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Cromatografia su colonna

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr. Jimmy Franco - Merrimack College

La cromatografia su colonna è una delle tecniche più utili per purificare i composti. Questa tecnica utilizza una fase stazionaria, che è impacchettata in una colonna, e una fase mobile che passa attraverso la colonna. Questa tecnica sfrutta le differenze di polarità tra i composti, permettendo alle molecole di essere facilmente separate. 1 Le due fasi stazionarie più comuni per la cromatografia su colonna sono il gel di silice (SiO2) e l'allumina (Al2O3), con le fasi mobili più comunemente utilizzate come solventi organici. 2 Il solvente o i solventi scelti per la fase mobile dipendono dalla polarità delle molecole da purificare. Tipicamente più composti polari richiedono più solventi polari per facilitare il passaggio delle molecole attraverso la fase stazionaria. Una volta completato il processo di purificazione, il solvente può essere rimosso dalle frazioni raccolte utilizzando un evaporatore rotante per produrre il materiale isolato.

Principles

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La miscela campione viene posizionata sulla parte superiore della colonna e assorbita sulla parte superiore della fase stazionaria. Successivamente, la fase mobile viene applicata alla colonna e utilizzata per eluire la miscela attraverso la fase stazionaria. La cromatografia su colonna sfrutta la polarità di una molecola per separare i composti. La differenza di polarità porta a variazioni nella velocità con cui le molecole viaggiano attraverso la colonna, che separa efficacemente i composti l'uno dall'altro. La fase mobile viene raccolta in piccole frazioni in provette mentre eluisce dalla colonna, consentendo così l'isolamento e la purificazione dei composti. Infine, il solvente viene rimosso utilizzando un evaporatore rotativo per produrre il composto o i composti isolati.

La versatilità e la praticità della cromatografia a colonna l'hanno resa una delle tecniche più utilizzate per purificare i composti. A differenza della ricristallizzazione (un'altra tecnica di purificazione comunemente usata) i composti purificati con cromatografia su colonna non devono essere solidi. La cromatografia su colonna è anche in grado di isolare un numero di composti da una miscela. Un altro vantaggio del cromatografo a colonna è che si sa molto poco sulle proprietà fisiche del composto per utilizzare questo metodo di purificazione, rendendo questa tecnica molto preziosa quando si sintetizzano o isolano nuovi composti, in cui si sa poco sui composti.

Solvente

La velocità con cui un composto attraversa la colonna dipende fortemente dalla fase mobile utilizzata. In genere, più polare è il solvente, più velocemente i composti passeranno attraverso la colonna. I solventi polari hanno una maggiore affinità per la fase solida, limitando le interazioni tra il composto o i composti e la fase solida, consentendo ai composti di eluire più rapidamente. Occorre prestare attenzione per garantire che il sistema solvente scelto per la cromatografia su colonna abbia la polarità appropriata per creare separazione tra i composti nella miscela. La scelta del solvente è fondamentale per una separazione di successo utilizzando la cromatografia su colonna. Per identificare un sistema solvente ottimale, è necessario condurre una serie di esperimenti di cromatografia su strato sottile (TLC) prima di eseguire l'esperimento di cromatografia su colonna. In alcuni casi potrebbe essere necessario utilizzare un sistema binario a solvente.

Selezione di un sistema a solvente

  1. Identificare un sistema solvente che produce un fattore di ritardo (Rf ) compreso tra 0,2-0,3 per il composto desiderato su una piastra TLC.
  2. Inizia con acetato di etile o diclorometano come fase mobile per l'esperimento TLC.
    1. Se R f è maggiore di 0,3, provare meno solvente polare, come l'esano. Se la Rf è inferiore a 0,2, provare ad aggiungere una piccola quantità di un solvente polare come il metanolo.
    2. Il sistema di solventi ottimale può richiedere una miscela di due solventi.
    3. Fare attenzione a non utilizzare più del 10% di metanolo come fase mobile per una colonna di silice.

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Procedure

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1. Liquame di gel di silice

  1. Versare il gel di silice in un matraccio Erlenmeyer. Il peso del materiale d'imballaggio deve essere circa 50 volte quello del campione da separare. Se i composti separati hanno valori Rf molto simili, potrebbe essere necessario utilizzare una maggiore quantità di silice per campione, come nel caso di questo esempio.
    1. Posizionare 10 g di silice nel matraccio Erlenmeyer, poiché 50 mg di campione (45 mg di fluorenone e 5 mg di tetrafenilporfirina) vengono isolati.
  2. Aggiungere il sistema solvente (esano/diclorometano, 70%: 30%) al matraccio Erlenmeyer contenente il gel di silice. Aggiungere abbastanza solvente per garantire che tutto il gel di silice sia ben solvatato. La silice non si dissolverà, ma la miscela sarà visivamente evidente quando viene solvata. Una volta aggiunto il solvente, ruotare il matraccio Erlenmeyer per garantire che tutta la silice sia ben solvata.

2. Preparazione della colonna

  1. Selezionare la colonna di dimensioni appropriate. In genere la colonna deve essere riempita circa a metà strada con liquame di gel di silice. Più grande è il campione da purificare, maggiore è la colonna richiesta.
  2. Tappare il fondo della colonna con un pezzo di lana di vetro. Usando un'asta lunga, assicurati che la lana sia saldamente alloggiata nella parte inferiore della colonna appena sopra il rubinetto.
  3. Una volta che la lana è saldamente in posizione, applicare un sottile strato di sabbia sulla lana di vetro.
    Nota: Se la colonna è dotata di una fritta di vetro sopra il rubinetto, questo passaggio dovrebbe essere omesso.
  4. Bloccare la colonna in posizione verticale a un supporto ad anello.
  5. Usando un imbuto, versare delicatamente il liquame preparato di gel di silice nella colonna. Potrebbe essere necessario aggiungere ulteriore solvente per trasferire il liquame dal matraccio Erlenmeyer alla colonna. Usando una pipetta, lavare qualsiasi gel di silice che si attacca ai lati della colonna.
    1. Mentre il gel di silice si deposita nella colonna, picchiettare delicatamente i lati della colonna per assicurarsi che il gel di silice si impacchetta strettamente ed escluda eventuali bolle d'aria.
  6. Aprire il rubinetto e lasciare che il solvente si scarichi in un matraccio Erlenmeyer pulito fino a poco prima che il gel di silice e il fronte del solvente si incontrino. Il gel di silice non dovrebbe mai asciugarsi fino al completamento della procedura.
  7. Posizionare un sottile strato di sabbia sopra il gel di silice (Figura 1). Usando una pipetta, lavare via tutta la sabbia che potrebbe essersi attaccata ai lati della colonna.
  8. Scolare qualsiasi solvente aggiuntivo fino a quando la sabbia non è asciutta, ma non fino allo strato di gel di silice.

Figure 1
Figura 1. La configurazione corretta per un esperimento di cromatografia su colonna prima dell'aggiunta del campione.

3. Aggiunta dell'esempio alla colonna

  1. Sciogliere il campione nella minor quantità possibile di solvente (utilizzando lo stesso solvente utilizzato per produrre il liquame di gel di silice).
  2. Utilizzando una pipetta, aggiungere delicatamente il campione nella parte superiore della colonna.
  3. Una volta che il campione è stato applicato sulla parte superiore della colonna, aprire il rubinetto e lasciare che il solvente dreni attraverso lo strato di sabbia ma non lo strato di gel di silice. Utilizzare una quantità molto piccola di solvente per lavare qualsiasi campione che potrebbe essersi aggrappato ai lati della colonna. Scolare questo solvente aggiuntivo anche attraverso lo strato di sabbia.

4. Eluire il campione attraverso la colonna

  1. Usando una pipetta, aggiungere molto delicatamente 4-5 ml di solvente in modo tale da non disturbare lo strato di sabbia.
  2. Posizionare un imbuto nella parte superiore della colonna e riempire molto lentamente e delicatamente il resto della colonna con solvente.
  3. Aprire il rubinetto e lasciare che il solvente scarichi attraverso la colonna.
  4. Inizia a raccogliere la fase mobile mentre drena dalla colonna in provette.
    1. Le provette devono essere collocate in una griglia per provette in modo sequenziale.
  5. Aggiungere ulteriore solvente nella parte superiore della colonna secondo necessità fino a quando tutti i composti desiderati non sono stati eluiti dalla colonna.

5. Recupero dei costituenti

  1. Se i composti sono colorati, possono essere identificati visivamente. Tuttavia, se i composti sono incolori, dovranno essere identificati utilizzando la luce ulta-visibile (UV) (se i composti contengono coniugazione) o con la macchia appropriata. La purezza dei composti può essere verificata utilizzando la cromatografia a strato sottile.
  2. Identificare le provette che contengono i composti desiderati.
  3. Unire tutte le frazioni che contengono il composto o i composti isolati desiderati in un matraccio a fondo tondo (RB) prepesato. Fallo per ogni composto isolato.
  4. Evaporare il solvente posizionando il pallone RB sull'evaporatore rotante.
  5. Una volta rimosso tutto il solvente, pesare il RB con il prodotto essiccato e sottrarre il peso iniziale del RB per ottenere una resa.

La cromatografia su colonna è un metodo di purificazione versatile utilizzato per separare i composti in una soluzione. Una miscela di soluzione viene trasportata da un solvente attraverso una colonna contenente un solido adsorbente, chiamato fase stazionaria. La miscela combinata di solvente e campione è chiamata fase mobile.

Le molecole nella fase mobile viaggiano attraverso la colonna a velocità diverse in base alle loro proprietà chimiche e alla loro affinità per la fase stazionaria. Pertanto, ogni composto esce dalla colonna in un momento diverso. Una volta che i composti sono stati separati e purificati, possono essere ulteriormente lavorati o sono pronti per la distribuzione. Questo video introdurrà le basi della cromatografia su colonna, quindi dimostrerà la tecnica con la purificazione dei composti organici.

Nella cromatografia su colonna, le molecole assorbono reversibilemente alla fase stazionaria mentre fluiscono attraverso la colonna, rallentando così il loro progresso. I composti che interagiscono debolmente con la fase stazionaria sono più veloci per uscire dalla colonna o eluire. I composti che interagiscono fortemente con la fase stazionaria sono più lenti da eluire. La fase stazionaria è una polvere adsorbente o gel come gel di silice o allumina. Il gel di silice e l'allumina sono altamente polari, quindi interagiscono fortemente con composti e solventi polari e debolmente con molecole non polari. La fase stazionaria viene caricata nella colonna come un liquame con il solvente e viene quindi imballata facendo scorrere il solvente attraverso la fase stazionaria. Se adeguatamente imballata, la fase stazionaria è omogenea dall'alto verso il basso e non contiene bolle d'aria o macchie secche, poiché il flusso irregolare causato da queste irregolarità interferisce con la separazione dei composti. Il solvente, o eluente, è in genere un solvente organico fornito da un serbatoio. In generale, i solventi non polari eluiscono solo composti non polari, mentre i solventi polari eluiscono sia composti polari che non polari. Se una miscela contiene composti di polarità significativamente diverse, una serie di solventi sempre più polari può essere utilizzata per eluire tutti i composti di interesse. La portata di fase mobile è solitamente controllata da un rubinetto nella parte inferiore della colonna. Le pause nel flusso sono ridotte al minimo per evitare la diffusione dei composti. La fase mobile che esce dalla colonna, chiamata eluato, viene raccolta in frazioni per preservare la separazione dei composti. Ora che hai capito i principi della cromatografia su colonna, passiamo attraverso una procedura per la purificazione di una miscela di composti organici.

Per iniziare la procedura, ottenere l'attrezzatura come indicato nel testo. Pesare un matraccio a fondo tondo per ogni composto da isolare e registrare la massa. Quindi, pesare il campione e scioglierlo nel volume minimo di solvente necessario. Il solvente appropriato deve essere predeterminato utilizzando la cromatografia a strato sottile. Il valore Rf deve essere compreso tra 0,2 e 0,3. Quindi, determinare la quantità di gel di silice necessaria per la fase stazionaria in base al peso secco del campione e alla differenza nella distanza di migrazione dei composti di interesse in base al pre-screening TLC. Versare la quantità appropriata di gel di silice in un matraccio Erlenmeyer. Aggiungere il solvente al gel di silice fino a quando il liquame è traslucido e si muove liberamente quando il pallone è ruotato. Quindi, selezionare una colonna abbastanza grande che il gel di silice lo riempirà a metà strada. Se la colonna non ha una fritta di vetro, posizionare la lana di vetro nella colonna e premerla saldamente sul fondo con una lunga asta. Coprire la lana di vetro con circa 2 cm di sabbia per evitare che la silice passi attraverso la lana di vetro. In una cappa aspirante bloccare la colonna a un supporto ad anello, lasciando spazio sufficiente sotto per ospitare le provette.

Posizionare un imbuto nella colonna e assicurarsi che il rubinetto sia chiuso. Versare il liquame nella colonna, picchiettando delicatamente i lati mentre il liquame si deposita per escludere bolle d'aria. Risciacquare l'imbuto, il pallone e le pareti della colonna con solvente per trasferire tutto il gel nella colonna.

Posizionare un matraccio Erlenmeyer sotto la colonna. Aprire il rubinetto e lasciare che il solvente scarichi nel pallone fino a quando il livello del solvente è appena sopra il gel di silice, quindi chiudere il rubinetto. Versare circa 2 cm di sabbia sul gel. Risciacquare delicatamente la sabbia attaccata ai lati della colonna con solvente. Scolare il solvente secondo necessità in modo che la sabbia sia per lo più asciutta, ma la silice rimane completamente coperta.

Per avviare la separazione, aggiungere il campione alla colonna senza disturbare la sabbia. Utilizzare piccole porzioni di solvente per risciacquare qualsiasi campione aderente alle pareti della colonna e per risciacquare il contenitore del campione. Scolare con attenzione il solvente fino a quando il livello è appena sopra la silice. Quindi, con una pipetta, aggiungere delicatamente 4-5 ml di solvente senza disturbare lo strato di sabbia. Posizionare un imbuto nella colonna e riempire lentamente con solvente. Rimuovere il matraccio e sostituirlo con una provetta etichettata. Con la prima provetta in posizione, aprire il rubinetto e raccogliere l'eluato fino a quando la provetta non è quasi piena.

Continuare a raccogliere frazioni fino a quando tutti i composti desiderati sono stati eluiti, procedendo sequenzialmente attraverso le provette etichettate. Al termine, chiudere il rubinetto.

Per ogni composto isolato, unire le frazioni pure in un matraccio a fondo tondo prepesato. Rimuovere il solvente dal matraccio su un evaporatore rotante e quindi pesare il matraccio a fondo tondo contenente il composto secco. Per ulteriori informazioni, vedere il video di questa raccolta sull'evaporazione rotativa.

Questo campione conteneva una miscela di tetrafenilporfirina, o TPP, e fluorenone. Il TPP rosso-porpora scuro è stato eluito per primo, seguito dal fluorenone giallo. La purezza di ciascun composto isolato è stata confermata dalla spettroscopia NMR.

La cromatografia a colonna viene utilizzata nella purificazione e nell'analisi in una varietà di campi scientifici.

La cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, è una forma di cromatografia su colonna che fornisce un'eccellente separazione tra i composti e può incorporare rivelatori specializzati come un rilevatore di radiazioni per molecole radiomarcate. Usando l'HPLC, un fosfolipide radiomarcato può essere facilmente isolato da una miscela di molti altri anche se costituisce una piccola percentuale della miscela. Queste informazioni possono aiutare a chiarire la produzione, la regolazione e le funzioni di molte importanti biomolecole.

La cromatografia flash è una variante della cromatografia su colonna in cui la fase mobile si muove attraverso la colonna sotto la pressione dell'aria o del gas piuttosto che per il solo flusso gravitazionale.

Ciò crea una portata più veloce, riducendo al minimo la diffusione per una migliore separazione. Il composto desiderato viene raccolto in poche frazioni pure e concentrate, come mostrato con la cromatografia a strato sottile, con conseguente eccellente resa e purezza post-purificazione.

Il solito apparato a colonna non è appropriato per separare piccoli volumi, ma alcune miscele non sono compatibili con tecniche specializzate come l'HPLC. La purificazione su piccola scala viene eseguita con colonne di pipetta di vetro, con una lampadina a pipetta utilizzata per la cromatografia flash su piccola scala. Ciò è particolarmente utile quando si prepara un campione per tecniche di purificazione specializzate o come fase finale dopo la purificazione su larga scala.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla cromatografia a colonna. Ora dovresti avere familiarità con i principi della cromatografia su colonna, una procedura per la cromatografia su colonna di gel di silice e alcune applicazioni della tecnica.

Grazie per l'attenzione!

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Results

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Il campione contenente una miscela di tetrafenilporfirina (TPP, 5 mg) e fluorenone (45 mg) è stato separato con successo e ciascun composto è stato isolato. Il TPP eluiva prima la colonna come una banda viola-rossastra scura e il fluorenone successivamente eluiva dalla colonna come una banda gialla (Figura 2). Le frazioni eluite sono state raccolte in provette e identificate dai loro colori distintivi (Figura 3). Le frazioni contenenti i composti isolati sono state fuse in RB separati e il solvente è stato rimosso utilizzando un evaporatore rotativo per consentire TPP e fluorenone altamente puri. La purezza dei composti cromatografati è stata convalidata mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). I composti possono inoltre essere verificati dal punto di fusione, ma solo se il punto di fusione per il composto o i composti desiderati è stato precedentemente determinato.

Figure 2
Figura 2. Man mano che i composti attraversano la fase stazionaria, iniziano a separarsi. In questo esperimento il TPP (banda viola-rossastro scuro) viaggia attraverso la colonna leggermente più velocemente del fluorenone (banda gialla).

Figure 3
Figura 3. Man mano che i composti eluiscono dalla colonna, vengono raccolti in provette. I composti separati in questo esperimento sono colorati, in modo che possano essere identificati visivamente.

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Applications and Summary

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Sommario

La cromatografia su colonna è un metodo conveniente e versatile per purificare i composti. Questo metodo separa i composti in base alla polarità. Sfruttando le differenze nella polarità delle molecole, la cromatografia su colonna può facilmente separare i composti dalla velocità con cui i composti attraversano la fase stazionaria della colonna. Uno dei vantaggi della cromatografia su colonna (specialmente se confrontato con la ricristallizzazione) è che molto poco sui composti deve essere conosciuto prima del processo di purificazione. L'altro vantaggio dell'utilizzo della cromatografia su colonna è che può essere utilizzato per purificare sia i solidi che gli oli, mentre la ricristallizzazione può essere utilizzata solo per purificare i solidi. Questa tecnica può anche essere utilizzata per isolare un numero di composti da una miscela.

Applicazioni

La cromatografia su colonna è uno dei metodi più convenienti e ampiamente utilizzati per purificare i composti. Spesso, le reazioni sintetiche produrranno più prodotti e la cromatografia su colonna può essere utilizzata per isolare ciascuno dei composti per ulteriori esami. La cromatografia su colonna è estremamente preziosa quando si sintetizzano o isolano nuovi composti, poiché è necessario sapere molto poco su un composto e sulle sue proprietà fisiche prima del processo di purificazione.

L'industria farmaceutica utilizza abitualmente la cromatografia su colonna per purificare i composti come parte del suo processo di sviluppo di farmaci in fase iniziale. 3 Spesso in queste fasi preliminari i ricercatori costruiscono librerie di composti attorno a un composto di piombo, quindi successivamente usano la cromatografia a colonna per purificare i composti appena sintetizzati. 4 L'uso estensivo e la versatilità di questa tecnica di purificazione hanno spinto gli educatori a incorporare la tecnica nel curriculum universitario. 5,6

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References

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Transcript

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