Overview
资料来源： 实验室的博士伊恩胡椒和博士查尔斯称-亚利桑那大学
演示作者： 路易莎 Ikner
在土壤中的微生物群落分析的传统方法通常涉及或者文化的检测，利用稀释和电镀的选择性和差别的介质或直接计数检测方法。直接计数提供信息的存在，细菌总数，但给没有数量或本社区内的种群多样性的信息。平板计数允许枚举的共有文化或选定的文化群体，并因此提供信息，不同的人群存在。然而，由于少于 1%的土壤细菌容易培养，文化信息提供只有一张图片。可以培养社区的实际分数取决于选择的介质为文化计数。任何单一的媒介将选择最适合于该特定的媒介的人口。
近年来，学习社区从土壤样品中提取的 DNA 的优势日益明显。这种基于非培养方法被认为是更能代表实际的社区目前比文化为基础的办法。这种方法未来提供有关类型的人口信息，，还可以提供关于其遗传潜力。任何技术，有可与 DNA 提取的数据的局限性。因此，许多研究人员现在 DNA 提取结合使用直接和文化计数，最大限度地获得环境样品的数据。
Principles
从土壤中的提取 DNA 可以进行两种方式 (表 1) 之一。在原位方法中，基于化学和机械技术相结合。为此提取大量的土壤和提取缓冲液等效体积相结合。玻璃珠然后添加到大量的洗涤剂和悬浮 （通常使用十二烷基硫酸钠或 SDS，），和样品混合，以便其后孵化高温促进细胞裂解的土壤颗粒分离。后离心上, 清液净化 DNA 产品遭受进一步的提取和孵化的步骤。
交替，单元格可能首先被分馏 （或分隔） 从之前的遗传材料提取土壤基质。大量的土壤样品经过连续循环的混合和慢离心。珠跳动步被消灭这里，然而，为了保持完整的细胞，离心，获得颗粒。基于溶菌酶提取然后进行孵化器破坏细胞壁和解放为纯化的 DNA 结合。
这个手稿和视频将展示从土壤中提取 DNA 的原位方法作为此过程已经被证实可以从土壤样品细胞分离方法与产量 DNA 浓度更高。
| 问题 | 细菌的分馏 | 原位溶解 |
| 产量的 DNA | 1-5 μ g/g | 1-20 μ g/g |
| 共同体的代表 | 由于细胞吸附少代表 | 更具代表性，不会影响细胞吸附 |
| 恢复的 DNA 的来源 | 只有细菌 | 主要是细菌但也真菌和原生动物 |
| 程度的 DNA 剪切 | 少剪 | 更多剪 |
| 平均大小的 DNA 片段 | 50 kb | 25 kb |
| 腐植酸的污染程度 | 较无污染 | 更多污染 |
| 易用性的方法 | 低费力 | 更快、 少劳动密集型 |
表 1。从土壤中 DNA 回收细菌分馏和原位裂解方法的比较。
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Procedure
1.细菌群落 DNA 提取
- 开始执行程序，称出筛土 100 克。将它添加到聚丙烯的船只，并添加 100 毫升的提取缓冲液组成的修正与 EDTA 促进释放细菌从土壤基质，然后用手抖三缓冲区。
- 接下来，重 100 克的玻璃珠，并将它们添加到混合容器。鼓动样本 5 分钟使用珠打设备或机械的手腕动作振动筛 15 分钟添加 10 毫升 20%十二烷基硫酸钠，或 SDS，到混合物，然后鼓动额外的分钟。孵化在 60 分钟的 60-65 ° C 的高温。
- 同样分发之间单独 50 毫升管，样品和离心机以离心 10 分钟 6,000 x g.转让上清液从管到单个的无菌容器。接下来，重复对土壤颗粒如上文所述，使用大量新鲜的提取缓冲液提取。
- 接下来，添加填充到半卷 30%聚乙二醇和 1.6 M 氯化钠溶液清洁 50 毫升管加工上清液，约 200 毫升，总体积。反转瓶几次用手混合，和在室温下 2 h.孵育离心机样品在拥有 10 万 x g 20 分钟颗粒的 DNA。
- 仔细去除上清液离心管，留下部分纯化的核酸颗粒。添加 20 毫升的 TE 缓冲和 1.5 毫升的 7.5 M 钾醋酸溶液，以悬小球，然后涡。放冰 5 分钟离心机在 16,000 x g 4 ° C，以沉淀蛋白质和多糖在 30 分钟的暂停。
- 接下来，添加到样品的核糖核酸酶和蛋白酶 K、 手，轻轻地混合和让坐一会儿。添加了当量体积的酚： 氯仿： 异戊醇 （25:24:1 比混合物） 悬浮，提取，和混合轻轻用手。离心机 13,000 x g.10 分钟准备仔细从离心机等，并说明这两个图层中删除该船只。
- 底部，重层组成的酚： 氯仿： 异戊醇提取碎片，和最上面一层是水和含有 DNA。将水相放入无菌容器、 添加了当量体积的异丙醇和反转轻轻启动 DNA 沉淀。孵化在室温下 2 h.纯化 DNA 颗粒悬浮在 16,000 x g 离心 30 分钟仔细删除上清丸粒化的 DNA 可能或可能不在容器的底部可见，然后重悬在 1 毫升的 TE 缓冲。
- 利用分光光度计或 DNA/RNA 定量荧光计，测量从样本中提取 DNA 的水平。DNA 估计从 260 nm 阅读。1.0 的吸光度读数等于 50 微克的 DNA 每毫升的解决方案。如果浓度太高，读数准确，稀释悬浮 1 到 10 或 1 到 100 使用分子级水。
- DNA 纯度估计的比例由阅读在 260 毫微米到那在 280 nm。一个值 > 1.7 指示相对较纯的 DNA。最大理论值为 2.0。
细菌群落 DNA 提取是 DNA 获得来自多个细菌物种在一个社区内单次提取过程中的一个过程。
传统的土壤微生物群落分析通常涉及文化含量测定，利用稀释和电镀方法在不同的选择性培养基上。然而，许多细菌生长不良在实验室条件下或在特定的生长介质条件的选择，意味着他们可能错过或人数严重不足。
最近，社会 DNA 提取土壤细菌样品使得细菌群落更全面采样。此非文化基础的方法被认为是更能代表实际的社区目前比传统文化为基础的方法。
这个视频将演示一种非培养方法的细菌群落 DNA 的提取，如何检查的质量和数量的提取 DNA，并探索如何可能利用这种 DNA 研究细菌多样性。
可以通过以下两种方式之一进行从土壤中的提取 DNA。在分馏方法中，细胞首先分开前的遗传材料提取土壤基质。示例然后遭受连续循环的混合和慢为了收集完整细胞中的颗粒离心。
溶菌酶然后添加到单元格，并暂停被孵化。溶菌酶是一种酶，分解细菌的细胞壁。一旦已受损的细胞壁结构，DNA 可能然后被解放净化。然而，社区 DNA 的提取，原位方法中，第二个方法可以产生更大的 DNA 浓度。
在这里，大量的土壤结合了当量体积的三-乙二胺四乙酸提取缓冲液和玻璃珠和混合大力促进土壤颗粒细胞分离。然后添加洗涤剂，一般十二烷基硫酸钠或 SDS 和样品进一步混合，促进细胞和它们的内容，包括 DNA 释放的溶胞。
孵化温度较高然后采取将任何剩余的细菌细胞溶解。离心样品，和聚乙二醇萃取和孵化为了在上进行上清液沉淀的 DNA，然后离心进一个球。
DNA 再悬浮 TE 缓冲区中，然后以进一步醋酸钾洗 DNA 的蛋白质和多糖，再离心法进行颗粒这些不需要的成分。水的上清液含有 DNA 是删除，并且遭受酚-氯仿萃取和异丙醇沉淀，以进一步清洁和浓缩 DNA。后两个小时室温潜伏期，DNA 是离心分离和再悬浮 TE 缓冲区中存储直到分析。
现在，我们所熟悉的概念和背后细菌群落 DNA 的提取过程，让我们看看如何它在实验室中进行。
开始执行程序，称出筛土 100 克。将它添加到聚丙烯的船只，并添加 100 毫升的提取缓冲液组成的修正与 EDTA 促进释放细菌从土壤基质，然后用手抖三缓冲区。
接下来，重 100 克的玻璃珠，并将它们添加到混合容器。搅拌 5 分钟使用跳动设备或机械的手腕动作振动筛珠样品。10 毫升 20%十二烷基硫酸钠或 SDS，添加混合，然后鼓动额外的分钟。孵化温度高 60 分钟。
同样分发之间单独 50 毫升管样本和离心机以离心 10 分钟 6,000 x g.转让上清液从管到单个的无菌容器。接下来，重复对土壤颗粒如上文所述，使用大量新鲜的提取缓冲液提取。
接下来，添加填充到半卷 30%聚乙二醇和 1.6 M 氯化钠溶液清洁 50 毫升管加工上清液的总量。反转瓶几次用手混合，和在室温下 2 h.孵育离心机样品在拥有 10 万 x g 20 分钟颗粒的 DNA。
仔细去除上清液离心管，留下部分纯化的核酸颗粒。添加 20 毫升的 TE 缓冲和 1.5 毫升的 7.5 M 钾醋酸溶液，以悬小球，然后涡。放冰 5 分钟离心机在 16,000 x g 4 ° C，以沉淀蛋白质和多糖在 30 分钟的暂停。
接下来，添加到样品的核糖核酸酶和蛋白酶 K、 手，轻轻地混合和让坐一会儿。添加了当量体积的酚： 氯仿： 异戊醇悬浮，提取，和混合轻轻用手。离心机 13,000 x g.10 分钟准备仔细从离心机等，并说明这两个图层中删除该船只。
底部，重层组成的酚： 氯仿： 异戊醇提取碎片，和最上面一层是水和含有 DNA。将水相放入无菌容器、 添加了当量体积的异丙醇和反转轻轻启动 DNA 沉淀。孵化在室温下 2 h.纯化 DNA 颗粒悬浮在 16,000 x g 离心 30 分钟仔细删除上清丸粒化的 DNA 可能或可能不在容器的底部可见，然后重悬在 1 毫升的 TE 缓冲。
利用分光光度计或 DNA/RNA 定量荧光计，测量从样本中提取 DNA 的水平。DNA/RNA fluorimeters 将输出单位毫微克每毫升 DNA 的水平。如果浓度太高，读数准确，稀释悬浮 1 到 10 或 1 到 100 使用分子级水。
一旦 DNA 获得从细菌群落，这是可以利用大量的不同的方式。这些应用程序的一些探讨在这里。
Spectrophotographic 分析从社区 DNA 中提取的 dna 可以洞察给定的土壤样本中存在细菌细胞的数量。DNA 中吴每毫升溶液的估计的数量可以回的 DNA 提取在解决方案中，给每克土壤的 DNA 总量总量有关。知道每个细胞的 DNA 的理论价值，可以计算的每克土壤的细胞总数。
为更多有针对性的应用程序，从细菌群落中提取 DNA 可以遭受 PCR 确定如果某一物种是本社区内。例如，科学家们可能想确定是否土壤样本中包含特定的病原体，如产气荚膜梭状芽胞杆菌或炭疽芽孢杆菌。
最后，若要获得更全面的了解，目前在社区中的细菌，DNA 样本能受到允许进行深入分析的内部的样品的原始细菌的"经济"和生物信息学的表征。"组学"描述了一系列探索角色、 关系和分子生物或社区行动的技术。这包括基因研究和作用，或"基因组学"和"蛋白质组学研究"、 蛋白的研究，他们的角色。例如，16S RNA 从样本测序可以允许在社区中，给予更详细的多样性估算特定物种的宏基因组测定。这种方法能给科学家们更好地了解社会的物种组成和他们可能承担什么角色。
你刚看了朱庇特的简介细菌群落 DNA 的提取。现在，您应该了解如何从细菌群落中提取 DNA，如何检查质量的这种 DNA，以及如何将这种 DNA 用于细菌群落组成调查。谢谢观赏 ！
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Applications and Summary
从社区 DNA 培养殖民地或提取土壤可以遭受生物信息学和"经济"的方式，使其为表征的内部的样品的原始细菌。经济方法包括宏基因组学 — —"谁"的测定是通过 16S rRNA 序列社区内。这给出估计内社区的多样性。
此外可以计算原始土壤样品中的细菌细胞数目。社区 DNA 是从土壤中提取和量化的光谱分析。DNA 微克 DNA 每毫升溶液作为衡量估计的量被相关回的溶液中提取的 DNA 给 DNA 每克土壤总金额总量。通过了解每个细胞的 DNA 的理论价值，可以计算的每克土壤的细胞总数。
示例
土壤有 0.12 微克 DNA 每克土壤
如果每个单元格具有 4 成品的 DNA
提取的社区 DNA 可以受到使用特异性引物来确定某一物种是否本社区内的聚合酶链反应分析。例子包括特定病原细菌如产气荚膜梭状芽胞杆菌或炭疽芽孢杆菌。
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