Overview
מקור: המעבדה של ד"ר .B ג'יל וטון - אוניברסיטת וירג'יניה
אלקטרופורזה נימית (CE) היא טכניקת הפרדה המפרידה בין מולקולות בשדה חשמלי בהתאם לגודל ומטען. CE מבוצע בצינור זכוכית קטן הנקרא נימי מלא בתמיסת אלקטרוליטים. ניתוחים מופרדים עקב הבדלים בניידות אלקטרופורטית, המשתנה עם מטען, צמיגות ממס, וגודל. אלקטרופורזה מסורתית בג'לים מוגבלת בכמות המתח שניתן ליישם מכיוון שאפקטי חימום ג'ול יהרסו את הג'ל ואת ההפרדה. נימים יש יחס שטח נפח גדול ובכך לפזרים חום טוב יותר. לכן, המתחים החלים לניסוי אלקטרופורזה נימי הם די גדולים, לעתים קרובות 10,000-20,000 V.
אלקטרופורזה נימית שימושית להפרדות בעלות ביצועים גבוהים. בהשוואה לכרומטוגרפיה נוזלית, הפרדות CE הן לעתים קרובות מהירות ויעילות יותר. עם זאת, אלקטרופורזה נימית פועלת בצורה הטובה ביותר להפריד מולקולות טעונות, אשר אינו מגבלה של כרומטוגרפיה נוזלית. ל- CE יש קיבולת שיא גדולה יותר מאשר כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), כלומר ההפרדות יעילות יותר וניתן לזהות פסגות נוספות. המכשור יכול להיות פשוט מאוד. עם זאת, HPLC הוא רב-תכליתי יותר ושלבים נייחים וניידים רבים פותחו עבור סוגים שונים של מולקולות.
Principles
אלקטרופורזה נימית מפרידה בין מולקולות בשל העיסוק האלקטרופורטי שלהן. הניידות האלקטרופורטית של המולקולה תלויה בטעינה שלה וכמה היא נמשכת או נדחית על ידי המתח, כמו גם כוח הגרירה החיכוך המתנגד לתנועה. החיכוך פרופורציונלי לרדיוס המולקולה. לכן, ניידות אלקטרופורטית מבוססת על גודל ומטען. המהירות שמולקולה טעונה נעה במורד נימי היא תוצר של הניידות האלקטרופורטית שלה והשדה החשמלי המיושם. מתחים גבוהים יותר מובילים לפיכך למהירויות גבוהות יותר ולהפרדות מהירות יותר.
רוב מכשירי אלקטרופורזה נימיים מוגדרים עם המתח השלילי בקצה הגלאי והמתח החיובי בפתח. משמעות הדבר היא כי מולקולות טעונות חיובית נודדות לכיוון הקתודה בסוף, בעוד מולקולות טעונות שליליות נודדות לכיוון השני. כל המולקולות נראות בגלאי עם זאת, כי יש זרימת נוזל בתפזורת הנקראת זרימה אלקטרוסמוטית. לפיכך, סדר ההעברה טעון לחיוב, ניטרלי ולאחר מכן מולקולות בעלות טעון שלילית.
זרימה אלקטרו-אמוטית נגרמת על ידי החלת מתח גבוה על נימי זכוכית קטנה מלאה בתמיסת מלח. היונים הטעונים לחיוב בתמיסת המלח יוצרים שכבה כפולה עם קבוצות הסילנול הטעונות השליליות על קירות הזכוכית. כאשר מתח שלילי מוחל על קצה הנימי, הוא מושך את הסיוציות מהשכבה הכפולה, אשר גם מושך את הפתרון סביבו עקב כוחות חיכוך. סוג זה של זרימה הוא בצורת תקע ומוביל להרחבת פסים פחות מאשר תקעי הזרימה בצורת פרבולית של HPLC.
מולקולות נייטרליות כולן זורמות באותו קצב כמו הזרימה האלקטרו-אסמוטית. עם זאת, ניתן להוסיף שלב פסאודו-נייח למאגר הריצה כדי ליצור מיצלים שמולקולות יכולות לחלק פנימה והחוצה ממנו. שלב פסאודו-נייח טיפוסי הוא נתרן דודצילספט. המיצלות טעונות לרעה מבחוץ, כך שיש להן ניידות אלקטרופורטית, כך שהזמן המושקע במצ'ל קובע את זמן הנדידה. צורה זו של אלקטרופורזה נימית נקראת כרומטוגרפיה אלקטרוקינטית מיצלרית (MEKC).
הזיהוי ב- CE דומה לזה של HPLC. UV-Vis הוא כללי ואינו דורש תיוג כל עוד למולקולה יש קשר כפול. עם זאת, הספיגה תלויה באורך הנתיב, שהוא קטן עבור נימי 50 מיקרומטר. תא בועה או תא z יגדילו את אורך הנתיב. פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי לייזר היא שיטת זיהוי רגישה יותר. לייזר נוצץ דרך חלון נימי ופלואורסצנטיות של המוצר הנמדד. בעוד פלואורסצנטיות מספקת רגישות גבוהה מאוד, זה בדרך כלל דורש מולקולות להיות מתויג כי רוב אינם פלואורסצנטיים. זיהוי אלקטרוכימי וזיהוי ספקטרומטריית מסה אלקטרוספרי צוברים פופולריות. הבעיה עם אחד מהגלאים האלה היא שיש להביא את המתח הגבוה מההפרדה לקרקע לפני הזיהוי, שכן אלקטרוכימיה ואלקטרו-ספריי דורשים יישום של מתח ומתח CE יכול להפריע. שיטות חדשות לפירוק מתח CE, באמצעות אלקטרודות כדי לנקז את הזרם או סדק קטן נימי, מתגברות על אתגרים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הגדרת מכשור CE
- הפעל את כלי ה- CE ואת המחשב. באמצעות תוכנת המחשב, הפעל את מקור האור לניתוח UV כדי לאפשר לו להתחמם. לתוכנה מסוימת יש מחוון כאשר המנורה מוכנה לשימוש (סמל המנורה הופך צבע).
- הפוך קובץ שיטות. הגדר את הפרמטרים החשובים להפעלת CE. בניתוח זה הטמפרטורות של מחסנית ואחסון מדגם הם 35 °C (5 °F). אורך הגל לגילוי UV הוא 214 ננומטר.
- כתוב תוכנית זמן. התוכנית מורכבת בדרך כלל של שלבי שטיפה (כדי לנקות את נימי לפני הניתוח), צעדי הזרקה, ולאחר מכן צעד אלקטרופורזה. לקבלת שלב השטיפה, בצע 2 שטיפות במשך 1 דקות באמצעות 20 פסאיי של לחץ. השטיפה הראשונה היא עם NaOH, אשר מסייע לוודא את קבוצות סילנול על הקיר נימי הם deprotonated. השטיפה השנייה היא עם חוצץ ריצה (0.025 M מאגר בוראט כאן) כדי לוודא הנימי נשאר שיווי משקל עם חוצץ.
- עבור הזריקה, הזרקת לחץ משמש ב 0.5 פסאיי עבור 5 s.
- עבור שלב אלקטרופורזה, התנאים הם מתח הפרדה: 20 kV, זמן: 5 דקות, קוטביות נורמלית. עבור כל צעד, גם לציין איזה ביון הוא מפרצון איזה בון הוא השקע. שמור את קובץ השיטות לאחר הזנת כל הפרמטרים.
2. הכנת תקנים ודגימות סודה
- הכינו פתרונות מלאי של 500-ppm של אספרטיים, קפאין וחומצה בנזואית במים. הפוך 50 מ"ל מכל אחד, באמצעות בקבוקון נפחי.
- הפוך פתרון סטנדרטי של אספרטיים 150 ppm, 150 ppm קפאין, וחומצה בנזואית 100 ppm בבקבוק נפחי 10 מ"ל.
- הפוך פתרונות קפאין סטנדרטיים של 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, ו 200 ppm ב 10 מ"ל צלוחיות נפחיות.
3. הפעל את הדגימות על CE
- מניחים את הבקבוקונים המכילים תקנים או דגימות סודה לתוך מחזיק הבקבוקון לדוגמה. הקפד לרשום איזו דגימה נמצאת באיזה חריץ. שני חריצים כוללים את חיץ הריצה של borate ואת פתרון השטיפה של NaOH ב- 0.1 M.
- בקובץ פעולת השירות, קלט באיזה חריץ נמצא קובץ הטעימה הראשון.
- השג הפעלה בודדת, תוך הקפדה להזין את כל מידע הנתונים שהתוכנית מבקשת.
- המשך לרכוש נתונים, שינוי מטען הקלט עבור כל דוגמה. הפעל את תקן השילוב, 3 ריכוזי קפאין, ודגימת פפסי ותזונה פפסי.
- הכנס את המטרה לכלי ובחר את הכלי המתאים.
- נתח את הנתונים במחשב. חשב את אזורי השיא ואת תקני שכבת העל ואת הדגימות האמיתיות כדי לסייע בזיהוי פסגות. הפוך עקומת כיול עבור נתוני קפאין.
אלקטרופורזה נימית, או CE, היא טכניקה המשמשת בניתוח כימי להפרדת מולקולות בשדה חשמלי בהתאם לגודל ומטען.
אלקטרופורזה נימית מבוצעת בצינור בקוטר תת-מילימטר, הנקרא נימי, המכיל פתרון אלקטרוליט זורם. המדגם מוזרק לתוך נימי, ושדה חשמלי מוחל. לאחר מכן מופרדות המולקולות בהתבסס על ההבדל במהירותן, המושפעת מהמטען, הגודל והצמיגות של הממס. CE אידיאלי להפרדה של מולקולות טעונות ויש לו רזולוציה גדולה יותר מאשר כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, מה שהופך אותה ליעילה ורגישה יותר.
וידאו זה יציג את היסודות של אלקטרופורזה נימי ולהדגים את השימוש בו על ידי קביעת הרכב של משקה קל.
ב- CE, שדה חשמלי מוחל על נימי מלא אלקטרוליט. השדה החשמלי גורמת למטען חיובי בפרצון הנימי, ומטען שלילי בשקע.
האלקטרוליט זורם בתוך הנימי, המושרה על ידי השדה החשמלי. זרימה זו, הנקראת זרימה אלקטרו-אוסמוטית, נגרמת על ידי תנועה של שכבה נפרדת של יונים מלוחים טעונים חיובית לאורך קירות נימים טעונים שלילית.
כאשר הזרם החשמלי עובר דרך הנימי, הציטוטים לאורך הקיר נעים לעבר הקצה השלילי. זרימת היונים הזו מושכת את הפתרון במרכז דרך הצינור.
מולקולות המדגם מופרדות לאחר מכן על סמך מהירותן בתוך הנימי. מהירות זו, הנקראת ניידות אלקטרופורטית, תלויה במטען ובגודל של המולקולות, וכמה היא נמשכת או נדחית על ידי שדה חשמלי.
מולקולות טעונות באופן חיובי זורמות מהר יותר דרך הנימי, מכיוון שהן נמשכות יותר לפוטנציאל בשקע. מולקולות טעונות שליליות זורמות הרבה יותר לאט, מכיוון שהן נמשכות יותר לפוטנציאל בפרצון. מולקולות נייטרליות נישאות יחד עם הזרימה בתפזורת. לפיכך, סדר המולקולות היוצאות מהניני הוא טעון באופן חיובי, ניטרלי, ולאחר מכן טעון שלילית. בנוסף, זרימת האלקטרוליט מושכת מולקולות קטנות יותר מהר יותר ממולקולות גדולות יותר עקב כוחות חיכוך.
מולקולות נרשמות על ידי גלאי, כגון UV-Vis, כאשר הן יוצאות מהטור, והן דמיינו בעלילה של עוצמת אות גלאי לעומת זמן, הנקראת אלקטרופרוגרמה.
אלקטרופרוגרמה יכולה להניב מגוון של מידע; כגון כמה תרכובות שונות קיימות במדגם ואת כמות כל חומר.
עכשיו שראיתם תקציר קצר של אלקטרופורזה נימית, בואו נסתכל על איך זה מבוצע במעבדה.
ראשית, הפעל את מכשיר אלקטרופורזה נימי ומחשב. ואז להפעיל את גלאי UV כדי לאפשר לו להתחמם.
הגדר את הפרמטרים להפעלת הניסוי. ראשית, הגדר את הטמפרטורה עבור המחסנית ואחסון מדגם ל 35 °C (70 °F) ואת אורך הגל לגילוי UV ל 214 ננומטר.
לאחר מכן, הגדר את שני שלבי השטיפה. השטיפה הראשונה היא עם נתרן הידרוקסיד כדי להבטיח כי קבוצות סילנול על קיר נימי הם פרוטוניים. השטיפה השנייה משתמשת במאגר פועל כדי לתפלות את הנימי. לאחר מכן, להגדיר את המדגם להזריק ב 0.5 פסאיי עבור 5 s.
הגדר את שלב האלקטרופורזה, על-ידי בחירת מתח ההפרדה. במקרה זה, השתמש 20 kV במשך 5 דקות באמצעות קוטביות נורמלית, כלומר השדה החשמלי הוא חיובי בפרצון ושלילי בשקע.
ראשית, להכין 50 mL פתרונות מלאי של רכיבי סודה אספרטיים, קפאין, וחומצה בנזואית ב 500 חלקים למיליון במים.
מתוך פתרונות המלאי, לעשות פתרון סטנדרטי של אספרטיים 150 ppm, 150 ppm קפאין, ו 100 ppm חומצה בנזואית.
לאחר מכן, בצע 4 פתרונות סטנדרטיים של קפאין ב- 50, 100, 150 ו- 200 ppm. דגימות אלה ישמשו ליצירת עקומת כיול. לקבלת מידע נוסף, עיין בסרטון הווידאו של אוסף זה בעקומות כיול.
לבסוף, להכין את דגימות סודה על ידי degassing אותם עם חנקן. דגימות הסודה ינותחו ללא דילול.
מניחים את הבקבוקונים המכילים דגימות סטנדרטיות או סודה לתוך מחזיק הבקבוקון. מניחים את הבקבוקונים המכילים את חיץ הריצה ואת תמיסת שטיפת הנתרן הידרוקסיד גם לתוך מחזיק המדגם. הקפד לתעד את המיקום של כל אחד מהם.
בתוכנת מכשיר CE, ציין אילו חריצים מכילים את שני פתרונות השטיפה ואת מקטורינת הדגימה הראשונה. עכשיו, להריץ את המדגם הראשון.
לאחר מכן, להפעיל את תקן השילוב, 4 ריכוזים של קפאין, ודגימת סודה רגילה דיאטה על ידי שינוי מקטורינת הקלט.
כאשר כל הפתרונות הופרדו, נתח את הנתונים.
ראשית, להשתמש בתקנים כדי לזהות את הפסגות בדגימות סודה. השוואה בין שלוש הפסגות שנצפו בדגימת הסודה הדיאטה לסטנדרטים מראה כי קפאין, אספרטיים וחומצה בנזואית נמצאים בסודה הדיאטה. בדגימת הסודה הרגילה, רק שיא הקפאין קיים, אך לא פסגות אספרטיים וחומצה בנזואית.
לאחר מכן, חשב את אזור השיא עבור כל פתרון סטנדרטי קפאין, ובצע עקומת כיול. עקומת הכיול של קפאין יכולה לשמש לחישוב ריכוז הקפאין בכל דגימה.
אלקטרופורזה נימית משמשת להפרדות מיוחדות רבות בסביבה אקדמית ותעשייתית.
CE משמש לעתים קרובות כמרכיב אחד של בדיקות בקרת איכות בתעשיית התרופות. תרופות, כמו מולקולות קטנות או ביולוגיות, ניתן לרוץ דרך אלקטרופורזה נימית כדי לראות אם כל מוצרי צד קיימים. זה יכול לשמש גם כדי לקבוע אם חלבונים מקופלים כראוי, כמו קיפול יכול להשפיע על מטען חלבון.
CE יכול לשמש גם כדי להפריד DNA. באמצעות צלחת microwell ומערכים מרובים של נימים, חוקרים יכולים להגדיל את התפוקה של ניסוי יחיד, כפי שמוצג כאן. שברי דנ"א הופרדו על סמך גודל, עם רזולוציה של זוג בסיס אחד. זה הופך רצף שברי DNA אפשרי, יחד עם קביעת פרמטרים אחרים כמו העתק מספר וריאנטים, אשר משמש לאבחון מחלות גנטיות פוטנציאליות.
חלבון יכול להשתנות על ידי קבוצות פונקציונליות שונות המחוברות כימית למקומות שונים. עותקים שונים של אותו חלבון יכולים להשתנות עם שינויים שונים, אשר ישנו את המטען והגודל של כל חלבון. הפעלת החלבונים המטוהרים באמצעות CE המחובר לספקטרומטר מסה יכולה להפריד חלבונים על סמך השינויים הקיימים, וגם לזהות את סוג השינוי ואת מיקומו.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לאלקטרופורזה נימית. עכשיו אתה צריך להבין איך CE מפריד מולקולות בהתבסס על מטען ומסה, וכיצד להפעיל מדגם על CE במעבדה.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
אלקטרופרוגרמה שנאספו עבור דגימות פפסי ופפסי דיאט מוצגות באיורים 1 ו -2, בהתאמה. שלוש הפסגות של קפאין, אספרטיים וחומצה בנזואית נצפות בתזונה פפסי ויש להם זמני הגירה דומים לסטנדרטים. עבור פפסי רגיל, שיא הקפאין קיים אך לא פסגות אספרטיים וחומצה בנזואית. ניתוח CE מהיר מכיוון ש בזמני ההעברה הם 3-4 דקות בלבד.
עקומת הכיול של קפאין מוצגת באיור 3. עקומה זו יכולה לשמש לחישוב ריכוז הקפאין בכל דגימה.
איור 1. ניתוח CE של דיאט פפסי. האדומים הם סטנדרטים של קפאין, אספרטיים וחומצה בנזואית. השחור הוא דגימת פפסי דיאט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. ניתוח CE של פפסי. השחור הוא מדגם פפסי בעוד האדום הוא מדגם של סטנדרטים של קפאין, אספרטיים, וחומצה בנזואית. אין אספרטיים או חומצה בנזואית, המציין את הסודה היא לא דיאטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. עלילת כיול קפאין עם CE. חלקה של אזור השיא לעומת ריכוז לתקני קפאין נמדד עם CE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
אלקטרופורזה נימי משמש הפרדות מיוחדות רבות. לדוגמה, הוא משמש בתעשיית התרופות לבדיקות איכות, כדי לוודא שאין מוצרי צד או מפריעים. CE שימושי במיוחד להפרדת תרופות עם קבוצת אמינו בסיסית, כמו הקירות של נימי יכול להיות נייטרלי עם pH חומצי ולכן התרופה לא להיצמד נימי.
נעשה שימוש גם במצב CE לרצף את הגנום האנושי ולדנ"א נפרד. מצב זה של CE הוא אלקטרופורזה ג'ל נימי עבור הפרדות אלה, פולימר מוזרק לתוך נימי CE. הפולימר מעניק מצב נוסף של הפרדה בהתבסס על גודל, כמו שברים קטנים יותר יכול לנסוע מהר יותר דרך הג'ל. זה נקרא סינון, ויחד עם ההפרדה האלקטרופורטית, יש לו רזולוציית זוג בסיס אחד לניתוח DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
