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Organic Chemistry

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Cromatografia da Coluna

Overview

Fonte: Laboratório do Dr. Jimmy Franco - Merrimack College

A cromatografia da coluna é uma das técnicas mais úteis para purificar compostos. Esta técnica utiliza uma fase estacionária, que é embalada em uma coluna, e uma fase móvel que passa pela coluna. Esta técnica explora as diferenças de polaridade entre os compostos, permitindo que as moléculas sejam separadas de forma fácil. 1 As duas fases estacionárias mais comuns para cromatografia de coluna são gel de sílica (SiO2) e alumina (Al2O3),sendo as fases móveis mais utilizadas como solventes orgânicos. 2 Os solventes escolhidos para a fase móvel dependem da polaridade das moléculas serem purificadas. Tipicamente, compostos mais polares requerem mais solventes polares, a fim de facilitar a passagem das moléculas através da fase estacionária. Uma vez concluído o processo de purificação, o solvente pode ser removido das frações coletadas usando um evaporador rotativo para produzir o material isolado.

Principles

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A mistura de amostras é colocada na parte superior da coluna e absorvida na parte superior da fase estacionária. Posteriormente, a fase móvel é aplicada à coluna e usada para elutar a mistura através da fase estacionária. A cromatografia da coluna explora a polaridade de uma molécula para separar os compostos. A diferença de polaridade leva a variâncias na taxa em que as moléculas viajam através da coluna, o que efetivamente separa os compostos uns dos outros. A fase móvel é coletada em pequenas frações em tubos de ensaio à medida que se infiltra na coluna, permitindo assim o isolamento e purificação dos compostos. Por fim, o solvente é removido usando um evaporador rotativo para produzir os compostos isolados.

A versatilidade e conveniência da cromatografia da coluna tornou-a uma das técnicas mais utilizadas para purificar compostos. Ao contrário da recristalização (outra técnica de purificação comumente usada) os compostos purificados com cromatografia de coluna não precisa ser sólido. A cromatografia da coluna também é capaz de isolar uma série de compostos de uma mistura. Outra vantagem do cromatógrafo de coluna é que muito pouco precisa ser conhecido sobre as propriedades físicas do composto para usar esse método de purificação, tornando essa técnica muito valiosa ao sintetizar ou isolar novos compostos, nos quais pouco se sabe sobre o composto(s).

Solvente

A taxa em que um composto atravessa a coluna é altamente dependente da fase móvel que está sendo utilizada. Normalmente, quanto mais polar o solvente mais rápido os compostos passarão pela coluna. Os solventes polares têm maior afinidade com a fase sólida, limitando as interações entre os compostos e a fase sólida, permitindo que os compostos se estomem mais rapidamente. Deve-se ter cuidado para garantir que o sistema de solvente escolhido para a cromatografia da coluna tenha a polaridade apropriada para criar a separação entre os compostos da mistura. A escolha do solvente é crucial para a separação bem sucedida usando cromatografia de coluna. Para identificar um sistema de solvente ideal, uma série de experimentos de cromatografia de camada fina (TLC) devem ser realizados antes de realizar o experimento de cromatografia da coluna. Em alguns casos, pode ser necessário usar um sistema de solvente binário.

Selecionando um sistema solvente

  1. Identifique um sistema de solvente que produza um fator de retardo(Rf) entre 0,2-0,3 para o composto desejado em uma placa TLC.
  2. Comece com acetato de etila ou diclorometano como a fase móvel para o experimento TLC.
    1. Se o Rf for maior que 0,3, tente menos solvente polar, como hexano. Se o Rf for menor que 0,2, tente adicionar uma pequena quantidade de solvente polar, como o metanol.
    2. O sistema de solvente ideal pode exigir uma mistura de dois solventes.
    3. Tenha cuidado para não usar mais de 10% de metanol como fase móvel para uma coluna de sílica.

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Procedure

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1. Chorume de Gel de Sílica

  1. Despeje o gel de sílica em um frasco de Erlenmeyer. O peso do material de embalagem deve ser aproximadamente 50x o da amostra que está sendo separada. Se os compostos separados tiverem valores Rf muito semelhantes, então pode exigir o uso de uma quantidade maior de sílica por amostra, o que é o caso neste exemplo.
    1. Coloque 10 g de sílica no frasco de Erlenmeyer, uma vez que 50 mg de amostra (45 mg de fluorenona e 5 mg de tetrafenilaporfirina) estão sendo isolados.
  2. Adicione o sistema solvente (hexano/diclorometano, 70%: 30%) ao frasco de Erlenmeyer contendo o gel de sílica. Adicione solvente suficiente para garantir que todo o gel de sílica esteja bem solvado. A sílica não se dissolverá, mas a mistura será visualmente perceptível quando solvated. Uma vez que o solvente tenha sido adicionado redemoinho o frasco de Erlenmeyer para garantir que toda a sílica esteja bem solvada.

2. Preparação da Coluna

  1. Selecione a coluna de tamanho apropriado. Normalmente, a coluna deve ser preenchida a meio caminho com chorume de gel de sílica. Quanto maior a amostra ser purificada, maior a coluna necessária.
  2. Conecte a parte inferior da coluna com um pedaço de lã de vidro. Usando uma haste longa, certifique-se de que a lã está firmemente alojada na parte inferior da coluna logo acima da torneira.
  3. Uma vez que a lã esteja firmemente no lugar, aplique uma fina camada de areia sobre a lã de vidro.
    Nota: Se a coluna estiver equipada com um frit de vidro acima da torneira, este passo deve ser omitido.
  4. Fixar a coluna na posição vertical em um suporte de anel.
  5. Usando um funil, despeje delicadamente o chorume preparado de gel de sílica na coluna. Você pode precisar adicionar solvente adicional para transferir o chorume do frasco de Erlenmeyer para a coluna. Usando uma pipeta, lave qualquer gel de sílica que grude nas laterais da coluna.
    1. Como o gel de sílica está se estabelecendo na coluna, toque suavemente nas laterais da coluna para garantir que o gel de sílica embale firmemente e exclua quaisquer bolhas de ar.
  6. Abra a torneira e deixe o solvente drenar em um frasco erlenmeyer limpo até pouco antes do gel de sílica e do solvente dianteiro se encontrarem. O gel de sílica nunca deve secar até que o procedimento esteja concluído.
  7. Coloque uma fina camada de areia em cima do gel de sílica(Figura 1). Usando uma pipeta, lave qualquer areia que possa ter grudado nas laterais da coluna.
  8. Escorra qualquer solvente adicional até que a areia esteja seca, mas não até a camada de gel de sílica.

Figure 1
Figura 1. A configuração adequada para um experimento de cromatografia de coluna antes da adição da amostra.

3. Adicionar a amostra à coluna

  1. Dissolva a amostra na menor quantidade de solvente possível (usando o mesmo solvente que foi usado para fazer o chorume de gel de sílica).
  2. Com uma pipeta, adicione suavemente a amostra na parte superior da coluna.
  3. Uma vez que a amostra tenha sido aplicada na parte superior da coluna, abra a torneira e deixe o solvente drenar através da camada de areia, mas não a camada de gel de sílica. Use uma quantidade muito pequena de solvente para lavar qualquer amostra que possa ter se agarrado aos lados da coluna. Escorra este solvente adicional através da camada de areia também.

4. Eluting the Sample through the Column

  1. Usando uma pipeta, adicione suavemente 4-5 mL de solvente de tal forma que não perturbe a camada de areia.
  2. Coloque um funil na parte superior da coluna e encha delicadamente o restante da coluna com solvente.
  3. Abra a torneira e deixe o solvente drenar pela coluna.
  4. Comece a coletar a fase móvel à medida que ela escorre da coluna para tubos de ensaio.
    1. Os tubos de ensaio devem ser colocados em um rack de tubo de ensaio de forma sequencial.
  5. Adicione solvente adicional à parte superior da coluna, conforme necessário, até que todos os compostos desejados tenham eluvado da coluna.

5. Recuperando os Constituintes

  1. Se os compostos são coloridos, então eles podem ser identificados visualmente. No entanto, se os compostos estiverem incolores, eles terão que ser identificados usando luz ulta-visível (UV) (se os compostos contêm conjugação) ou com a mancha apropriada. A pureza dos compostos pode ser verificada usando cromatografia de camada fina.
  2. Identifique os tubos de ensaio que contêm os compostos desejados.
  3. Mescle todas as frações que contêm os compostos isolados desejados em um frasco de fundo redondo (RB) pré-pesado. Faça isso por cada composto que está isolado.
  4. Evaporar o solvente colocando o frasco DE RB no evaporador rotativo.
  5. Uma vez que todo o solvente tenha sido removido, pese o RB com o produto seco e subtraia o peso inicial do RB para obter um rendimento.

Cromatografia de coluna é um método versátil de purificação usado para separar compostos em uma solução. Uma mistura de solução é transportada por um solvente através de uma coluna contendo um adsorbent sólido, chamado de fase estacionária. A mistura combinada de solvente e amostra é chamada de fase móvel.

Moléculas na fase móvel viajam pela coluna a diferentes taxas com base em suas propriedades químicas e sua afinidade com a fase estacionária. Assim, cada composto sai da coluna em um momento diferente. Uma vez que os compostos tenham sido separados e purificados, eles podem ser processados ou prontos para distribuição. Este vídeo introduzirá o básico da cromatografia da coluna e demonstrará a técnica com a purificação de compostos orgânicos.

Na cromatografia da coluna, as moléculas reversivelmente adsorb para a fase estacionária à medida que fluem através da coluna, retardando assim seu progresso. Compostos que interagem fracamente com a fase estacionária são mais rápidos para sair da coluna, ou elute. Compostos que interagem fortemente com a fase estacionária são mais lentos para elute. A fase estacionária é um pó ou gel adsorbent, como gel de sílica ou alumina. Gel de sílica e alumina são altamente polares, por isso interagem fortemente com compostos polares e solventes, e fracamente com moléculas não polares. A fase estacionária é carregada na coluna como um chorume com o solvente e, em seguida, é embalada por solvente fluindo através da fase estacionária. Quando devidamente embalada, a fase estacionária é homogênea de cima para baixo e não contém bolhas de ar ou manchas secas, pois o fluxo desigual causado por essas irregularidades interfere na separação dos compostos. O solvente, ou eluente, é tipicamente um solvente orgânico fornecido a partir de um reservatório. Em geral, solventes não polares apenas elute compostos não polares, enquanto solventes polares elute tanto compostos polares quanto não polares. Se uma mistura contém compostos de polaridades significativamente diferentes, uma série de solventes cada vez mais polares podem ser usados para elutar todos os compostos de interesse. A taxa de fluxo de fase móvel é geralmente controlada por uma torneira na parte inferior da coluna. As pausas no fluxo são mantidas ao mínimo para evitar a difusão dos compostos. A fase móvel que sai da coluna, chamada de elunato, é coletada em frações para preservar a separação dos compostos. Agora que você entende os princípios da cromatografia da coluna, vamos passar por um procedimento para a purificação de uma mistura de compostos orgânicos.

Para iniciar o procedimento, obtenha o equipamento conforme observado no texto. Pesar um frasco de fundo redondo para cada composto ser isolado e registrar a massa. Em seguida, pese a amostra e dissolva-a no volume mínimo de solvente necessário. O solvente apropriado deve ser predeterminado usando cromatografia de camada fina. O valor Rf deve ser entre 0,2-0,3. Em seguida, determine a quantidade de gel de sílica necessária para a fase estacionária com base no peso seco da amostra e a diferença na distância migratória dos compostos de juros com base na pré-triagem do TLC. Despeje a quantidade apropriada de gel de sílica em um frasco de Erlenmeyer. Adicione o solvente ao gel de sílica até que o chorume esteja translúcido e se mova livremente quando o frasco é girado. Em seguida, selecione uma coluna grande o suficiente para que o gel de sílica o preencha no meio do caminho. Se a coluna não tiver um frit de vidro, coloque a lã de vidro na coluna e pressione-a firmemente para o fundo com uma haste longa. Cubra a lã de vidro com cerca de 2 cm de areia para evitar que a sílica passe pela lã de vidro. Em um capô de fumaça fixar a coluna em um suporte de anel, permitindo espaço suficiente abaixo para acomodar os tubos de ensaio.

Coloque um funil na coluna e certifique-se de que a torneira esteja fechada. Despeje o chorume na coluna, batendo suavemente nas laterais enquanto o chorume se instala para excluir bolhas de ar. Enxágüe o funil, o frasco e as paredes da coluna com solvente para transferir todo o gel para a coluna.

Coloque um frasco de Erlenmeyer sob a coluna. Abra a torneira e deixe o solvente drenar para o frasco até que o nível do solvente esteja logo acima do gel de sílica e, em seguida, feche a torneira. Despeje cerca de 2 cm de areia sobre o gel. Enxágue suavemente qualquer areia presa aos lados da coluna com solvente. Escorra o solvente conforme necessário para que a areia esteja quase sempre seca, mas a sílica permanece completamente coberta.

Para iniciar a separação, adicione a amostra à coluna sem perturbar a areia. Use pequenas porções de solvente para enxaguar qualquer amostra aderindo às paredes da coluna e enxaguar o recipiente de amostra. Escorra cuidadosamente o solvente até que o nível esteja logo acima da sílica. Em seguida, com uma pipeta, adicione suavemente 4-5 mL de solvente sem perturbar a camada de areia. Coloque um funil na coluna e encha lentamente com solvente. Remova o frasco e substitua por um tubo de ensaio rotulado. Com o primeiro tubo de ensaio no lugar, abra a torneira e colete o eluato até que o tubo de ensaio esteja quase cheio.

Continue coletando frações até que todos os compostos desejados tenham sido elucidos, procedendo sequencialmente através dos tubos de ensaio rotulados. Quando terminar, feche a torneira.

Para cada composto isolado, misture as frações puras em um frasco de fundo redondo pré-pesado. Remova o solvente do frasco em um evaporador rotativo e, em seguida, pese o frasco de fundo redondo contendo o composto seco. Para obter mais informações, consulte o vídeo desta coleção sobre evaporação rotativa.

Esta amostra continha uma mistura de tetrafenilaporfirina, ou TPP, e fluorenona. O TPP roxo-avermelhado escuro foi elucido primeiro, seguido pela fluorenona amarela. A pureza de cada composto isolado foi confirmada pela espectroscopia de NMR.

A cromatografia da coluna é usada na purificação e análise em diversos campos científicos.

Cromatografia líquida de alto desempenho, ou HPLC, é uma forma de cromatografia de coluna que proporciona excelente separação entre compostos e pode incorporar detectores especializados, como um detector de radiação para moléculas radiolabeladas. Usando HPLC, um fosfolipídio radiolabeled pode ser facilmente isolado de uma mistura de muitos outros, mesmo que compõe uma pequena porcentagem da mistura. Essas informações podem ajudar a elucidar a produção, a regulação e as funções de muitas biomoléculas importantes.

Cromatografia flash é uma variante da cromatografia da coluna na qual a fase móvel se move através da coluna sob pressão de ar ou gás, em vez de apenas pelo fluxo gravitacional.

Isso cria uma taxa de fluxo mais rápida, minimizando a difusão para uma melhor separação. O composto desejado é coletado em algumas frações puras e concentradas, como mostrado com cromatografia de camada fina, resultando em excelente rendimento pós-purificação e pureza.

O aparelho de coluna usual não é apropriado para separar pequenos volumes, mas algumas misturas não são compatíveis com técnicas especializadas como o HPLC. A purificação em pequena escala é realizada com colunas de pipeta de vidro, com uma lâmpada de pipeta usada para cromatografia flash em pequena escala. Isso é particularmente útil ao preparar uma amostra para técnicas especializadas de purificação ou como um passo final após a purificação em larga escala.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à cromatografia da coluna. Agora você deve estar familiarizado com os princípios da cromatografia da coluna, um procedimento para cromatografia da coluna de gel de sílica, e algumas aplicações da técnica.

Obrigado por assistir!

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Results

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A amostra contendo uma mistura de tetrafenilaporfirina (TPP, 5 mg) e fluorenona (45 mg) foi separada com sucesso e cada composto foi isolado. O TPP eluiliu primeiro da coluna como uma faixa roxa-avermelhada escura e a fluorenona posteriormente eluiçada da coluna como uma faixa amarela (Figura2). As frações elucidas foram coletadas em tubos de ensaio e identificadas por suas cores distintas(Figura 3). As frações contendo os compostos isolados foram fundidas em RBs separados e o solvente foi removido usando um evaporador rotativo para pagar TPP altamente puro e fluorenona. A pureza dos compostos cromatógrafos foi validada pela espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR). Os compostos podem ser verificados adicionalmente por ponto de fusão, mas apenas se o ponto de fusão do composto desejado tiver sido previamente determinado.

Figure 2
Figura 2. À medida que os compostos atravessam a fase estacionária, eles começam a se separar. Neste experimento, o TPP (banda roxa-avermelhada escura) viaja através da coluna um pouco mais rápido que a fluorenona (banda amarela).

Figure 3
Figura 3. Como os compostos elute fora da coluna eles são coletados em tubos de ensaio. Os compostos separados neste experimento são coloridos, para que possam ser identificados visualmente.

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Applications and Summary

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Resumo

A cromatografia da coluna é um método conveniente e versátil para purificar compostos. Este método separa compostos baseados na polaridade. Explorando diferenças na polaridade das moléculas, a cromatografia da coluna pode separar facilely os compostos pela taxa em que os compostos atravessam a fase estacionária da coluna. Um dos benefícios da cromatografia da coluna (especialmente quando comparada à recristalização) é que muito pouco sobre os compostos precisa ser conhecido antes do processo de purificação. A outra vantagem do uso da cromatografia da coluna é que ela pode ser usada para purificar sólidos e óleos, enquanto a recristalização só pode ser usada para purificar sólidos. Esta técnica também pode ser usada para isolar uma série de compostos de uma mistura.

Aplicativos

A cromatografia da coluna é um dos métodos mais convenientes e amplamente utilizados para purificar compostos. Muitas vezes, reações sintéticas produzirão múltiplos produtos e a cromatografia da coluna pode ser usada para isolar cada um dos compostos para um exame mais aprofundado. A cromatografia da coluna é extremamente valiosa ao sintetizar ou isolar novos compostos, pois muito pouco precisa ser conhecido sobre um composto e suas propriedades físicas antes do processo de purificação.

A indústria farmacêutica usa rotineiramente cromatografia de coluna para purificar compostos como parte de seu processo de desenvolvimento de medicamentos em estágio inicial. 3 Muitas vezes, nesses estágios preliminares, os pesquisadores construirão bibliotecas de compostos em torno de um composto de chumbo e, posteriormente, usarão cromatografia de coluna para purificar os compostos recém-sintetizados. 4 O uso extensivo e versatilidade dessa técnica de purificação levou os educadores a incorporar a técnica no currículo de graduação. 5,6

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References

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  2. Armarego, W. L. F.; Chai, C. L. L., Purification of laboratory chemicals. 5th ed.; Butterworth-Heinemann: Amsterdam; Boston; p xv, 609 p (2003).
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Transcript

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