Overview
Quelle: Labor von Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Trennung Technik, die Moleküle in einem elektrischen Feld je nach Größe und Ladung trennt. CE erfolgt in einer kleinen Glasröhre genannt eine Kapillare, die mit einer Elektrolytlösung gefüllt ist. Analyten sind aufgrund von Unterschieden bei der elektrophoretischen Mobilität, getrennt mit Ladung, solvent Viskosität und Größe variiert. Traditionelle Elektrophorese in den Gelen beschränkt sich in der Höhe von Spannung, die angewendet werden kann, weil Joule Heizung Auswirkungen das Gel und die Trennung zu ruinieren. Kapillaren haben ein große Oberfläche Bereich-zu-Volumen-Verhältnis und damit entstehende Wärme besser. Daher die Spannungen beantragt eine Kapillarelektrophorese-Experiment sind recht groß, oft 10.000 – 20.000 V.
Kapillarelektrophorese eignet sich für Hochleistungs-Trennungen. Im Vergleich zu Flüssigchromatographie, sind CE Trennungen oft schneller und effizienter. Jedoch funktioniert Kapillarelektrophorese am besten, um geladene Moleküle zu trennen, die ist keine Einschränkung der Flüssigkeitschromatographie. CE hat eine höhere Gipfel Kapazität als Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), d. h. die Trennungen sind effizienter und mehr Peaks detektiert werden. Die Instrumentierung kann sehr einfach sein. Allerdings HPLC ist vielseitiger und viele stationäre und mobile Phasen wurden für verschiedene Arten von Molekülen.
Principles
Kapillarelektrophorese trennt Moleküle aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilitäten. Ein Molekül elektrophoretische Mobilität hängt seine Ladung und wieviel es angezogen oder abgestoßen durch die Spannung sowie die kraftschlüssige Widerstandskraft, die Bewegung widersteht. Reibung ist proportional zum Radius des Moleküls. So basiert die elektrophoretische Mobilität auf Größe und Ladung. Die Geschwindigkeit reist ein geladenes Molekül ab einer Kapillare ist das Produkt seine elektrophoretische Mobilität und angewandten elektrischen Feldes. Höhere Spannungen führen deshalb zu schnelleren Geschwindigkeiten und schnellere Trennungen.
Die meisten Kapillarelektrophorese Instrumente werden mit der negativen Spannung am Detektor Ende und die positive Spannung am Eingang eingerichtet. Dies bedeutet, dass positiv geladene Moleküle in Richtung der Kathode am Ende, wandern während negativ geladene Moleküle anders migrieren. Alle Moleküle sind jedoch am Detektor gesehen, da gibt es eine Masse Flüssigkeitsströmung Elektroosmotischer Fluss genannt. Die Migrationsreihenfolge ist daher positiv geladen, neutral und dann negativ geladene Moleküle.
Elektroosmotischer Fluss entsteht durch Anlegen einer hohen Spannung an ein kleines Glas Kapillare mit einer Salzlösung gefüllt. Die positiv geladenen Ionen in die Salzlösung bilden einen double-Layer mit den negativ geladenen Silanol-Gruppen an den Wänden des Glases. Wenn eine negative Spannung bis zum Ende der Kapillare angewendet wird, zieht es die Kationen aus der double-Layer, die auch die Lösung, um es durch Reibungskräfte zieht. Diese Art der Strömung ist Stecker geformt und führt zu weniger Band-Erweiterung als die parabolisch geformten Fluss Stecker der HPLC.
Neutrale Moleküle, die alle mit der gleichen Rate wie den Elektroosmotischer Fluss fließen. Jedoch kann eine Pseudo-stationäre Phase auf die geführten Puffer Form Micellen, die Moleküle in die und aus der partition können hinzugefügt werden. Eine typische Pseudo-stationäre Phase ist Natrium Dodecylsulfate. Die Micellen sind auf der Außenseite negativ geladen, so sie eine elektrophoretische Mobilität, haben d. h. die Zeit in der Micelle die Migration der Zeit bestimmt. Diese Form der Kapillarelektrophorese nennt man Mizellen elektrokinetischen Chromatographie (MEKC).
Erkennung in CE ist ähnlich wie für HPLC. UV-Vis ist allgemein und benötigt keine Kennzeichnung, solange das Molekül eine Doppelbindung hat. Die Extinktion hängt jedoch die Weglänge, die für eine 50-µm-Kapillare klein ist. Eine Blase Zelle oder Z-Zelle wird die Pfadlänge zunehmen. Laserinduzierte Fluoreszenz ist ein empfindlicher Nachweisverfahren. Ein Laser ist durch ein Fenster in die Kapillare und Fluoreszenz des Produkts gemessen glänzte. Während Fluoreszenz sehr hohen Empfindlichkeit bietet, bedarf es in der Regel Moleküle gekennzeichnet werden, weil die meisten nicht fluoreszierend. Elektrochemische Detektion und Elektrospray Massenspektrometrie Erkennung sind an Popularität gewinnt. Das Problem mit einem dieser Detektoren ist, dass die hohe Spannung aus der Trennung zu Boden vor den Nachweis gebracht werden muss, Elektrochemie und Elektrospray das Anlegen einer Spannung erfordert sowie die CE-Spannung kann stören. Neue Methoden der Entkoppelung der CE-Spannung, mit Elektroden Strom oder ein kleiner Riss in der Kapillare abtropfen lassen überwinden diese Herausforderungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
(1) CE Instrumentierung Setup
- Das CE-Gerät und den Computer einschalten. Computersoftware, schalten Sie die Lichtquelle für UV-Analyse, zum Aufwärmen zu können. Einige Software hat einen Indikator, wenn die Lampe betriebsbereit ist (Lampe-Symbol dreht sich Farbe).
- Machen Sie eine Methoden-Datei. Legen Sie die wichtigen Parameter für die Ausführung der CE. In dieser Analyse sind die Temperaturen der Patrone und Sample Speicherung 35 ° C. Die Wellenlänge für UV-Detektion ist 214 nm.
- Schreiben Sie ein Zeitprogramm. Das Programm besteht im Allgemeinen aus Spülen Schritte (zum Reinigen der Kapillare vor der Analyse), Injektion Schritte, und dann ein Elektrophorese-Schritt. Führen Sie für den Spülgang Schritt 2 Spülungen 1 min. mit 20 Psi Druck. Die erste Spülung ist mit NaOH, die hilft, sicherzustellen, dass die Silanol-Gruppen an der Kapillare Wand deprotonierten sind. Die zweite Spülung ist mit laufen Puffer (0,025 M Borat Puffer hier) um sicherzustellen, dass die Kapillare links mit Puffer equilibriert ist.
- Für die Injektion dient Druck Injektion bei 0,5 Bar für 5 s.
- Die Bedingungen sind für den Schritt Elektrophorese Trennung Spannung: 20 kV, Zeit: 5 min, normale Polarität. Für jeden Schritt auch geben Sie an, welche Vial ist der Einlass und die Fläschchen der Steckdose ist. Speichern Sie die Methoden-Datei, nachdem alle Parameter eingegeben werden.
2. Vorbereitung der Standards und Soda Proben
- 500 ppm Stammlösungen von Aspartam, Koffein und Benzoesäure im Wasser zu machen. 50 mL, mit einem volumetrischen Kolben zu machen.
- Machen Sie eine standard-Lösung von 150 ppm Aspartam, 150 ppm Koffein und 100 ppm Benzoesäure in einem volumetrischen 10-mL-Kolben.
- Machen Sie standard Koffein Lösungen von 50 ppm, 100 ppm und 150 ppm 200 ppm in eine volumetrische 10-mL-Fläschchen.
3. führen Sie die Proben auf die CE
- Legen Sie die Fläschchen mit Normen oder Soda Proben in den Probe-Fläschchen-Halter. Achten Sie darauf, notieren Sie sich die Probe im Steckplatz befindet. Zwei Schlitze haben die Borat Puffer und der 0,1 M NaOH Spüllösung laufen.
- In der Datei Methode ist Eingang, der die ersten Probenfläschchen slot.
- Einen einzigen Lauf, und achten Sie auf die Eingabe der Dateninformationen das Programm erwerben Anfragen.
- Weiterhin Daten, ändern der Eingabe Fläschchen für jede Probe zu erwerben. Führen Sie die Kombination Standard, 3 Konzentrationen von Koffein und eine Pepsi und Diät-Pepsi Probe.
- Legen Sie das Ziel in das Instrument und wählen Sie das geeignete Instrument.
- Analysieren Sie die Daten auf dem Computer. Berechnung der Peakflächen und Overlay-Standards und realen Proben, um Spitzen zu identifizieren. Machen Sie eine Eichkurve für die Koffein-Daten.
Kapillarelektrophorese oder CE, ist eine Technik, die in der chemischen Analytik verwendet, um Moleküle in einem elektrischen Feld je nach Größe und Ladung zu trennen.
Kapillarelektrophorese erfolgt in einem Sub-Millimeter Durchmesser Rohr, genannt eine Kapillare, die eine flüssigen Elektrolyt-Lösung enthält. Die Probe wird in die Kapillare gespritzt, und ein elektrisches Feld angelegt wird. Die Moleküle werden dann basierend auf den Unterschied in ihrer Geschwindigkeit, getrennt von Ladung, die Größe und das Lösungsmittel Viskosität beeinflusst wird. CE ist ideal für die Trennung von geladenen Molekülen und hat eine höhere Auflösung als Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ist damit effizienter und empfindlich.
Dieses Video wird Grundkenntnisse über Kapillarelektrophorese und seine Verwendung durch die Bestimmung der Zusammensetzung der ein alkoholfreies Getränk zu demonstrieren.
In CE wird ein elektrisches Feld einer Kapillare mit einem Elektrolyten gefüllt. Das elektrische Feld induziert eine positive Ladung am Kapillaren Eintritt und eine negative Ladung an der Steckdose.
Der Elektrolyt fließt innerhalb der Kapillare, induziert durch das elektrische Feld. Diese Strömung, genannt Elektro-osmotischen Fluss, verursacht durch die Bewegung einer diskreten Schicht aus positiv geladenen Salzionen entlang der negativ geladenen Kapillarwände.
Als die elektrische aktuelle läuft durch die Kapillare bewegen sich die kationen an der Wand entlang auf dem negativen Ende. Diese Ionen-Fluss zieht die Lösung in der Mitte durch das Rohr.
Die Probe, die Moleküle dann getrennt sind anhand ihrer Geschwindigkeit innerhalb der Kapillare. Diese Geschwindigkeit, genannt elektrophoretische Mobilität hängt die Moleküle Ladung und Größe und wie viel es angezogen oder durch ein elektrisches Feld abgestoßen.
Positiv geladene Moleküle fließen schneller durch die Kapillare, wie sie das Potential am Ausgang mehr angezogen werden. Negativ geladene Moleküle fließen viel langsamer, da sie mehr auf das Potential am Einlass angezogen werden. Neutrale Moleküle werden zusammen mit dem größten Fluss durchgeführt. Daher ist die Reihenfolge der Moleküle verlassen die Kapillare positiv geladen, neutral und dann negativ geladen. Darüber hinaus zieht die Elektrolyt-Fluss kleinere Moleküle schneller als größere Moleküle durch Reibungskräfte.
Moleküle werden von einem Detektor, wie UV-Vis, aufgezeichnet, wie sie die Spalte beenden, und sind auf einem Grundstück von Detektor Signalintensität im Vergleich zur Zeit, genannt ein Electropherogram visualisiert.
Electropherograms kann eine Reihe von Informationen liefern; so präsentieren wie viele andere Verbindungen sind in einer Probe und die Menge jedes Stoffes.
Jetzt, wo Sie eine kurze Zusammenfassung der Kapillarelektrophorese gesehen haben, werfen wir einen Blick auf wie es im Labor durchgeführt wird.
Schalten Sie zunächst die Kapillarelektrophorese Instrument und Computer. Dann schalten Sie die UV-Detektor, zum Aufwärmen zu können.
Legen Sie die Parameter für die Durchführung des Experiments. Erstens, stellen Sie die Temperatur für die Patrone und Sample Speicherung auf 35 ° C und die Wellenlänge für UV-Detektion, 214 nm.
Richten Sie nun die Schritte zwei spülen. Die erste Spülung ist mit Natriumhydroxid um sicherzustellen, dass die Silanol-Gruppen an der Kapillare Wand protonierten sind. Zweite Spülgang verwendet laufenden Puffer um die Kapillare equilibrate. Legen Sie dann die Probe injizieren bei 0,5 Bar für 5 s.
Die Elektrophorese Schritt durch Auswahl der Trennung Spannung festgelegt. In diesem Fall verwenden Sie 20 kV für 5 min mit normaler Polarität, was bedeutet, dass das elektrische Feld positiv am Eingang und am Ausgang negativ ist.
Zuerst bereiten Sie 50 mL Stammlösungen der Soda Komponenten Aspartam, Koffein und Benzoesäure bei 500 Teile pro Million im Wasser.
Machen Sie von der Stammlösungen eine Standardlösung von 150 ppm Aspartam, 150 ppm Koffein und 100 ppm Benzoesäure.
Stellen Sie anschließend 4 Standardlösungen von Koffein auf 50, 100, 150 und 200 ppm. Diese Proben werden zu einer Kalibrationskurve benutzt werden. Weitere Informationen sehen Sie diese Sammlung auf Kalibrierkurven video an.
Schließlich bereiten Sie die Soda-Proben durch Entgasung sie mit Stickstoff. Mit keine Verdünnung werden die Soda-Proben analysiert.
Legen Sie die Fläschchen mit entweder Standard oder Soda Proben in den Fläschchen-Halter. Die Ampullen mit der geführten Puffer und der Natronlauge Spülen in der Probenhalter sowie zu platzieren. Achten Sie auf die Lage der einzelnen zu erfassen.
Geben Sie in der CE-Gerätesoftware an, welche Slots die zwei spülen-Lösungen und die ersten Probenfläschchen enthalten. Führen Sie nun die erste Probe.
Dann führen die Kombination Standard, 4 Konzentrationen von Koffein und eine regelmäßige und Diät-Limo Probe durch Ändern der Eingabe Durchstechflasche.
Wenn alle Lösungen getrennt wurden, analysieren Sie die Daten.
Verwenden Sie zuerst die Standards, um die Gipfel in den Soda-Proben zu identifizieren. Ein Vergleich der drei Zinnen beobachtet in der Diät Soda Probe nach den Standards zeigt, dass Koffein, Aspartam und Benzoesäure in der Diät-Cola vorhanden sind. In der regelmäßigen Natron-Probe ist nur der Koffein-Gipfel Gegenwart, aber nicht die Aspartam und Benzoesäure Gipfeln.
Dann berechnen Sie die Peakfläche für jede Koffein-standard-Lösung und machen Sie eine Kalibrierungskurve zu. Die Eichkurve für Koffein kann verwendet werden, um die Konzentration von Koffein in jeder Probe zu berechnen.
Kapillarelektrophorese wird für viele Spezialität Trennungen im akademischen und industriellen Einstellungen verwendet.
CE wird oft als eine Komponente der pharmazeutischen Industrie Qualitätskontrolle verwendet. Drogen, entweder als kleine Moleküle oder Biologics, können ausgeführt werden, durch Kapillarelektrophorese zu sehen, wenn jede Seite Produkte vorhanden sind. Es kann auch verwendet werden, um festzustellen, ob Proteine richtig gefaltet sind, als Faltung Proteinladung beeinflussen können.
CE kann auch verwendet werden, um DNA zu trennen. Mit einer Microwell-Platte und mehreren Arrays von Kapillaren, können Forscher den Durchsatz von einem einzigen Experiment erhöhen, wie hier gezeigt. DNA-Fragmente wurden je nach Größe, mit einer Auflösung bis 1 Basenpaar getrennt. Fragmente der Sequenzierung der DNA wird dadurch möglich, zusammen mit anderen Parametern wie Copy Number Varianten, zu bestimmen, welche verwendet wird, um mögliche genetische Krankheiten zu diagnostizieren.
Ein Protein kann von verschiedenen funktionellen Gruppen geändert werden, die chemisch an verschiedenen Orten verbunden sind. Verschiedene Kopien des gleichen Proteins können variieren mit verschiedenen Modifikationen, die die Ladung und Größe jedes Proteins verändern wird. Läuft der gereinigten Proteine durch eine CE, die mit einem Massenspektrometer verbunden ist kann Proteine basierend zu trennen, auf denen Änderungen vorhanden sind, und auch zu identifizieren, Art und Ort der Änderung.
Sie habe nur Jupiters Einführung in die Kapillarelektrophorese beobachtet. Sie sollten jetzt verstehen, wie CE Moleküle basierend auf Ladung und Masse trennt, und wie man eine Probe auf die CE im Labor laufen.
Danke fürs Zuschauen!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
Electropherograms gesammelt für Diät Pepsi und Pepsi Proben sind in den Abbildungen 1 und 2, bzw. gezeigt. Die drei Zinnen für Koffein, Aspartam und Benzoesäure Diät Pepsi eingehalten werden und haben ähnliche Zugzeiten als Maßstab. Für reguläre Pepsi ist der Koffein-Gipfel vorhanden, aber nicht die Aspartam und Benzoesäure Gipfel. Die CE-Analyse ist schnell, wie die Zugzeiten nur 3 – 4 Minuten sind.
Die Eichkurve für Koffein ist in Abbildung 3dargestellt. Diese Kurve kann verwendet werden, um die Konzentration von Koffein in jeder Probe zu berechnen.
Abbildung 1: CE-Analyse der Diet Pepsi. Die roten sind Koffein, Aspartam und Benzoesäure. Die schwarze ist eine Diät Pepsi Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: CE-Analyse von Pepsi. Die schwarze ist eine Pepsi-Probe während die rote eine Probe von Koffein, Aspartam und Benzoesäure. Es gibt kein Aspartam oder Benzoesäure, unter Angabe der Soda ist keine Diät. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Koffein-Kalibrierung-Grundstück mit CE. Ein Grundstück für Koffein-Standards gemessen mit CE-Bereich Vs Spitzenkonzentration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
Kapillarelektrophorese wird für viele Spezialität Trennungen verwendet. Beispielsweise ist es in der pharmazeutischen Industrie für Qualitätsprüfung, um sicherzustellen, dass keine Nebenprodukte oder Interferents verwendet. CE ist besonders nützlich für Drogen mit einer grundlegenden Aminogruppe zu trennen, da die Wände der Kapillaren mit einem sauren pH-Wert neutral erfolgen können und somit das Medikament nicht Sie sich an der Kapillare halten wird.
Ein CE-Modus wurde auch zur Sequenz des menschlichen Genoms und DNA zu trennen. Dieser Modus der CE ist Kapillar Gelelektrophorese und für diese Trennungen ist ein Polymer in der CE-Kapillare injiziert. Das Polymer gibt eine zusätzliche Art der Trennung abhängig von der Größe, wie die kleineren Fragmente durch das Gel schneller reisen können. Dies nennt man Siebung, und zusammen mit der elektrophoretischen Trennung hat es 1 Basenpaar-Auflösung für DNA-Analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
