Overview
Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner
Os métodos tradicionais de análise para comunidades microbianas dentro dos solos geralmente envolveram ensaios culturais utilizando a metodologia de diluição e plating em mídias seletivas e diferenciais ou ensaios de contagem direta. As contagens diretas oferecem informações sobre o número total de bactérias presentes, mas não dão informações sobre o número ou diversidade de populações presentes na comunidade. As contagens de placas permitem a enumeração de populações culturais ou selecionadas totais e, portanto, fornecem informações sobre as diferentes populações presentes. No entanto, como menos de 1% das bactérias do solo são prontamente culturais, a informação cultural oferece apenas um pedaço da imagem. A fração real da comunidade que pode ser cultivada depende do meio escolhido para contagem cultural. Qualquer meio único selecionará para as populações mais adequadas a esse meio em particular.
Nos últimos anos, as vantagens de estudar DNA comunitário extraído de amostras de solo tornaram-se aparentes. Acredita-se que essa abordagem não-cultural seja mais representativa da comunidade atual presente do que as abordagens baseadas na cultura. Além de fornecer informações sobre os tipos de populações presentes, essa abordagem também pode fornecer informações sobre seu potencial genético. Como em qualquer técnica, há limitações aos dados que podem ser obtidos com extração de DNA. Portanto, muitos pesquisadores agora usam a extração de DNA em conjunto com contagens diretas e culturais para maximizar os dados obtidos a partir de uma amostra ambiental.
Principles
A extração de DNA do solo pode ser conduzida de duas formas (Tabela 1). No método in situ, é utilizada uma combinação de técnicas químicas e mecânicas. Para esta extração, uma massa de solo é combinada com um volume equivalente de um tampão de extração. As contas de vidro são então adicionadas à suspensão, juntamente com um volume de detergente (sulfato de dodecilo de sódio, ou SDS, é tipicamente usado), e a amostra é misturada para facilitar a separação das partículas do solo seguidas de incubação a uma temperatura elevada para promover a lise celular. Após a centrifugação, o supernascido é submetido a novas etapas de extração e incubação, a fim de purificar o produto de DNA.
Alternativamente, as células podem primeiro ser fracionadas (ou separadas) da matriz do solo antes da extração do material genético. Uma massa de amostras de solo sofre sucessivos ciclos de mistura e centrifugação lenta. O passo de bater contas é eliminado aqui, no entanto, a fim de manter células intactas, que são centrifadas para obter uma pelota. Uma extração à base de lysozyme é então realizada em conjunto com a incubação para interromper as paredes celulares e liberar o DNA para purificação.
Este manuscrito e vídeo demonstrarão o método in situ de extração de DNA do solo, pois este procedimento tem sido demonstrado para produzir maiores concentrações de DNA a partir de amostras de solo em relação ao método de fracionamento celular.
| Questão | Fracionamento bacteriano | Em Situ Lise |
| Rendimento do DNA | 1-5 μg/g | 1-20 μg/g |
| Representante da comunidade | Menos representativo por causa da sorção celular | Mais representativa, sorção celular não afetada |
| Fonte de DNA recuperado | Apenas bactérias | Principalmente bactérias, mas também fungos e protozoários |
| Grau de tesoura de DNA | Menos tesoura | Mais tesouras |
| Tamanho médio de fragmentos de DNA | 50 kb | 25 kb |
| Grau de contaminação húnica | Menos contaminado | Mais contaminado |
| Facilidade de metodologia | Baixo, trabalhoso | Mais rápido, menos mão-de-obra |
Mesa 1. Comparação de fracionamento bacteriano e metodologias in situ lysis para a recuperação do DNA do solo.
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Procedure
1. Extração de DNA da comunidade bacteriana
- Para iniciar o procedimento, pese 100 g de solo peneirado. Adicione isso a um vaso de polipropileno, e adicione 100 mL de tampão de extração composto de tampão Tris alterado com EDTA para promover a liberação de bactérias da matriz do solo, em seguida, aperte à mão.
- Em seguida, pese 100 g de contas de vidro, e adicione-as ao recipiente de mistura. Agitar a amostra por 5 min usando um dispositivo de batida de contas ou um agitador mecânico de ação de pulso por 15 minutos. Adicione 10 mL 20% de sulfato de dodecil de sódio, ou SDS, à mistura e, em seguida, agitar por mais um minuto. Incubar a uma alta temperatura de 60 - 65 °C por 60 min.
- Distribua igualmente a amostra entre tubos separados de 50 mL e centrífuga por 10 minutos a 6.000 x g. Transfira o supernatante dos tubos para um único recipiente estéril. Em seguida, repita a extração na pelota do solo como descrito anteriormente, utilizando um novo volume de tampão de extração.
- Em seguida, adicione o volume total de supernanato processado, aproximadamente 200 mL, a um tubo limpo de 50 mL preenchido a meio volume com uma solução de 30% de polietileno glicol e cloreto de sódio de 1,6 M. Inverta as garrafas várias vezes à mão para misturar e incubar à temperatura ambiente por 2h. Centrífuga amostras a 10.000 x g por 20 minutos para pelotar o DNA.
- Remova o supernatante cuidadosamente do tubo centrífuga, deixando para trás a pelota de ácido nucleico parcialmente purificada. Adicione 20 mL de TE Buffer e 1,5 mL de uma solução de acetato de potássio de 7,5 M para resuspensar a pelota, depois vórtice. Coloque a suspensão no gelo por 5 minutos. Centrifugar a 16.000 x g por 30 min a 4 °C para precipitar proteínas e polissacarídeos.
- Em seguida, adicione um RNAse e proteinase K à amostra, misture suavemente à mão e deixe descansar por momento. Adicione um volume equivalente de fenol:clorofórmio:álcool isoamyl (mistura de razão de 25:24:1) à suspensão a ser extraída, e misture suavemente à mão. Centrifugar a preparação para 10 min a 13.000 x g. Remova cuidadosamente o vaso da centrífuga e observe as duas camadas.
- A camada inferior e mais pesada é composta do fenol:clorofórmio: álcool isoamyl e detritos extraídos, e a camada superior é a aquosa e contém o DNA. Coloque a fase aquosa em um vaso estéril, adicione um volume equivalente de isopropanol e inverta suavemente para iniciar a precipitação do DNA. Incubar a suspensão em temperatura ambiente por 2h. Pellet o DNA purificado por centrifugação a 16.000 x g por 30 min. Remova cuidadosamente o supernasciente, pois o DNA pelleted pode ou não ser visível na parte inferior do vaso e, em seguida, resuspend em 1 mL de TE Buffer.
- Usando um fluorímetro de quantificação de DNA/RNA, meça o nível de DNA extraído da amostra. A quantidade de DNA é estimada a partir da leitura de 260 nm. Uma leitura de absorvância de 1,0 equivale a 50 μg de DNA por mL de solução. Se a concentração for muito alta para leituras precisas, dilui a suspensão de 1 a 10, ou 1 a 100 usando água de grau molecular.
- A pureza do DNA é estimada da razão da leitura em 260 nm para a de 280 nm. Um valor > 1,7 indica DNA relativamente puro. O valor teórico máximo é 2.0.
A extração de DNA da comunidade bacteriana é um processo pelo qual o DNA é obtido de múltiplas espécies bacterianas dentro de uma comunidade durante um único procedimento de extração.
As análises tradicionais das comunidades microbianas no solo geralmente envolveram ensaios culturais, utilizando a metodologia de diluição e plating em diferentes mídias seletivas. No entanto, muitas bactérias crescem mal em condições laboratoriais ou nas condições específicas de mídia de crescimento selecionadas, o que significa que elas podem ser perdidas ou severamente sub-representadas.
Recentemente, a extração de DNA comunitário de amostras bacterianas do solo permitiu uma amostra mais abrangente de comunidades bacterianas. Acredita-se que essa abordagem não-cultural seja mais representativa das comunidades reais presentes do que os métodos tradicionais baseados na cultura.
Este vídeo demonstrará um método não cultural de extração de DNA da comunidade bacteriana, como verificar a qualidade e quantidade de DNA extraído, e explorará como esse DNA pode ser utilizado para estudar a diversidade bacteriana.
A extração de DNA do solo pode ser conduzida de duas maneiras. No método de fracionamento, as células são primeiramente separadas da matriz do solo antes da extração do material genético. A amostra é então submetida a ciclos sucessivos de mistura e centrifugação lenta, a fim de coletar células intactas em uma pelota.
As lysozymes são então adicionadas às células, e a suspensão é incubada. Lysozymes são enzimas que quebram paredes celulares bacterianas. Uma vez que a estrutura da parede celular tenha sido comprometida, o DNA pode então ser liberado para purificação. No entanto, um segundo método de extração de DNA comunitário, o método in situ, tem sido mostrado para produzir maior concentração de DNA.
Aqui, uma massa de solo é combinada com um volume equivalente de tampão de extração Tris-EDTA e contas de vidro, e misturada agressivamente para facilitar a separação das células das partículas do solo. Em seguida, é adicionado um detergente, geralmente sulfato de dodecyl de sódio, ou SDS, e a amostra é ainda mais misturada para promover a lise das células e a liberação de seu conteúdo, incluindo DNA.
A incubação a uma alta temperatura é então realizada para lise todas as células bacterianas restantes. As amostras são centrifugadas, e uma extração e incubação de polietileno glicol é realizada no supernante, a fim de precipitar o DNA, que é então centrifuado em uma pelota.
O DNA é resuspengiado em Te Buffer e acetato de potássio, a fim de lavar ainda mais o DNA de proteínas e polissacarídeos, em seguida, centrifugação é realizada para pelotar esses componentes indesejáveis. O supernante aquoso contendo o DNA é removido, e submetido a uma extração fenol-clorofórmio e precipitação isopropanol para limpar e concentrar ainda mais o DNA. Após um período de incubação da temperatura ambiente de duas horas, o DNA é centrifutado e resuspendido no Te Buffer para armazenamento até a análise.
Agora que estamos familiarizados com os conceitos e processos por trás da extração de DNA da comunidade bacteriana, vamos dar uma olhada em como ele é realizado em laboratório.
Para iniciar o procedimento, pese 100 g de solo peneirado. Adicione isso a um vaso de polipropileno, e adicione 100 mL de tampão de extração composto de tampão Tris alterado com EDTA para promover a liberação de bactérias da matriz do solo, em seguida, aperte à mão.
Em seguida, pese 100 g de contas de vidro, e adicione-as ao recipiente de mistura. Agitar a amostra por 5 minutos usando um dispositivo de batida de contas ou um agitador mecânico de ação de pulso. Adicione 10 mL 20% de sulfato de dodecil de sódio, ou SDS, à mistura e, em seguida, agitar por mais um minuto. Incubar a uma alta temperatura por 60 minutos.
Distribua igualmente a amostra entre tubos separados de 50 mL e centrífuga por 10 min a 6.000 x g. Transfira o supernatante dos tubos para um único recipiente estéril. Em seguida, repita a extração na pelota do solo como descrito anteriormente, utilizando um novo volume de tampão de extração.
Em seguida, adicione o volume total de supernanato processado a um tubo limpo de 50 mL preenchido ao meio volume com uma solução de 30% de polietileno glicol e cloreto de sódio de 1,6 M. Inverta as garrafas várias vezes à mão para misturar e incubar à temperatura ambiente por 2h. Centrífuga amostras a 10.000 x g por 20 minutos para pelotar o DNA.
Remova o supernatante cuidadosamente do tubo centrífuga, deixando para trás a pelota de ácido nucleico parcialmente purificada. Adicione 20 mL de TE Buffer e 1,5 mL de uma solução de acetato de potássio de 7,5 M para resuspensar a pelota, depois vórtice. Coloque a suspensão no gelo por 5 minutos. Centrifugar a 16.000 x g por 30 min a 4 °C para precipitar proteínas e polissacarídeos.
Em seguida, adicione um RNAse e proteinase K à amostra, misture suavemente à mão e deixe descansar por momento. Adicione um volume equivalente de fenol:clorofórmio:álcool isoamyl à suspensão a ser extraído e misture suavemente à mão. Centrifugar a preparação para 10 min a 13.000 x g. Remova cuidadosamente o vaso da centrífuga e observe as duas camadas.
A camada inferior e mais pesada é composta do fenol:clorofórmio: álcool isoamyl e detritos extraídos, e a camada superior é a aquosa e contém o DNA. Coloque a fase aquosa em um vaso estéril, adicione um volume equivalente de isopropanol e inverta suavemente para iniciar a precipitação do DNA. Incubar a suspensão em temperatura ambiente por 2h. Pellet o DNA purificado por centrifugação a 16.000 x g por 30 min. Remova cuidadosamente o supernasciente, pois o DNA pelleted pode ou não ser visível na parte inferior do vaso e, em seguida, resuspend em 1 mL de TE Buffer.
Usando um fluorímetro de quantificação de DNA/RNA, meça o nível de DNA extraído da amostra. Fluorímetros de DNA/RNA produzirão níveis de DNA em unidades de nanogramas por mililitro. Se a concentração for muito alta para leituras precisas, dilui a suspensão de 1 a 10, ou 1 a 100 usando água de grau molecular.
Uma vez que o DNA é obtido de uma comunidade bacteriana, isso pode ser utilizado de várias maneiras diferentes. Algumas dessas aplicações são exploradas aqui.
Análises espectrofotográficas do DNA extraído do DNA comunitário podem fornecer uma visão do número de células bacterianas presentes em uma determinada amostra de solo. A quantidade estimada de DNA em ng por mL de solução pode estar relacionada ao volume total de DNA extraído em solução, para dar a quantidade total de DNA por g de solo. Sabendo o valor teórico do DNA por célula, o número total de células por g do solo pode ser calculado.
Para aplicações mais direcionadas, o DNA extraído de comunidades bacterianas pode ser submetido ao PCR para determinar se uma determinada espécie está presente dentro da comunidade. Por exemplo, os cientistas podem querer identificar se as amostras de solo contêm patógenos específicos, como clostridium perfringens ou Bacillus anthracis.
Finalmente, para obter uma compreensão mais abrangente das bactérias presentes em uma comunidade, as amostras de DNA podem ser submetidas a caracterização "omic" e bioinformática que permitem uma análise mais profunda das bactérias originais dentro da amostra. "Omics" descreve uma série de tecnologias que exploram papéis, relacionamentos e ações de moléculas em organismos ou comunidades. Isso inclui os estudos de genes e sua função, ou "Genômica", e "Proteômica", o estudo de proteínas e seus papéis. Por exemplo, o sequenciamento do RNA 16S das amostras pode permitir uma determinação metagenômica de espécies específicas dentro da comunidade, dando uma estimativa mais detalhada da diversidade. Essa abordagem pode dar aos cientistas uma melhor compreensão da composição das espécies de uma comunidade, e quais papéis eles podem estar empreendendo.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à extração de DNA da comunidade bacteriana. Agora você deve entender como extrair DNA de uma comunidade bacteriana, como verificar a qualidade deste DNA, e como esse DNA pode ser usado para investigações da composição da comunidade bacteriana. Obrigado por assistir!
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Applications and Summary
O DNA comunitário de colônias cultivadas ou extraídos do solo pode ser submetido a abordagens bioinformáticas e "omic" que permitem a caracterização das bactérias originais dentro da amostra. As abordagens omicais incluem metagenômica – determinação de "quem" está dentro da comunidade através de sequenciamento de rRNA 16S. Isso dá uma estimativa da diversidade dentro da comunidade.
O número de células bacterianas na amostra original do solo também pode ser calculado. O DNA comunitário é extraído de um solo e quantificado por análises espectroscópicas. A quantidade estimada de DNA medido como DNA μg por mL de solução está relacionada ao volume total de DNA extraído em solução para dar uma quantidade total de DNA por g de solo. Sabendo o valor teórico do DNA por célula, o número total de células por g de solo pode ser calculado.
Exemplo
Um solo tem 0,12 μg de DNA por g de solo
Se cada célula tem 4 fg de DNA
O DNA da comunidade extraído pode ser submetido à análise pcr usando primers específicos para determinar se uma determinada espécie está presente dentro da comunidade. Exemplos incluem patógenos bacterianos específicos, como clostridium perfringens ou Bacillus anthracis.
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