת בדרך כלל בממשק של שני הממיסים.
- בדוק חזותית את הצינורות לראיות לצמיחת גביש. היזהר לא להקל על ערבוב של הממסים, במקרה המתחם דורש זמן נוסף להיווצרות קריסטל.
- אם נראה כי צמיחת הגביש התרחשה, בדוק עוד יותר את הצינורות באמצעות מיקרוסקופ.
4. בחירת קריסטל
- גבישי עקיפה של קרני רנטגן צריכים להיות פנים מוגדרות היטב.
- יש להימנע מגבישים שהתקבצו יחד במידת האפשר.
- השאירו את הגבישים בצינור הגביש עד שיהיו מוכנים לקצור את הגביש, מיד לפני הנחת הגביש על הדיפרקטומטר.
- שמירה על הגבישים בצינור תבטיח שהגבישים יישארו פתים. טיהור יכול לגרום גבישים להיסדק, ולעכב את עקיפה של הגביש.
איור 1. תמונה של מסנן הפיפטה. חתיכה קטנה של מגבון ללא מוך נתקעה בחוזקה על צוואר הבקבוק של הפיפטה. הפתרונות מועברים למרות מסנני פיפטה אלה לפני שהוצגו לצינור הגביש.
איור 2. ברגע הפתרון המכיל תרכובת ממוקדת ממוקם בצינור הגביש, האנטי ממס הוא שכבה איטית על גבי על ידי העברת אותו דרך מסנן פיפטה חדש.
גביש יחיד נדרש לקביעת המבנה שלו. איכות הגביש משפיעה במידה רבה על איכות ודיוק הקביעה המבנית.
גביש יחיד הוא מוצק שבו סידור המולקולות חוזר על עצמו בכל שלושת הממדים. הסידור המרחבי של האטומים בתוך המוצק הגבישי ניתן לקבוע באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. בטכניקה זו, מדגם גבישי טהור עטוף על ידי קרן של צילומי רנטגן. הקריסטל מנטרל את צילומי הרנטגן בתבנית ייחודית הקשורה למבנה הגבישים וההרכב המולקולרי. אם נוצר גביש מהר מדי, המולקולות עלולות להיות מופרעות, זיהומים עשויים להיות משולבים בגביש, או שני גבישים מותכים או יותר עשויים להיווצר במקום גבישי אחד. לכן, שיטות מיוחדות עם דגש על צמיחה איטית נדרשים כדי לייצר גבישים באיכות מספקת עבור קריסטלוגרפיה רנטגן.
וידאו זה ימחיש את המאפיינים הרצויים של גבישי איכות רנטגן, להדגים הליך לגידולם, ולהציג כמה יישומים של טכניקה זו בכימיה.
אלקטרונים מפזרים צילומי רנטגן על ידי פליטת גל רנטגן כדורי בעת הפגיעה. אם האטומים נמצאים בסידור מסודר, הפרעה בונה בין הגלים מייצרת תבנית עקיפה אופיינית בגלאי רנטגן. הגביש מסתובב בתוך הקרן כדי לאסוף דפוסי עקיפה מזוויות מרובות. עם דפוסי עקיפה מספיקים, המבנה המולקולרי יכול להיגזר.
גבישים באיכות קרני רנטגן יוצרים בדרך כלל צורות סימטריות ויש להם פנים חלקות ומשקפות אור. כאשר נצפו תחת מיקרוסקופ מקוטב, הם יהיו שקופים, אבל רובם צריכים להיות כהים כאשר מסובבים 90°. זה מצביע על מבנה מסודר מאוד. כדי לגדל גבישים אלה, דיפוזיה נוזלי נוזלי משמש לעתים קרובות. זה מעסיק שני ממיסים מטעים: ממס בצפיפות נמוכה, או משקעים, שבו המתחם להיות recrystallized הוא מסיס; וממס בצפיפות גבוהה שבו המתחם מסיס. בדרך כלל, היחס הנפחי של משקעים לממס הוא 2:1.
המשקעים בצפיפות נמוכה הוא שכבתי על פתרון מרוכז של המתחם בממס בצפיפות גבוהה. עם הזמן, המתחם הופך פחות מסיס כמו המשקעים מתערבב עם הפתרון. ממשק ממס קטן יותר גורם לקצב איטי יותר של דיפוזיה, ובכך מניב גבישים גדולים וטהור יותר. עכשיו שאתם מבינים את העקרונות של גידול גבישים באיכות קרני רנטגן, בואו נעבור הליך לגידולם על ידי דיפוזיה נוזלית נוזלית.
כדי להתחיל, השג את הציוד הדרוש שנמצא בפרוטוקול הטקסט. לרכוש ממס עבור המתחם ומזרז פחות צפוף.
כדי להכין מסנן פיפטה, מניחים חתיכה קטנה של Kimwipe לחלק העליון של פיפטה זכוכית בעדינות ללחוץ על הנייר עד לתחתית גוף הפיפטה באמצעות מוט או גבעול של פיפטה אחרת, נזהר לא לנקב את הנייר. הכן שני מסנני פיפטה. הנח אחד לתוך צינור NMR. במידת הצורך, אבטחו את ההרכבה עם מהדק מעבדה ומעמד טבעת. להמיס כ 10 מ ג של המתחם להיות recrystallized ב 0.75 מ"ל של ממס.
עכשיו, בזהירות להוסיף את הפתרון לדוגמה לתוך מסנן pipette. הדביק נורה למעלה ולחץ לאט כדי להעביר את הפתרון לתוך צינור NMR כדי להסיר זיהומים מוצקים. אל תאפשר הנורה להתרחב מחדש בזמן שהיא מחוברת, כמו היניקה יהיה לנטרל את נייר המסנן.
לאחר מכן, הסר את מסנן הפיפטה המשומש והצב את המסנן השני בצינור NMR. פיפטה כ 1.5 מ"ל של משקעים לתוך הצינור. אפשר לממס לעבור דרך המסנן לפי כוח המשיכה. מעתה והלאה, יש להקפיד לא להפריע למסנן במהלך כל מניפולציות. לאחר שכל המשקעים מסוננים לתוך הצינור, להסיר את המסנן ואת מכסה את הצינור. מניחים אותו בארון או במקום אחר שנבדק בקלות שבו הוא לא יהיה נסער.
לאחר יום אחד לפחות, לבדוק את הצינורות לצמיחת גביש. אם אין גבישים או הגבישים קטנים מאוד, להשאיר את צינור הדגימה ללא הפרעה. אם גבישים נראים לעין, לבדוק את גודלם ואת צורתם מבלי להפריע שכבות הממס.
אם הגבישים גדולים, מוגדרים היטב ואינם מקובצים יחד, בדקו את הגבישים תחת מיקרוסקופ כדי לאמת את הפוטנציאל שלהם להיות באיכות קרני רנטגן. אין להסיר את הגבישים מהצינור עד שהדיפרקומטר מוכן להתחיל בסריקה. אם מולקולות ממס משולבות במבנה הגביש, מתן אפשרות לקריסטל להתייבש יפרק את הגביש. באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, המבנה המולקולרי של גבישים אדמדמים-סגולים כהים אלה אומת כטרפנילפורפירין.
קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא כלי אנליטי חיוני בכימיה וביוכימיה.
שיטות ריסטרסטלציה כוללות חימום וקירור, דיפוזיה נוזלית נוזלית, דיפוזיה של אדים ואידוי איטי. באידוי איטי של מערכת ממס אחת, המתחם מומס בכמות קטנה של ממס ומניחים במיכל עם חור קטן במכסה. כאשר הממס מתאדה, הריכוז עולה עד שהתרכובת מתחילה להתגבש.
הפונקציונליות של חלבונים קשורה לעתים קרובות למבנה שלהם. עם זאת, חלבונים יכולים להיות קשים מאוד לגיבש. יש לפתח טכניקות מיוחדות כדי לגדל גבישים באיכות רנטגן של חלבונים. כאן, טיפה של פתרון חלבון מעורבב עם טיפה של משקעים תערובת זו אטומה בחדר עם משקעים טהורים. כאשר אדי הממס מתפזרים מהטיפה, המסיסות של החלבון בטיפה פוחתת, והחלבון מתגבש לאט. טכניקה נוספת מערבבת את תמיסת החלבון ואת המשקעים תחת שמן מינרלי. באמצעות טכניקות אלה, מגוון של חלבונים ניתן לגבש לניתוח.
עקיפה אבקה, כל כיוון מרחבי אפשרי מיוצג במדגם בו זמנית. עקיפה אבקה היא לא אינפורמטיבית על מבנה כמו עקיפה רנטגן קריסטל יחיד בגלל אובדן נתוני מבנה תלת מימדי. במקום זאת, עקיפה אבקה מצטיינת בניתוח תערובות של מוצקים גבישיים והערכת הגבישיות של מבנים אמורפיים.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לגידול גבישים לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עכשיו אתה צריך להכיר את המאפיינים של גבישים באיכות רנטגן, הליך לגידול אותם, וכמה יישומים של טכניקה זו בכימיה.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
הטכניקה של דיפוזיה נוזלית-נוזלית שימשה ליצירת גבישים באיכות קרני רנטגן של טטרפנילפורפירין. באמצעות dichloromethane כמו ממס מתנול כמו אנטי ממס, הנוזלים הורשו מפוזרים לאט במשך שבוע מבלי להיות מופרע. גבישים סגולים-אדמדמים גדולים, מוגדרים היטב, נוצרו בממשק של שני הממיסים (איור 3). הצמיחה של הגבישים ניתן לראות חזותית. הגבישים גדלו עם פרצופים מוגדרים היטב, אשר ניתן לראות עם מיקרוסקופ.
איור 3. גבישי איכות עקיפה של קרני רנטגן של TPP. יש להימנע מגבישים הגושמים זה מזה או צומחים זה מזה. גבישים בודדים גדולים עם פרצופים מוגדרים היטב בדרך כלל מניבים תוצאות טובות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
גבישים באיכות קרני רנטגן יכולים לגדול על ידי דיפוזיה נוזלית נוזלית. דיפוזיה איטית של מערכת הממס הבינארית מאפשרת יצירת גבישים המתאימים לעקיפת קרני רנטגן. שיטה זו מאפשרת לסריג הגביש להיווצר לאט, ולעתים קרובות מובילה גבישים גדולים ומוגדרים יותר. השימוש בצינורות NMR מקל על דיפוזיה איטית של הממסים, ומאפשר צמיחת גביש אופטימלית. תהליך זה יכול להימשך בין כמה ימים למספר חודשים. לעתים קרובות במהלך תהליך התגבשות מולקולות ממס משולבים לתוך סריג הגביש. לכן חשוב להימנע מלאפשר גבישים "להתייבש". לכן, אחד היתרונות של דיפוזיה נוזלית-נוזלית הוא כי הגבישים בדרך כלל לגדול בממשק של שני ממיסים, אשר עוקף את התופעה.
דיפוזיה נוזלית-נוזלית היא אחת הטכניקות השימושיות ביותר לייצור גבישים באיכות קרני רנטגן, שהיא המרכיב החיוני ביותר בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. השגת גבישים באיכות קרני רנטגן היא בדרך כלל הגורם המגביל לעריכת ניסויי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן יוצרת למעשה תמונה תלת ממדית של מבנה המולקולה, מה שהופך אותה לשיטה הפחות מעורפלת לקביעת התצורה המלאה של תרכובת. מכיוון שמבנה ותפקוד של מולקולות קשורים קשר הדוק, היכולת לפענח את המבנה התלת מימדי של המתחם שימושית מאוד למגוון יישומים כימיים ותרופות. חוקרים וחברות תרופות משתמשים בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן כדי לקבוע את מבנה החלבונים כדי לבחון כיצד מולקולות קטנות מתקשרות עם אנזימים לצורך גילוי ועיצוב תרופות. קריסטלוגרפיה של 3-5 קרני רנטגן היא גם אחת השיטות השימושיות ביותר להערכת מתחמי מתכת. טכניקה זו מחשה תובנות חשובות על האופן שבו מתכות מתקשרות זו עם זו ועם הליבנדים שלה. הקשר הראשון שזוהה אי פעם בין שני אטומי כרום זוהה באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. 6 טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי להסביר את המאפיינים הזוהרים של מתחמי מתכת. 7 קריסטלוגרפיה הייתה גם בשימוש נרחב בכימיה מארח-אורח, כמו שיטה זו כבר אינסטרומנטלי בחשיפת מידע רב ערך על אינטראקציות שאינן covalent בין מולקולות. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Gilman, J. J., The art and science of growing crystals. Wiley: (1963).
- Orvig, C., A simple method to perform a liquid diffusion crystallization. Journal of Chemical Education 62 (1), 84 (1985).
- Brown, C. S.; Lee, M. S.; Leung, D. W.; Wang, T.; Xu, W.; Luthra, P. et. al. In silico derived small molecules bind the filovirus VP35 protein and inhibit its polymerase co-factor activity. Journal of molecular biology, 426 (10), 2045-2058 (2014)
- Batt, S. M.; Jabeen, T.; Bhowruth, V.; Quill, L.; Lund, P. A.; Eggeling et. al. Structural basis of inhibition of Mycobacterium tuberculosis DprE1 by benzothiazinone inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,109 (28), 11354-9 (2012)
- Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield et al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry 58 (14), 5599-5608 (2015)
- Nguyen, T.; Sutton, A. D.; Brynda, M.; Fettinger, J. C.; Long, G. J.; Power, P. P., Synthesis of a Stable Compound with Fivefold Bonding Between Two Chromium(I) Centers. Science310 (5749), 844-847 (2005).
- Chen, K.; Nenzel, M. M.; Brown, T. M.; Catalano, V. J., Luminescent Mechanochromism in a Gold(I)-Copper(I) N-Heterocyclic Carbene Complex. Inorganic Chemistry 54 (14), 6900-6909.(2015).
- Franco, J. U.; Hammons, J. C.; Rios, D.; Olmstead, M. M., New Tetraazaannulene Hosts for Fullerenes. Inorganic Chemistry49 (11), 5120-5125 (2010).
