Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Lab Animal Research

This content is Free Access.

Hebrew
 

Overview

מקור: קיי סטיוארט, RVT, RLATG, CMAR; ואלרי א. שרודר, אר.די.ג'י, אר-אל-ג'י. אוניברסיטת נוטרדאם, IN

איסוף דם הוא דרישה נפוצה למחקרים הכוללים עכברים וחולדות. שיטת נסיגת הדם בעכברים וחולדות תלויה בנפח הדם הדרוש, בתדירות הדגימה, במצב הבריאותי של החיה שיש לדמם, וברמת המיומנות של הטכנאי. 1 כל השיטות שנדונו- דימומים בסינוס רטרו-מסלולית, דימומים ראשוניים של חיתוך זנב ודימומים תוך-לבביים - דורשות שימוש בהרדמה כללית.

Principles

לפני הליך הדימום, יש לקבוע את סוג המדגם הנדרש. הליכים ניסיוניים עשויים לדרוש דם שלם, פלזמה או נסיוב. עבור דם שלם, יש להוסיף נוגד קרישה לדגימה. פלזמה, המכיל פיברינוגן וגורמי קרישה אחרים כאשר מופרדים מתאי הדם האדומים, ניתן לחלץ מדגם נוגד קרישה. סרום מתקבל באמצעות איסוף דם ללא נוגד קרישה. הנסיוב ייווצר מצנטריפוגה של הדגימה ברגע שנוצר קריש דם. כמו המדגם יש קרישה, הסרום לא יכיל פיברינוגן או גורמי קרישה אחרים. הן פלזמה והן סרום מתקבלים באמצעות צנטריפוגה לרוץ ב 2200-2500 סל"ד למשך מינימום של 15 דקות.

עבור מדגם שחייב להניב דם שלם או פלזמה, יש להשתמש נוגד קרישה מתאים. נוגדי קרישה נפוצים עבור חיות מעבדה הם הפרין, נתרן סיטראט, חומצה טטראצטית אתילנדיאמין (EDTA); הבחירה בה מבוססת על צרכי מחקר. ניתן לטעון ישירות למזרק צורה נוזלית של EDTA, הפרין ונתרן סיטראט. זה מאפשר מגע של נוגד קרישה ישירות כמו הדם נמשך, סיוע במניעת קרישה. כמו קרישי דם חולדה מהר יותר מאשר רוב דם היונקים, זה חיוני כי היחס הנכון של נוגד קרישה לדם ישמש לאיסוף דם.

בחירת המחט מבוססת על גודל החיה והאתר של venipuncture. באופן כללי, ככל שהשעמום של המחט גדול יותר, כך ניתן לאסוף את המדגם במהירות רבה יותר. פחות נזק לתאי הדם הוא יתרון נוסף למחטים גדולות יותר. עם זאת, החיסרון העיקרי למחטים גדולות הוא הנזק הפוטנציאלי לכלי הדם. על עכברים וחולדות, הבחירות של גודל נע בין 20-29 מחטים מד כי הם 0.5-1.5 אינץ 'אורך. אם מחט ארוכה מדי, לא רק שזה מביך לשימוש, אבל יש את המרחב הנוסף במחט יכול לגרום קרישה. גודל המחט המתאים מופיע עבור כל שיטה בסעיף ההליכים.

יש גם תגדיר מראש את גודל המדגם הנדרש. בשל הגודל הקטן של העכבר או החולדה, יש לחשב את הכמות המרבית של איסוף דם עבור דימום הישרדותי. עכבר ממוצע במשקל 25 גרם יש נפח דם כולל של 1.8 מ"ל; החולדה הממוצעת במשקל 250 גרם יש נפח דם כולל של 16 מ"ל. עבור דגימת דם אחת על עכבר או חולדה ללא החלפת נוזלים, נפח הדם המרבי שניתן להסיר בבטחה הוא 10% מנפח הדם הכולל, או 7.7-8 מיקרול/גרם. לכן עבור עכבר ממוצע, 10% מנפח הדם שלה הוא 193-200 μl. עבור חולדה ממוצעת של 250 גרם, זה שווה ערך 1.9-2.0 מ"ל. מחקרים הראו כי הסרת יותר מ -15% מנפח הדם יכולה לגרום להלם תת-נפחי. 1,2 עם זאת, עם החלפת נוזלים, עד 15% מכלל נפח הדם - או 12 μl / g-ניתן להסיר. עבור עכבר 25 גרם, זה שווה ערך 300 μl; עבור חולדה 250 גרם, זה שווה ערך 3 מ"ל. להחלפת נוזלים, יש לחמם את הנוזלים ולהעניק אותם באופן תת עורי.

אם יש צורך לקחת דגימות מרובות, נפח הדם נמשך מופחת. נפח הדם המרבי שניתן לצייר בשבוע הוא לא יותר מ 7.5% מכלל נפח הדם, או 6 μl/ g. עבור עכבר 25 גרם, זה שווה ערך 145-150 μl בשבוע. עבור חולדה 250 גרם, זה שווה ערך 1.45-1.50 מ"ל בשבוע. אם דגימה תתרחש כל שבועיים, עד 10% מנפח הדם הכולל (8 מיקרול/גרם) עשוי להימשך. זה שווה ערך 200 μl כל שבועיים עבור עכבר ממוצע, ועד 2.00 מ"ל כל 2 שבועות עבור חולדה 250 גרם. מחקר אחד, שבוצע על חולדות עם משקל ממוצע של 250 גרם, גילה כי כאשר נפחי דם של 15-20% הוסרו, זה לקח יותר מ 29 ימים עבור רמות הדם לנרמל. 1,2 לאיסוף דם חוזר ונשנית, החלפת נוזלים אינה מאפשרת נפח דם גדול יותר או איסוף דם תכוף יותר, שכן הוא מחליף רק נפח. החיה תזדקק לזמן כדי לחדש את מלאי תאי הדם.

השימוש בקלעת הרטרו-מסלולית היה מנהג נפוץ בעבר. עם זאת, חששות רבים לגבי האנושיות של הליך זה התעוררו. במהלך ההליך, תנועה מופרזת של צינור המטוקריט פעם להציב קנתוס המתיווך של העין יכול לגרום נזק לרקמות שמסביב, וכתוצאה מכך נפיחות של העפעפיים ו /או ממברנות הלחמית. הרקמות הנפוחות יכולות לגרום לגלגל העין לבלוט מספיק רחוק, כך שסגירת העפעף תיפגע, מה שעלול לגרום לייבוש ונזק בקרנית. כאב מנפיחות יכול לעורר גירוד והשחתה עצמית שתוצאתה תמריץ את העין. מיקום לא תקין של צינור המטוקריט במהלך דימום רטרו-מסלולי יכול לנתק את עצב הראייה, וכתוצאה מכך עיוורון. אם צינור ההמטוקריט מתקדם בזווית לא נכונה, ניתן לכפות את העין לצאת מהמסלול, מה שמאפשר לעפעפיים ליפול מאחורי גלגל העין. אם זה קורה, קשה מאוד להחליף את העין כראוי לתוך השקע. בעיות אחרות שעלולות להתעורר כוללות שבירה של עצמות המסלול השברירי, חדירה של כדור הארץ וכתוצאה מכך אובדן הומור זגג, או היווצרות של שטף דם מאחורי העין שיכול לגרום לכאב קיצוני עקב הלחץ על העין והמבנים שמסביב. למרות כל החששות הללו, אם טכנאי מיומן מבצע את ההליך והחיה מורדם לחלוטין עם הרדמה כללית, כגון הרדמה משאיפה איזופלורן, דימום רטרו-מסלולי הוכח כשיטה יעילה של איסוף דם במכרסמים.

המבנה האנטומי של אזור המסלול שונה בין העכבר לעכברוש. לעכבר יש את הסינוס הרטרו-מסלולי - אוסף של כלי שיט שיוצרים סינוס באזור המסלול. במסלול של עין החולדה, יש מקלעת של כלי שיט שזורמים מאחורי העין; עם זאת, הם אינם יוצרים סינוס, כמו בעכבר. כתוצאה מכך, קל יותר לבצע הליך זה על עכברים. עבור איסוף דגימה חוזר דרך מקלעת רטרו-מסלולית, מינימום של 10 ימים בין דימומים נדרש כדי לאפשר את הרקמות באזור לרפא. למרות הרדמה כללית מומלץ, ההליך יכול להתבצע בעכברים ללא הרדמה כללית אם הרדמה עיניים אקטואלי, כגון פרופרקאין או טטרקאין, מוחל לפני ההליך. מכיוון שלעכברושים אין את הסינוס הרטרו-מסלולי, ומכיוון שהממברנות שלהם סביב המסלול חזקות בהרבה, חובה להרידים אותן להליך זה.

ניתן להשיג דוגמאות טוריות של אמצעי אחסון קטן באמצעות שיטת קליפ זנב. הקטיעה הראשונית של הזנב חייבת להיות מוגבלת לקצה הזנב, כ 0.5-1.0 מ"מ אורך בעכברים ו 2.0 מ"מ בחולדות. 1 הליך חיתוך הזנב לאיסוף דם מאפשר איסוף סדרתי על ידי שיבוש הגלד או קריש של החתך המקורי בסוף הזנב. בדרך כלל, קטיעה נוספת של קצה הזנב אינה הכרחית. נפחי הדם שנאספו נעים בין 20-100 μL לעכברים ו 75-150 μL עבור חולדות. הסכום שנאסף משתנה בין בעלי חיים ויכול להיות מושפע מגיל, מצב בריאותי ומשקל.

המדגם שנאסף מגזרת זנב יכול להכיל דם עורקי ורידי, יחד עם זיהום מוצר רקמה. איכות המדגם פוחתת אם הזנב הוא ליטף או "חלב" כדי להשיג יותר דם. כדי להגביר את זרימת הדם, הזנב יכול להיות מחומם עם קומפרסים חמים, מנורת חום, או שקוע במים חמים. לחץ צריך להיות מופעל על קצה הזנב עבור hemostasis, ובעלי חיים צריך להיבדק כל 5-10 דקות כדי להבטיח hemostasis הושג. המוסטזיס מתעכב לעתים קרובות עם דגימה חוזרת ונשנית. אבקה סטייפטית עשויה לשמש להמוסטזיס. עבור הקטיעה הראשונית, מומלץ הרדמה (כללית או מקומית). דימום לאחר מכן לא צריך לדרוש הרדמה, במיוחד כמו בעלי החיים להיות רגילים להליך. הרדמה תגרום לירידה בלחץ הדם, מה שהופך את איסוף הדם עם טכניקה זו קשה.

חלופה לגזור זנב היא ניק כלי הזנב. הליך זה מבוצע בקלות הן על עכברים והן על חולדות. עם זאת, כמו עם חיתוך הזנב, הדגימות עשויות להיות מזוהמות עם מוצרי רקמות, במיוחד בעכבר. עבור חולדות, מחט תת עורית מוכנסת לכלי, והדם נאסף ממרכז המחט. מחקר אחד הדגים את השימוש ב חוסם עורקים שהוצב מעל אתר ניקוב המחט כדי לסייע באיסוף דם. 3 מזרק אינו משמש כדי להוציא את הדם מהכלי, שכן הלחץ שנוצר מהמזרק ימוטט את כלי הדם. שיטה זו יכולה לשמש גם לדגימה טורית, כמו קריש ניתן להסיר כדי לגרום לאתר לדמם שוב. כמו עם חיתולים זנב, זה הכרחי כדי להבטיח hemostasis על ידי הפעלת לחץ על האתר ובדיקה מחדש של החיה כל 5-10 דקות.

לעתים קרובות, מחקרים דורשים דגימת דם לא-שורבית וגדולה שנאספה באמצעות דימום תוך-לבבי או קווה הווריד. 4 כמחצית נפח הדם הכולל ניתן לאסוף מעכבר או חולדה על ידי ניקוב לב. זה שווה ערך 40 μl/g או כ 1 מיליליטר עבור עכבר ממוצע 25 גרם. חולדה 250 גרם תיבול כ 10 מ"ל של דם. החיה חייבת להיות מרדים לדם. הרדמה תפופה או CO 2 נרקוסיס יכול לשמש על ידיטכנאי מיומן; ניתן להשתמש גם בהרדמה להזרקה. עם זאת, ייתכן שיש ירידה בלחץ הדם ובמחזור הדם, אשר יכול להפחית את כמות הדם שנאסף.

שיטת הווצק הקאווה caudal דורשת כי החיה להיות מרדים עמוק לחשוף את הכלי בניתוח. CO2 נרקוסיס אינו מספיק, כמו הלב חייב להיות פועם ואת הנשימה החיה במהלך גמילה מהדם. במהלך ההליך, מהיר מדי של נסיגת דם יכול לגרום לכלי לקרוס על שיפוע המזרק, אוסם את הפתח ומניעת איסוף דם. כמו כן, קירות כלי הדם דקים, ולכן יש להימנע מתנועה של היד והמחט כדי למנוע קרע או דליפת דם מאתר הכניסה למחט. כמו המחט אינה עוברת דרך העור, שיטה זו גורמת לאיסוף של מדגם סטרילי. יש להשתמש בשיטות המתת חסד כדי להבטיח שבעל החיים לא יתאושש מהרדמה. שיטה זו מלווה לעתים קרובות זלוף לב או בתחום העורקים.

השיטה תוך-לבבית יכולה להתבצע עם בעל החיים מרוסן באופן ידני ברגע שהוא מרדים (שיטה סגורה), או הלב יכול להיחשף בניתוח לפי הפרוטוקול עבור שיטת איסוף דם veaudal veva (שיטה פתוחה). עבור השיטה הסגורה, ציוני הדרך למיקום מחט הם החריץ שנוצר על ידי כלוב הצלעות בתהליך xiphoid, בצד שמאל של החיה.

Procedure

1. דימום רטרו-מסלולי

  1. ציוד
    1. הכן צנצנת פעמון, או תא אינדוקציה הרדמה, כדי לנהל גז הרדמה כגון איזופלוראן. בעת שימוש בצנצנת פעמון, זה הכרחי כי הרדמה נוזלית לא בא במגע עם החיה, כדי למנוע ספיגה דרך העור. פלטפורמה עם חורים קטנים ניתן להשתמש.
    2. צינורות מיקרוהמטוקריט המכילים 50-75 מיקרוליטרים מועדפים. צינורות עטופים מיילר נוטים פחות לשבור בין האצבעות של המפעיל ויש לשקול כאמצעי בטיחות.
    3. מספר עוביים של מגבת נייר, או חומרי בידוד אחרים, ממוקמים על משטח העבודה כדי לשמור על חום הגוף של החיה במהלך ההליך.
  2. הכנה ומיצוב של החיה
    1. החיה מורדמת עם הרדמה בשאיפה, כגון איזופלוראן, בצנצנת פעמון או תא אינדוקציה הרדמה גז, כדי להשפיע.
    2. ברגע שהחיה היא מרדים לחלוטין, הוא מוסר ומושם recumbency לרוחב.
    3. העין בולטת על ידי הנחת אצבע על החלק העליון של הראש ולאורך קו הלסת, ומשיכת העור אחורה ולמטה.
    4. הימנע מהפעלת לחץ על קנה הנשימה, שכן זה עלול לקרוס או לאטום את דרכי הנשימה הגורמות למוות על ידי חנק.
  3. נסיגת דם
    1. המיקרוהמטוקריט ממוקם בקנותן המהודד של העין ומכוון בזווית של 30-45 מעלות ממישור האף.
    2. יש להפעיל לחץ תוך כדי סיבוב עדין של צינור ההמטוקריט. זה יחתוך את הממברנות הלחמית ויקרע את מקלעת העין.
    3. הדם יזרום לתוך צינור ההמטוקריט על ידי פעולה נימית.
    4. הימנע דוחף כל כך עמוק שאתה מכה את העצם בחלק האחורי של חלל העין.
    5. ברגע שהדם מתחיל לזרום, לשמור על לחץ כדי לשמור על העין בולטת.
    6. כדי לאסוף צינורות מרובים של דם, אין צורך למקם את הצינור הבא לתוך מקלעת העין, כמו הדם ימשיך לזרום וניתן לאסוף כפי שהוא מגיע מן הקנתוס המתיווך.
    7. כדי לעצור את הדימום, לשחרר את העור ולאפשר לעין לחזור למצב נורמלי. להפעיל לחץ על המסלול כדי להבטיח המוסטזיס.

Figure 1
איור 1. נסיגת דם מסלולית רטרו בעכברים.

2. הליכי דימום בזנב: חיתוך זנב וניק זנב

  1. ציוד
    1. להב אזמל סטרילי, רצוי להב מספר 11 או סכין גילוח חד צדדי, משמש כדי להפוך את הקטיעה הראשונית עבור שיטת חיתוך הזנב. מספריים לא צריך לשמש כי החתך שנעשה על ידי מספריים הוא מוחץ, ובכך קידום קרישה והפחתת זרימת הדם. עבור הליך ניק הזנב, מספר 11 או 15 להב אזמל משמש כדי להפוך את החתך.
    2. צינור ריסון המאפשר גישה לזנב העכבר מוכן.
    3. מגבות נייר סופגות או גזה משמשות כמצע לביצוע חיתוך הזנב.
    4. צינורות איסוף או צינורות המטוקריט נדרשים גם כן.
    5. אבקה סטייפטית צריכה להיות זמינה כדי לסייע בהמוסטזיס.
  2. איפוק
    1. החיה ממוקמת לתוך הצינור כך הזנב נגיש. עבור מרסנים מסוג ברום, החיה נמשכת תחילה לתוך הצינור. עבור צינורות אחרים, החיה ממוקמת ראש ראשון.
    2. בעלי חיים מאובטחים לתוך הצינור כך שהם לא יכולים להסתובב או למשוך את הזנב.
    3. עכברים מסוימים יאפשרו חיתוך זנב ואיסוף דם עם ריסון ידני מינימלי אם הם מורשים לתפוס משטח מחוספס.
    4. חולדות מסוימות ידרשו הרדמה שאיפה לשיטה זו של איסוף דם.
  3. נסיגת דם
    1. הזנב מנגב במים חמים כדי להסיר פסולת ולגרום vasodilation קל. אין להשתמש במים חמים.
    2. עבור חיתוך הזנב, הזנב הוא מורחב, ואת קצה הזנב (0.5-1 מ"מ עבור עכברים עד 2 מ"מ עבור חולדות) נחתך עם להב האזמל.
    3. עבור ניק הזנב, הזנב הוא מורחב, וחתך נעשה עם להב האזמל כ 2/3 המרחק מן הישבן, ישירות מעל הווריד זנב לרוחב.
    4. הזנב יכול להיות ליטף מן הישבן לקצה כדי לעודד את זרימת הדם; עם זאת, זה יקטין את איכות המדגם.
    5. הדם נאסף מהקצה או ניק באמצעות צינורות המטוקריט או מותר לטפטף לתוך מקטורון אוסף.

3. איסוף דם לבבי

  1. ציוד
    1. עבור עכבר, מזרק 3 סמ"ק עם מחט 22-25 מד x 1" הוא המועדף. מזרקים קטנים יותר אין את אותו לחץ גב והוא יכול להפוך את גמילה בדם קשה יותר. מחטים קטנות מ 25 מד להגביל את זרימת הדם, המוביל קרישה מוגברת ונזק לתאי הדם. מחטים קצרות מ-1 אינץ' לא יגיעו לרמת הלב כשמתקרבים מהסרעפת.
    2. עבור חולדה, מזרק 10-12 סמ"ק עם מחט 18 מד x 1.5 " הוא המועדף. בהתאם לגודל החולדה, מזרק קטן יותר לא יכול להחזיק את כל נפח הדם כדי לאסוף, ולכן המזרק היה צריך להיות שונה במהלך ההליך. מחטים קטנות מ 20 מד להגביל את זרימת הדם, המוביל קרישה מוגברת. מחטים קצרות מ-1.5 אינץ' עשויות שלא להגיע לרמת הלב כאשר מתקרבים מהסרעפת.
    3. צינור איסוף דם בגודל מספיק משמש להחזיק את הדם שנאסף.
  2. איפוק
    1. איפוק נכון חיוני להצלחת שיטה זו. החיה מוחזקת על ידי הקשקוש עם הגוף תלוי אנכית. חשוב כי הגוף להיות ישר כדי למנוע הסטה של הלב או פיתול של החזה.
    2. עמדה חלופית היא recumbency הגב בעת הצבת המחט בין הצלעות בצד שמאל של החיה. זה שימושי במיוחד עבור חולדות גדולות מאוד או כאשר בעלי חיים מרובים הם להיות דימם.

Figure 2
איור 2. נסיגת דם לב עם עכבר מוחזק אנכית.

  1. נסיגת דם
    1. הגישה מן ההיבט האחורי, ניקוב הסרעפת מושגת בקלות רבה יותר כאשר העכבר או החולדה מוחזקים אנכית על ידי הקשקוש.
      1. המחט מתקדמת בימין ממש משמאל לקסיפיד של החיה.
      2. המחט צריכה להיות מקבילה לעמוד השדרה ומונחת ממש מתחת לצלעות.
      3. הלב ממוקם בערך ברמה של המרפק.
      4. מניחים את המחט, משופעים, לתוך החזה, ולנקב את הלב.
      5. יש למרוח לחץ גב קל עם המזרק. אם המחט בלב, הדם יזרום למזרק.
      6. המתן עד שהדם ימלא את המזרק לפני הוספת לחץ גב נוסף על המזרק.
    2. הגישה לרוחב מצד שמאל של החיה דורשת מיקום החיה בנסיגה הגבית.
      1. נקודת הכניסה נמדדת כנגד נקודת המרפק על דופן החזה. הלב ממוקם בערך ברמה של המרפק.
      2. המחט מוכנסת בניצב למישור השולחן בנקודה באמצע הדרך על דופן החזה כפי שנמדדה באופן דורסוונטרי.
      3. מניחים את המחט, משופעים, לתוך החזה, ולנקב את הלב.
      4. יש למרוח לחץ גב קל עם המזרק. אם המחט בלב, הדם יזרום למזרק.
      5. המתן עד שהדם ימלא את המזרק לפני הוספת לחץ גב נוסף על המזרק.

Figure 3
איור 3. נסיגת דם לבבית עם עכבר בתנוחת נסיגה הגבית.

  1. טיפים טכניים
    1. הלב הנורמלי ממוקם עם פסגת הצבעה שמאלה. במקרים נדירים, הלב עשוי להיות הפוך, וכתוצאה מכך קושי לנקב את הלב.
    2. לחץ גב מוגזם על המזרק עלול למוטט את הלב, לחנוק את משופע המחט ולעצור את זרימת הדם למזרק.
    3. הפעלת לחץ גב ושחרורו שוב ושוב יפעיל קרישה במזרק.
    4. החלה עדינה של לחץ על הכבד יכולה לכפות נפח דם נוסף לתוך מערכת הדם, מה שהופך אותו זמין לגמילה.

4. נסיגת דם הוועד האחורית

  1. ציוד
    1. מזרק שחפים עם מחט 25-29 מד משמש לאיסוף דם בעכבר. עבור חולדות, מזרק 10-12 סמ"ק עם מחט 22-25 מד x 1" נדרש.
    2. פלטפורמה כירורגית, מגש ניתוח או משטח אחר לאבטחת החיה נדרשים, יחד עם קשרים, סרט הדבקה או סיכות כדי להדביק את הגפיים בעמדה.
    3. הרדמה להזרקה או הרדמה שאיפה יש צורך. אם משתמשים בהרדמה בשאיפה, רצוי שההרדמה תימסר באמצעות מאדה מדויק עם חרוט אף. אורך ההליך הוא כזה ששימוש בתא אינדוקציה ללא אספקת גז הרדמה נוספת לא יספק מספיק זמן כדי להשלים את נסיגת הדם לפני החיה מתעוררת לחיים.
    4. מספריים איריס עבור העכבר, או מספריים חדים קהים חדר עבור החולדה, נדרשים, יחד עם מלקחיים אגודל אטראומטיים קטנים, וספוג גזה 2 "x 2".
  2. איפוק
    1. כאשר החיה היא מרדים לחלוטין, כפי שנקבע על ידי צביטת הבוהן או צביטת זנב, החיה ממוקמת recumbency הגב.
    2. הגפיים מאובטחות לרציף עם סרט או סיכות. הגפיים צריכות להיות מורחבות הרחק מהגוף.
  3. גמילה
    1. העור מורם וחתך רוחבי קטן נעשה דרך העור ממש מעל האגן אצל הנקבות, או ממש מעל ההקדמה אצל הזכרים.
    2. נקודת המספריים ממוקמת לתוך החתך, וחתך בקו האמצע נעשה דרך העור מהאגן / prepuce אל xiphoid.
    3. העור משתקף לרוחב לכל צד. ניתוח קהה עשוי להיות נחוץ כדי לשחרר אותו מהשריר הבסיסי.
    4. השריר מורם, וחתך רוחבי קטן נעשה דרך השריר ממש מעל העור לחתוך.
    5. הנקודה של המספריים ממוקמת לתוך הבטן ו חנק קו האמצע נעשה דרך השריר כדי xiphoid. הקפד לכוון את נקודת המספריים כלפי מעלה כדי להימנע מחיתוך איברים כלשהם.
    6. חותכים לרוחב לאורך עקומת הצלעות בכל צד. לנקוט זהירות נוספת לא לנקב את הכבד.
    7. הזיזו בעדינות את המעיים לשמאל החיה כדי לחשוף את הוועד הנבי האחורי.
    8. מניחים כרית גזה על הכבד, ומניחים את האינדקס והאצבע האמצעית על הכבד.
    9. עם היד השנייה, להכניס את המחט, משופע כלפי מעלה, לתוך הווריד קאווה באמצע הדרך בין הצומת של כלי הכליה ואת bifurcation הכסל.
    10. לאט למשוך את הדם תוך הפעלת לחץ על הכבד.

Figure 4
איור 4. נסיגת דם מוועד הוועד האחורי.

איסוף דם הוא דרישה נפוצה למספר מחקרים הכוללים עכברים וחולדות. הבחירה בשיטה לגמילה מדם בבעלי חיים אלה תלויה בגורמים רבים כמו, נפח הדם הדרוש, תדירות הדגימה, מצב הבריאות של החיה שיש לדמם, ורמת המיומנות של הטכנאי.

כאן, נסקור שיקולים אלה ויתאר את הליכי איסוף הדם כולל דימום עיניים רטרו-מסלולי, חתכי זנב וחתכים, כמו גם איסוף דם תוך-לבבי. לשיטות אחרות, עיין בסרטון השני בסדרה זו.

לפני שהתעמק בפרוטוקולי נסיגת הדם, בואו נסקור תחילה כמה שיקולים כלליים כולל סוג המדגם, בחירת המחט ונפח הדם המרבי שניתן לאסוף. לפני איסוף דם מעכבר או מעכברוש, יש לקבוע את סוג דגימת הדם הנדרשת. הליכים ניסיוניים עשויים לדרוש דם שלם, פלזמה או נסיוב.

אם איסוף דם שלם, נוגד קרישה יש להוסיף לדגימה כדי למנוע קרישה. נוגדי קרישה נפוצים כוללים הפרין, נתרן סיטראט, חומצה אתילנדיאמין טטראצטט, מקוצר כמו EDTA. נוגדי קרישה ניתן לטעון ישירות לתוך המזרק כדי לצפות את המשטחים. זה מאפשר מגע של נוגד קרישה ישירות כמו הדם נמשך סיוע במניעת קרישה. בגלל קרישי דם מכרסמים במהירות, זה חיוני כי היחס הנכון של נוגד קרישה לדם לשמש. איסוף פלזמה דורש צנטריפוגה כל הדם עם נוגד קרישה. לאחר הסיבוב, הנוזל השקוף מעל WBC ושכבת טסיות הדם הוא פלזמה. הוא מכיל פיברינוגן וגורמי קרישה אחרים. מצד שני, סרום נאסף מדגימת דם שלמה ללא נוגדי קרישה. ומכיוון המדגם יש קרישה, הסרום, שהוא השחקן העליון, אינו מכיל פיברינוגן או גורמי קרישה אחרים.

בחירת המחט מבוססת על גודל החיה והאתר של venipuncture. באופן כללי, מחטי שעמום גדולות לגרום פחות נזק לתאי הדם ולאפשר איסוף דם מהיר יותר; אבל נוטים יותר לגרום נזק לכלי שיט. יש לקחת בחשבון גם את אורך המחט. אם מחט ארוכה מדי, זה יכול להיות מביך לשימוש, או דם יכול להתחיל להישרש בעוד עדיין בתוך המחט. אפשרויות הגודל נעות בין 18 ל-29 מד ואורך של 0.5 עד 1.5 אינץ'. גודל המחט המתאים לכל שיטה יידונו בסעיף הנהלים.

לבסוף, בגלל הגודל הקטן של מכרסמים, יש כמות מקסימלית של דם שניתן לאסוף מתוך לקיפת דם אחת, אשר לא יגרום נזק חמור לאורגניזם. גמילה מדם יכולה להיות ללא או עם החלפת נוזלים - בדרך כלל נעשה באמצעות 0.9% מלוחים פיזיולוגיים. הגבול העליון בכל אירוע מפורט בפרוטוקול הטקסט שלהלן. יתר על כן, כמה ניסויים דורשים איסוף מדגם מרובה ובמקרים כאלה יחד עם בעלי חיים חלופיים נוזל יצטרך זמן בין לחדש את תאי הדם גם כן. שוב, יש סכום מרבי שניתן לאסוף במהלך איסוף סדרתי, והגבלות העליונים מפורטים בפרוטוקול שלהלן.

לאחר סקירת כמה שיקולים כלליים, בואו נקפוץ לטכניקות נסיגת הדם הספציפיות, החל מדימום רטרו-מסלולי - טכניקה המשמשת מדענים לאיסוף כרכים קטנים מהכלים הסמוכים לעין. שים לב שהמבנה האנטומי של אזור המסלול שונה בין העכבר לעכברוש. לחולדות יש מקלעת של כלי שיט הזורמים מאחורי העין, ואילו לעכבר יש אוסף של כלי שיט היוצרים סינוס מסלולי רטרו, מה שמקל על ביצוע הליך זה בעכברים.

התחל על ידי תפיסת צינור לאיסוף דם. צינורות המטוקריט מיקרו המחזיקים 50-75 מיקרוליטרים מועדפים. הנח מספר מגבות נייר או חומרים מבודדים אחרים על משטח העבודה. זאת כדי לשמור על חום הגוף של החיה במהלך ההליך. עכשיו מרדים את החיה באמצעות הרדמה שאיפה כגון איזופלוראן. לאחר שהחיה היא מרדים לחלוטין, להסיר אותו מהתא ולהניח אותו על צדו כי הוא במצב recumbency לרוחב. לאחר מכן, מניחים אצבע על החלק העליון של הראש ולאורך קו הלסת ומושכים את העור אחורה ולמטה כדי לגרום לבלט עיניים. הימנע הפעלת לחץ על קנה הנשימה כמו זה עלול לגרום למוות על ידי חנק. לאחר מכן, מניחים את צינור המיקרו-המטוקריט בקנותוס המהודד של העין וכיוונו אותו בזווית של 30 עד 45 מעלות ממישור האף. יש להפעיל לחץ תוך כדי סיבוב עדין של הצינור. זה יהיה לחתוך דרך ממברנות הלחמית ולקרוע את מקלעת העין או סינוס. הדם יזרום לתוך צינור ההמטוקריט על ידי פעולה נימית. הימנע דוחף את הצינור כל כך עמוק שאתה מכה את העצם בחלק האחורי של חלל העין. ברגע שהדם מתחיל לזרום, לשמור על לחץ כדי לשמור על העין בולטת. כדי לעצור את הדימום, לשחרר את העור ולאפשר לעין לחזור למצב נורמלי. להפעיל לחץ כדי לקדם את ההמוסטזיס. לאיסוף דוגמאות חוזר, אפשר מינימום של 10 ימים בין הדימומים. זה מספק רקמות קצת זמן לרפא.

למרות דימום רטרו-מסלולי הוא הליך נפוץ, ישנם חששות רבים על האנושיות שלה. אלה כוללים נפיחות עקב תנועה מוגזמת של צינור המטוקריט. זה בתורו יכול לגרום בליטה גלגל העין לעכב את סגירת העפעף וכתוצאה מכך ייבוש הקרנית, נזק, וכאב, אשר יכול לעורר גירוד והשחתה עצמית. מיקום לא תקין של צינור המטוקריט יכול לנתק את עצב הראייה וכתוצאה מכך עיוורון. סיבוך אפשרי נוסף הוא שניתן לכפות על העין לצאת מהמסלול, מה שמאפשר לעפעפיים ליפול מאחורי גלגל העין. יתר על כן, בעיות יכולות לנבוע מהשבירה של עצמות המסלול השבריריות, חדירה של כדור העין וכתוצאה מכך אובדן הומור הזגג, או היווצרות של שטף דם מאחורי העין שיכול לגרום לכאב קיצוני. למרות כל החששות הללו, אם טכנאי מיומן מבצע את ההליך והחיה הוא מרדים לחלוטין, דימום רטרו-מסלולי הוא שיטה יעילה של איסוף דם מכרסמים.

עכשיו בואו נסקור את השיקולים וההליכים לדימום בזנב, המאפשר איסוף של דגימות סדרתיות של כרכים קטנים. הציוד הדרוש להליך זה כולל אזמל סטרילי מספר 11. מספריים לא צריך לשמש כי החתך שנעשה על ידי מספריים הוא מוחץ, אשר יכול לקדם קרישה ולהפחית את זרימת הדם. מכשירים אחרים הם צינור ריסון המאפשר גישה לזנב החיה; מגבות נייר סופגות; צינורות איסוף או המטוקריט ואבקה סטייפטית - כדי לסייע בהמוסטזיס.

תתחיל על ידי אבטחת החיה לתוך צינור האיפוק. לאחר מכן, לנגב את הזנב עם מים חמים כדי להסיר פסולת ולגרום vasodilation קל. אין להשתמש במים חמים. להאריך את הזנב ועם להב האזמל לחתוך את קצה הזנב כדי לאסוף את הדם באמצעות hematocrit או צינורות איסוף. הזנב יכול להיות ליטף או "חלב" מן הישבן לקצה כדי לעודד את זרימת הדם. זה, עם זאת, להקטין את איכות המדגם.

כדי לעצור את הדימום, להפעיל לחץ על קצה הזנב עם כרית גזה. האבקה הסטייליסטית עשויה לשמש להשגת hemostasis. בדוק את בעלי החיים כל 5 עד 10 דקות כדי להבטיח המוסטזיס הושג, אשר עשוי להתעכב לאחר דגימה חוזרת ונשנית. המדגם שנאסף מגזרת זנב יכול להכיל דם עורקי ורידי, יחד עם זיהום מוצר רקמה. עם זאת, הליך זה לאיסוף דם מאפשר אוספים סדרתיים על ידי שיבוש הגלד או קריש של החתך המקורי בסוף הזנב.

שיטה חלופית לאיסוף דם לגזור זנב היא ניק כלי הזנב, שהוא יחסית פחות פולשני. בשביל זה, באמצעות אותו להב אזמל, לעשות חתך קטן ישירות מעל וריד הזנב לרוחב, כשני שליש המרחק מן הישבן. כמו עם חיתוקי זנב, ניתן לאסוף דם בצינורות איסוף או המטוקריט. וזה הכרחי כדי להבטיח hemostasis על ידי הפעלת לחץ על האתר ובדיקה מחדש של החיה כל 5-10 דקות. עם זאת, כמו עם חיתוך הזנב, הדגימות עשויות להיות מזוהמות עם מוצרי רקמות.

לעתים קרובות מחקרים הדורשים דגימת דם גדולה שאינה הישרדות, אשר מושגת באמצעות דימום באמצעות דימום תוך-לבבי או הווריד caudal cava.

עבור שיטת פנים-לב בעכברים, אתה צריך מזרק 3 סמ"ק עם מחט 22-25 מד 1 אינץ '. ולעכברושים, מזרק 10-12 סמ"ק עם מחט 18 מד 1.5 אינץ 'עדיף. עיין בפרוטוקול שלהלן כדי להבין מדוע צרכים ומזרקים אלה הם אידיאליים.

התחל על ידי המתת חסד החיה באמצעות פחמן דו חמצני. לאחר המתת חסד, להחזיק את המכרסם על ידי הקשקוש עם הגוף תלוי אנכית. רסן זה הוא קריטי כמו הגוף צריך להיות ישר כדי למנוע הסטה של הלב או פיתול של החזה. שים לב כי הלב ממוקם בערך ברמה של המרפק. הצד הכניסה הוא חריץ רק משמאל xiphoid, במקביל לעמוד השדרה ומתחת לצלעות.

הכנס את המחט, משופע, לתוך החזה ולנקב את הלב. החל לחץ גב קל עם המזרק. אם המחט בלב, הדם יזרום למזרק. המתן עד שהדם ימלא את החבית לפני הוספת לחץ גב נוסף. כמחצית מנפח הדם הכולל ניתן לאסוף מעכבר או חולדה על ידי ניקוב לב. זה שווה ערך לכ 1 מ"ל של דם מעכבר ממוצע וכ 10 מ"ל של דם מעכברוש ממוצע

עמדה חלופית היא חזרה הגב בעת שימוש בגישה לרוחב. במקרה זה, מניחים את המחט בין הצלעות בצד שמאל של החיה. נקודת הכניסה נמדדת כנגד נקודת המרפק על דופן החזה. הכנס את המחט, משופע למעלה, מאונך למישור השולחן בנקודה באמצע הדרך על קיר החזה. יש למרוח לחץ גב קל עם המזרק. אם המחט היא בלב דם יזרום לתוך המזרק. שוב, המתן עד שהדם ימלא את החבית לפני הוספת לחץ גב נוסף. שים לב כי בכל עמדה, לחץ גב מוגזם עלול למוטט את הלב אוטם את משופע המחט ולעצור את זרימת הדם לתוך המזרק.

שיטה נוספת לאיסוף דם לב היא באמצעות הוועד הקאודל קאווה. הציוד הדרוש להליך זה הם מזרק מתאים עם מחט בגודל הנכון מחובר; מספריים לפתיחת חלל הבטן, מלקחיים אגודל אטראומטיים קטנים וספוג גזה. טכניקה זו דורשת כי החיה להיות מורדם עמוק ומתוחזק תחת הרדמה לאורך כל ההליך. CO2 נרקוסיס אינו אופציה, כמו הלב החייתי חייב להיות פועם עבור הליך זה. מניחים את החיה בתנוחת נסיגה הגב, ומאבטחים את הגפיים לרציף. הגפיים צריכות להיות מורחבות הרחק מהגוף.

עכשיו להרים את העור עם מלקחיים ולהשתמש במספריים כדי להפוך חתך רוחבי קטן דרך העור ממש מעל האגן אצל נקבות או prepuce אצל גברים. לאחר מכן, מניחים את נקודת המספריים לתוך החתך ולעשות חתך קו האמצע דרך העור מהאגן או prepuce אל xiphoid. עם העור משתקף לרוחב, להרים את השריר ולעשות חתך רוחבי קטן דרך השריר, ממש מעל העור לחתוך.

מניחים את נקודת המספריים לתוך הבטן ולעשות חנק קו האמצע דרך השריר כדי xiphoid. הקפד זווית נקודת המספריים כלפי מעלה כדי למנוע חיתוך כל איברים. חותכים לרוחב לאורך עקומת הצלעות בכל צד. היזהר לא לנקב את הכבד. הזיזו בעדינות את המעיים לשמאל החיה כדי לחשוף את הוועד הנבי האחורי. מניחים כרית גזה על הכבד ומניחים עליו את האינדקס והאצבעות האמצעיות. עם היד השנייה שלך, להכניס את המחט, משופע לתוך הווריד קאווה, באמצע הדרך בין הצומת של כלי הכליה וביפור הכסל. לאט למשוך את הדם תוך הפעלת לחץ על הכבד.

הימנע מתנועת יד, שכן זה עלול לגרום לקרע בכלי הדם. כמו כן, נסיגת דם מהירה מדי עלולה לגרום לכלי להתמוטט על שיפוע החוסם את הפתח ומונע איסוף דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לאסוף מדגם סטרילי כי המחט אינה עוברת דרך העור.

לבסוף, בואו נסתכל על כמה יישומים של טכניקות גמילה דם אלה. אימונו-אונקולוגיה היא תחום מתפתח, וחוקרים בתחום זה מבצעים לעתים קרובות איסוף דם כדי לחקור את תאי החיסון בשלבים שונים של התפתחות הסרטן. לדוגמה, כאן החוקרים אספו דם לב מעכברים נושאי סרטן כדי לבודד ולכומת נויטרופילים בעשרה, עשרים ושלושים יום לאחר חריטת הגידול.

מצד שני, הרכב הדם נחקר לעתים קרובות גם על ידי פיזיולוגים. כמו במחקר זה, החוקרים התעניינו בהערכת תפקוד הכליות בבעלי חיים סוכרתיים. כדי לעשות זאת, מדענים אלה הזריקו לראשונה צבע למודל של בעלי חיים מסוכרת. לאחר מכן, הם השתמשו בשיטת חיתוך הזנב כדי לאסוף דם במספר נקודות זמן כדי להעריך את ריכוז הצבע בדם, אשר שימש בסופו של דבר לחישוב שיעור סינון גלומרולרי שהדגיש את ההבדל בתפקוד הכליות לאחר אינדוקציה סוכרת.

לבסוף, חוקרי תאי גזע משתמשים בדגימות דם כדי להעריך את הצלחת שילובם של תאים תורמים במערכת של הנמען. כאן, החוקרים השתילו לראשונה תאי מח עצם מעכבר זכר לסוג פראי וחיה נשית מהונדסת גנטית באמצעות הזרקת וריד הזנב. לאחר מכן, הם אספו דם מהסינוס מסלולי רטרו של עכבר הנמען כדי לחקור את ה- DNA הגנומי של תאי הדם באמצעות תגובת שרשרת פולימראז. זה סיפק את אחוז חריטת התאים התורמים בשני סוגי בעלי החיים.

הרגע צפית בפרק הראשון של ג'וב על טכניקות גמילה מדם. אנא עיין בסרטון הבא בסדרה כדי לסקור כיצד לבצע טכניקות נפוצות אחרות של איסוף דם בחיות מעבדה. כמו תמיד, תודה שצפית!

Applications and Summary

איסוף דם לעכברים וחולדות יכול להתבצע במגוון טכניקות. למרות שגורמים רבים, כגון גודל המדגם, תדירות הדגימה, ואת הגודל והגיל של החיה להשפיע על זה, המרכיב החיוני ביותר הוא רמת המיומנות של הטכנאי ביצוע אוסף המדגם. עבור השיטות המתוארות כאן, השימוש הנכון בהרדמה הוא חיוני גם עבור דגימות איכות ורווחתם של בעלי החיים.

References

  1. Guidelines for the survival bleeding of mice and rats. 2010.
  2. Diehl, K.H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.M., and van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practical guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21. 15-23.
  3. Omaye, S.T., Skala, J.H., Gretz, M.D., Schaus, E.E., and Wade, C.E. 1987. Simple method for bleeding the unanaesthetized rat by tail venipuncture. Laboratory Animals. 21. 261-264.
  4. Adeghe, A.J-H. and Cohen, J. 1986. A better method for terminal bleeding of mice. Laboratory Animals. 20. 70-72.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter