Overview
Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner
I metodi tradizionali di analisi per le comunità microbiche all'interno dei suoli hanno solitamente coinvolto saggi culturali che utilizzano la metodologia di diluizione e placcatura su mezzi selettivi e differenziali o saggi di conteggio diretto. I conteggi diretti offrono informazioni sul numero totale di batteri presenti, ma non forniscono informazioni sul numero o sulla diversità delle popolazioni presenti all'interno della comunità. I conteggi delle piastre consentono l'enumerazione delle popolazioni culturali totali o selezionate e quindi forniscono informazioni sulle diverse popolazioni presenti. Tuttavia, poiché meno dell'1% dei batteri del suolo sono facilmente coltivabili, le informazioni culturali offrono solo una parte del quadro. La frazione effettiva della comunità che può essere coltivata dipende dal mezzo scelto per i conteggi culturali. Ogni singolo mezzo selezionerà per le popolazioni che sono più adatte a quel particolare mezzo.
Negli ultimi anni, i vantaggi di studiare il DNA della comunità estratto da campioni di suolo sono diventati evidenti. Si ritiene che questo approccio non basato sulla cultura sia più rappresentativo della comunità reale presente rispetto agli approcci basati sulla cultura. Oltre a fornire informazioni sui tipi di popolazioni presenti, questo approccio può anche fornire informazioni sul loro potenziale genetico. Come con qualsiasi tecnica, ci sono limitazioni ai dati che possono essere ottenuti con l'estrazione del DNA. Pertanto, molti ricercatori ora utilizzano l'estrazione del DNA in combinazione con conteggi diretti e culturali per massimizzare i dati ottenuti da un campione ambientale.
Principles
L'estrazione del DNA dal suolo può essere condotta in due modi (Tabella 1). Nel metodo in situ, viene utilizzata una combinazione di tecniche chimiche e meccaniche. Per questa estrazione, una massa di terreno è combinata con un volume equivalente di un tampone di estrazione. Le perle di vetro vengono quindi aggiunte alla sospensione insieme a un volume di detergente (in genere viene utilizzato il solfato di dodecile di sodio, o SDS) e il campione viene miscelato per facilitare la separazione dalle particelle del suolo seguita da incubazione a una temperatura elevata per promuovere la lisi cellulare. Dopo la centrifugazione, il surnatante viene sottoposto a ulteriori fasi di estrazione e incubazione al fine di purificare il prodotto DNA.
In alternativa, le cellule possono prima essere frazionate (o separate) dalla matrice del suolo prima dell'estrazione del materiale genetico. Una massa di campione di terreno subisce cicli successivi di miscelazione e centrifugazione lenta. La fase di battitura delle perle viene eliminata qui, tuttavia, al fine di mantenere intatte le cellule, che vengono centrifugate per ottenere un pellet. Un'estrazione a base di lisozima viene quindi eseguita in concomitanza con l'incubazione per interrompere le pareti cellulari e liberare il DNA per la purificazione.
Questo manoscritto e video dimostreranno il metodo in situ di estrazione del DNA dal suolo, poiché questa procedura ha dimostrato di produrre maggiori concentrazioni di DNA da campioni di suolo rispetto al metodo di frazionamento cellulare.
| Questione | Frazionamento batterico | In situ Lisi |
| Resa del DNA | 1-5 μg/g | 1-20 μg/g |
| Rappresentante della comunità | Meno rappresentativo a causa dell'assorbimento cellulare | Assorbimento cellulare più rappresentativo e non influenzato |
| Fonte di DNA recuperato | Solo batteri | Per lo più batteri ma anche funghi e protozoi |
| Grado di tranciatura del DNA | Meno cesoiatura | Più cesoiatura |
| Dimensione media dei frammenti di DNA | 50 kb | 25 kb |
| Grado di contaminazione utica | Meno contaminato | Più contaminato |
| Facilità di metodologia | Basso, laborioso | Più veloce, meno laborioso |
Tabella 1. Confronto tra metodologie di frazionamento batterico e lisi in situ per il recupero del DNA dal suolo.
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Procedure
1. Estrazione del DNA della comunità batterica
- Per iniziare la procedura, pesare 100 g di terreno setacciato. Aggiungi questo a un recipiente di polipropilene e aggiungi 100 ml di tampone di estrazione composto da tampone Tris modificato con EDTA per promuovere il rilascio di batteri dalla matrice del suolo, quindi stringi la mano.
- Quindi, pesare 100 g di perle di vetro e aggiungerle al recipiente di miscelazione. Agitare il campione per 5 minuti utilizzando un dispositivo di battitura delle pere o uno shaker meccanico ad azione da polso per 15 minuti. Aggiungere 10 ml di dodecil solfato di sodio al 20%, o SDS, alla miscela, quindi agitare per un ulteriore minuto. Incubare ad una temperatura elevata di 60 - 65 °C per 60 min.
- Distribuire equamente il campione tra tubi separati da 50 ml e centrifugare per 10 minuti a 6.000 x g. Trasferire il surnatante dai tubi in un unico contenitore sterile. Quindi, ripetere l'estrazione sul pellet di terreno come descritto in precedenza, utilizzando un volume fresco di tampone di estrazione.
- Quindi, aggiungere il volume totale del surnatante lavorato, circa 200 ml, in un tubo pulito da 50 ml riempito a metà volume con una soluzione di polietilenglicole al 30% e cloruro di sodio 1,6 M. Invertire le bottiglie più volte a mano per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 20 minuti per pellettizzare il DNA.
- Rimuovere accuratamente il surnatante dal tubo della centrifuga, lasciando dietro di sé il pellet di acido nucleico parzialmente purificato. Aggiungere 20 mL di TE Buffer e 1,5 mL di una soluzione di acetato di potassio da 7,5 M per sospendare il pellet, quindi vortice. Posizionare la sospensione sul ghiaccio per 5 min. Centrifugare a 16.000 x g per 30 min a 4 °C per precipitare proteine e polisaccaridi.
- Quindi, aggiungere una RNAsi e una proteinasi K al campione, mescolare delicatamente a mano e lasciare riposare per un momento. Aggiungere un volume equivalente di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (rapporto miscela di 25:24:1) alla sospensione da estrarre e mescolare delicatamente a mano. Centrifugare la preparazione per 10 min a 13.000 x g. Rimuovere con attenzione il recipiente dalla centrifuga e annotare i due strati.
- Lo strato inferiore, più pesante, è composto dal fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e detriti estratti, e lo strato superiore è l'acquoso e contiene il DNA. Posizionare la fase acquosa in un recipiente sterile, aggiungere un volume equivalente di isopropanolo e invertire delicatamente per avviare la precipitazione del DNA. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 2 ore. Pellet il DNA purificato mediante centrifugazione a 16.000 x g per 30 min. Rimuovere con attenzione il surnatante poiché il DNA pellettato può o non può essere visibile sul fondo del vaso, quindi ricaspendare in 1 mL di TE Buffer.
- Utilizzando uno spettrofotometro o un fluorimetro di quantificazione DNA/RNA, misurare il livello di DNA estratto dal campione. La quantità di DNA è stimata dalla lettura di 260 nm. Una lettura di assorbanza di 1,0 equivale a 50 μg di DNA per mL di soluzione. Se la concentrazione è troppo alta per letture accurate, diluire la sospensione da 1 a 10 o da 1 a 100 utilizzando acqua di grado molecolare.
- La purezza del DNA è stimata dal rapporto tra la lettura a 260 nm a quella a 280 nm. Un valore > 1,7 indica DNA relativamente puro. Il valore teorico massimo è 2.0.
L'estrazione del DNA della comunità batterica è un processo mediante il quale il DNA viene ottenuto da più specie batteriche all'interno di una comunità durante una singola procedura di estrazione.
Le analisi tradizionali delle comunità microbiche nel suolo hanno solitamente coinvolto saggi culturali, utilizzando la metodologia di diluizione e placcatura su diversi mezzi selettivi. Tuttavia, molti batteri crescono male in condizioni di laboratorio o sulle specifiche condizioni del mezzo di crescita selezionate, il che significa che potrebbero essere mancati o gravemente sottorappresentati.
Recentemente, l'estrazione del DNA della comunità da campioni batterici del suolo ha permesso un campionamento più completo delle comunità batteriche. Si ritiene che questo approccio non basato sulla cultura sia più rappresentativo delle comunità reali presenti rispetto ai metodi tradizionali basati sulla cultura.
Questo video dimostrerà un metodo non di coltura di estrazione del DNA della comunità batterica, come controllare la qualità e la quantità del DNA estratto ed esplorare come questo DNA può essere utilizzato per studiare la diversità batterica.
L'estrazione del DNA dal suolo può essere condotta in due modi. Nel metodo di frazionamento, le cellule vengono prima separate dalla matrice del suolo prima dell'estrazione del materiale genetico. Il campione viene quindi sottoposto a cicli successivi di miscelazione e centrifugazione lenta al fine di raccogliere cellule intatte in un pellet.
I lisozimi vengono quindi aggiunti alle cellule e la sospensione viene incubata. I lisozimi sono enzimi che abbattono le pareti cellulari batteriche. Una volta che la struttura della parete cellulare è stata compromessa, il DNA può quindi essere liberato per la purificazione. Tuttavia, un secondo metodo di estrazione del DNA comunitario, il metodo in situ, ha dimostrato di produrre una maggiore concentrazione di DNA.
Qui, una massa di terreno viene combinata con un volume equivalente di tampone di estrazione Tris-EDTA e perle di vetro e mescolata in modo aggressivo per facilitare la separazione delle cellule dalle particelle del suolo. Viene quindi aggiunto un detergente, generalmente sodio dodecil solfato, o SDS, e il campione viene ulteriormente miscelato per promuovere la lisi delle cellule e il rilascio del loro contenuto, incluso il DNA.
L'incubazione ad alta temperatura viene quindi intrapresa per lisi di eventuali cellule batteriche rimanenti. I campioni vengono centrifugati e un'estrazione e incubazione di polietilenglicole viene eseguita sul surnatante per precipitare il DNA, che viene quindi centrifugato in un pellet.
Il DNA viene risospendato in TE Buffer e acetato di potassio al fine di lavare ulteriormente il DNA di proteine e polisaccaridi, quindi viene effettuata la centrifugazione per pellettizzare questi componenti indesiderati. Il surnatante acquoso contenente il DNA viene rimosso e sottoposto a un'estrazione fenolo-cloroformio e a una precipitazione isopropanolica per pulire e concentrare ulteriormente il DNA. Dopo un periodo di incubazione a temperatura ambiente di due ore, il DNA viene centrifugato e risusciso in TE Buffer per la conservazione fino all'analisi.
Ora che abbiamo familiarità con i concetti e i processi alla base dell'estrazione del DNA della comunità batterica, diamo un'occhiata a come viene eseguita in laboratorio.
Per iniziare la procedura, pesare 100 g di terreno setacciato. Aggiungi questo a un recipiente di polipropilene e aggiungi 100 ml di tampone di estrazione composto da tampone Tris modificato con EDTA per promuovere il rilascio di batteri dalla matrice del suolo, quindi stringi la mano.
Quindi, pesare 100 g di perle di vetro e aggiungerle al recipiente di miscelazione. Agitare il campione per 5 minuti utilizzando un dispositivo di battitura delle pere o uno shaker meccanico ad azione da polso. Aggiungere 10 ml di dodecil solfato di sodio al 20%, o SDS, alla miscela, quindi agitare per un ulteriore minuto. Incubare ad alta temperatura per 60 min.
Distribuire equamente il campione tra tubi separati da 50 ml e centrifugare per 10 minuti a 6.000 x g. Trasferire il surnatante dai tubi in un unico contenitore sterile. Quindi, ripetere l'estrazione sul pellet di terreno come descritto in precedenza, utilizzando un volume fresco di tampone di estrazione.
Quindi, aggiungere il volume totale del surnatante lavorato a un tubo pulito da 50 ml riempito a metà volume con una soluzione di polietilenglicole al 30% e cloruro di sodio 1,6 M. Invertire le bottiglie più volte a mano per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 20 minuti per pellettizzare il DNA.
Rimuovere accuratamente il surnatante dal tubo della centrifuga, lasciando dietro di sé il pellet di acido nucleico parzialmente purificato. Aggiungere 20 mL di TE Buffer e 1,5 mL di una soluzione di acetato di potassio da 7,5 M per sospendare il pellet, quindi vortice. Posizionare la sospensione sul ghiaccio per 5 min. Centrifugare a 16.000 x g per 30 min a 4 °C per precipitare proteine e polisaccaridi.
Quindi, aggiungere una RNAsi e una proteinasi K al campione, mescolare delicatamente a mano e lasciare riposare per un momento. Aggiungere un volume equivalente di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico alla sospensione da estrarre e mescolare delicatamente a mano. Centrifugare la preparazione per 10 min a 13.000 x g. Rimuovere con attenzione il recipiente dalla centrifuga e annotare i due strati.
Lo strato inferiore, più pesante, è composto dal fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e detriti estratti, e lo strato superiore è l'acquoso e contiene il DNA. Posizionare la fase acquosa in un recipiente sterile, aggiungere un volume equivalente di isopropanolo e invertire delicatamente per avviare la precipitazione del DNA. Incubare la sospensione a temperatura ambiente per 2 ore. Pellet il DNA purificato mediante centrifugazione a 16.000 x g per 30 min. Rimuovere con attenzione il surnatante poiché il DNA pellettato può o non può essere visibile sul fondo del vaso, quindi ricaspendare in 1 mL di TE Buffer.
Utilizzando uno spettrofotometro o un fluorimetro di quantificazione DNA/RNA, misurare il livello di DNA estratto dal campione. I fluorimetri DNA/RNA produrranno livelli di DNA in unità di nanogrammi per millilitro. Se la concentrazione è troppo alta per letture accurate, diluire la sospensione da 1 a 10 o da 1 a 100 utilizzando acqua di grado molecolare.
Una volta che il DNA è ottenuto da una comunità batterica, questo può essere utilizzato in diversi modi. Alcune di queste applicazioni sono esplorate qui.
Le analisi spettrofotografiche del DNA estratto dal DNA della comunità possono fornire una panoramica del numero di cellule batteriche presenti in un determinato campione di suolo. La quantità stimata di DNA in ng per mL di soluzione può essere correlata al volume totale di DNA estratto in soluzione, per dare la quantità totale di DNA per g di terreno. Conoscendo il valore teorico del DNA per cellula, è possibile calcolare il numero totale di cellule per g di suolo.
Per applicazioni più mirate, il DNA estratto dalle comunità batteriche può essere sottoposto a PCR per determinare se una particolare specie è presente all'interno della comunità. Ad esempio, gli scienziati potrebbero voler identificare se i campioni di suolo contengono agenti patogeni specifici, come Clostridium perfringens o Bacillus anthracis.
Infine, per ottenere una comprensione più completa dei batteri presenti in una comunità, i campioni di DNA possono essere sottoposti a caratterizzazione "omica" e bioinformatica che consente un'analisi più approfondita dei batteri originali all'interno del campione. "Omics" descrive una serie di tecnologie che esplorano ruoli, relazioni e azioni di molecole in organismi o comunità. Ciò include gli studi sui geni e la loro funzione, o "Genomica", e "Proteomica", lo studio delle proteine e dei loro ruoli. Ad esempio, il sequenziamento dell'RNA 16S dai campioni può consentire una determinazione metagenomica di specie specifiche all'interno della comunità, fornendo una stima più dettagliata della diversità. Questo approccio può dare agli scienziati una migliore comprensione della composizione delle specie di una comunità e dei ruoli che possono intraprendere.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'estrazione del DNA della comunità batterica. Ora dovresti capire come estrarre il DNA da una comunità batterica, come controllare la qualità di questo DNA e come questo DNA può essere utilizzato per le indagini sulla composizione della comunità batterica. Grazie per l'attenzione!
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Applications and Summary
Il DNA comunitario proveniente da colonie coltivate o estratto dal suolo può essere sottoposto ad approcci bioinformatici e "omici" che consentono la caratterizzazione dei batteri originali all'interno del campione. Gli approcci omici includono la metagenomica – determinazione di "chi" è all'interno della comunità tramite il sequenziamento dell'rRNA 16S. Questo dà una stima della diversità all'interno della comunità.
È anche possibile calcolare il numero di cellule batteriche nel campione di terreno originale. Il DNA comunitario viene estratto da un suolo e quantificato mediante analisi spettroscopiche. La quantità stimata di DNA misurata come μg di DNA per mL di soluzione è correlata al volume totale di DNA estratto in soluzione per dare una quantità totale di DNA per g di suolo. Conoscendo il valore teorico del DNA per cellula, è possibile calcolare il numero totale di cellule per g di suolo.
Esempio
Un suolo ha 0,12 μg di DNA per g di terreno
Se ogni cellula ha 4 fg di DNA
Il DNA della comunità estratto può essere sottoposto ad analisi PCR utilizzando primer specifici per determinare se una particolare specie è presente all'interno della comunità. Gli esempi includono specifici patogeni batterici come Clostridium perfringens o Bacillus anthracis.
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