Overview
Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia
La cromatografia a scambio ionico è un tipo di cromatografia che separa gli analiti in base alla carica. Viene utilizzata una colonna che viene riempita con una fase stazionaria carica su un supporto solido, chiamata resina a scambio ionico. La cromatografia a forte scambio cationico separa preferenzialmente i cationi utilizzando una resina caricata negativamente, mentre la cromatografia a scambio anionico forte seleziona preferenzialmente gli anioni utilizzando una resina caricata positivamente. Questo tipo di cromatografia è popolare per la preparazione del campione, ad esempio nella pulizia di proteine o campioni di acido nucleico.
La cromatografia a scambio ionico è un processo in due fasi. Nel primo passaggio, l'esempio viene caricato nella colonna in un buffer di caricamento. Il legame del campione caricato alla resina della colonna si basa sulle interazioni ioniche della resina per attirare il campione della carica opposta. Pertanto, i campioni carichi di polarità opposta alla resina sono fortemente legati. Altre molecole che non sono cariche o sono di carica opposta non sono legate e vengono lavate attraverso la colonna. Il secondo passo è quello di eluire l'analita che è legato alla resina. Questo si ottiene con un gradiente salino, in cui la quantità di sale nel buffer viene lentamente aumentata. Le frazioni vengono raccolte alla fine della colonna quando si verifica l'eluizione e il campione purificato di interesse può essere recuperato in una di queste frazioni. Un'altra tecnica, come la spettroscopia, potrebbe essere necessaria per identificare quale frazione contiene il campione. La cromatografia a scambio ionico è particolarmente utile negli studi sulle proteine, per isolare proteine di interesse che hanno una carica o una dimensione specifica, in quanto le dimensioni possono determinare il numero di interazioni con la resina.
La cromatografia a scambio ionico è una tecnica di separazione più generale rispetto alla cromatografia di affinità, che viene spesso utilizzata anche nella preparazione di campioni proteici, in cui un anticorpo è attaccato a una colonna per legare un analita specifico. Per ogni analita deve essere acquistata una nuova colonna di affinità, mentre lo stesso tipo di colonna a scambio ionico, spesso con condizioni di eluizione diverse, può essere utilizzato per ripulire molte proteine della stessa carica. La cromatografia a scambio ionico può anche essere utilizzata in combinazione con altri tipi di cromatografia che si separano in base ad altre proprietà. Ad esempio, la cromatografia ad esclusione dimensionale si separa in base alle dimensioni e potrebbe essere utilizzata prima della cromatografia a scambio ionico per scegliere composti di una determinata dimensione.
Principles
La cromatografia a scambio ionico è governata dai principi delle interazioni chimiche ioniche che portano all'adsorbimento reversibile dell'analita sulla fase stazionaria. La forza del legame tra il campione e il supporto solido è governata dal numero e dai tipi di gruppi funzionali sul campione e sulla resina. Il tampone di carico ha generalmente una bassa conduttività al fine di promuovere le interazioni tra il campione e la resina. Le resine a scambio cationico forte presentano tipicamente gruppi funzionali di acido solfonico mentre le resine a scambio cationico debole hanno acidi carbossilici. Le forti resine a scambio anionico contengono ammine quaternarie mentre le resine a scambio anionico deboli presentano ammine secondarie o terziarie. I termini forte e debole si riferiscono alle proprietà acido/base del materiale della colonna e non a quanto bene lega un analita. Le resine deboli vengono caricate su un intervallo di pH più piccolo rispetto alle resine forti, ma legano comunque gli analeti in modo molto efficace e potrebbero essere una buona scelta se vengono caricate nell'intervallo di pH necessario. Prima dell'uso, le colonne a scambio ionico vengono bilanciate a un pH utilizzando un tampone di equilibrio.
Per eluire il campione di interesse, viene utilizzato un gradiente salino. I campioni che sono meno strettamente legati alla resina eluiranno per primi, poiché il sale disturberà più facilmente il loro legame ionico alla colonna. I campioni che sono più strettamente legati si eluiranno in seguito, quando vengono utilizzate quantità più elevate di sale. Tipicamente, viene utilizzato un gradiente lineare di sale, in cui la concentrazione di sale aumenta nel tempo in modo lineare. Tuttavia, i gradienti di passo possono essere utilizzati anche dove la concentrazione di sale viene intensificata nel tempo.
Una considerazione importante per gli esperimenti a scambio ionico è il pH dei tamponi. Il pH deve essere mantenuto in modo che l'analita di interesse sia caricato e si leghi alla resina. Per le proteine, la carica si basa sul punto isoelettrico della proteina, dove la proteina è caricata in modo neutro e misurata come pI. Il pH rispetto alla proteina pI fornisce informazioni sulla carica proteica prevista. Nella cromatografia a scambio cationico, l'innalzamento del pH farà sì che l'analita sia meno carico positivamente e meno probabilità di interagire con la resina caricata negativamente. Allo stesso modo, nella cromatografia a scambio anionico, l'abbassamento del pH farà sì che l'analita sia meno caricato negativamente e meno probabilità di interagire con la resina caricata positivamente. Pertanto, le regolazioni del pH possono essere utilizzate anche per eluire selettivamente gli analiti dalla colonna. L'uso di regolazioni del pH al posto dei sali potrebbe essere vantaggioso per separare due diversi tipi di proteine con diversi valori di pI.
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Procedure
1. Preparazione del campione e della colonna
- In questa dimostrazione, una miscela di 2 proteine sarà separata su una colonna a scambio cationico: emoglobina e citocromo C. Aggiungere 0,2 mL di tampone di equilibrio (pH 8,1) al campione proteico e vortice per mescolare accuratamente. Centrifugare per 2 minuti per rimuovere qualsiasi schiuma.
- Posizionare la colonna di scambio cationico in una provetta per 5 minuti per consentire alla resina di depositarsi. Bloccare la provetta con la colonna su un supporto ad anello per assicurarsi che sia in posizione verticale.
- Aprire il cappuccio superiore della colonna e quindi il cappuccio inferiore. Lasciare che il tampone nella colonna goccioli sotto gravità nella provetta.
- Lavare la colonna due volte con un volume di colonna (in questo caso il volume della colonna è di 0,3 ml) di tampone di equilibrio. Lasciare che il primo volume di colonna (0,3 mL) del tampone di equilibratura goccioli nel flaconcino di scarico prima di aggiungere il secondo volume di colonna. Questo passaggio consente alla colonna di equilibrarsi con il buffer di bilanciamento. Aggiungere lentamente il tampone di equilibrio in questo passaggio per non disturbare la resina.
2. Esecuzione di un campione proteico attraverso una colonna a scambio cationico
- Inserire la colonna in un tubo centrifugo da 2 ml con l'etichetta "Unbound 1". Caricare con attenzione 0,1 ml del campione proteico sulla parte superiore della colonna.
- Una volta che il campione è stato caricato sulla parte superiore della colonna, lavarlo con 0,3 ml di tampone di equilibrio aggiungendo il tampone nella parte superiore della colonna e lasciandolo gocciolare fino in fondo. Ripetere questo passaggio 4 volte (per un totale di 5 lavaggi) e raccogliere ogni lavaggio in un tubo centrifugo separato da 2 ml. Etichettare i tubi come "Unbound 1-5".
- Per gli ultimi 2 lavaggi, centrifugare per 10 s a 1.000 x g per assicurarsi che tutte le specie non legate si staccano dalla colonna. Qualsiasi campione che si lega alla colonna non deve essere in questi lavaggi, ma il campione che non si lega si laverà senza essere trattenuto. La centrifugazione fornisce più forza per lavare i materiali non legati dalla colonna.
- Inserire la colonna in un nuovo tubo di raccolta centrifuga da 2 ml etichettato "Bound 1". Mettere 0,3 mL di tampone di eluizione (sale alto, pH 5,5) sulla parte superiore della colonna. Centrifugare l'eluente risultante per 10 s a 1.000 x g.
- Ripetere la fase di eluizione altre 2 volte posizionando la colonna in un nuovo tubo della centrifuga, aggiungendo 0,3 ml e centrifugando per 10 s. Etichetta questi "Bound 2 e 3".
- Registrare eventuali cambiamenti di colore o osservazioni sulle frazioni. L'emoglobina è una proteina colorata che sembra bruno-rossastra mentre il citocromo C è di colore rossastro.
3. Risultati: Scambio cationico di emoglobina e citocromo C
- Il citocromo C ha un pI di 10,5 e l'emoglobina un pI di 6,8. Pertanto, quando viene utilizzato un tampone di equilibrio pH 8,1, l'emoglobina non si lega alla colonna perché è caricata negativamente. Il citocromo C è caricato positivamente a questo pH e si lega alla colonna perché il pH < pI.
- L'emoglobina è osservata nelle frazioni non legate perché non è legata alla colonna.
- Il citocromo C è osservato in frazioni legate, perché era legato alla colonna di scambio cationico.
Figura 1. Immagine della frazione non legata (emoglobina) e della frazione legata (citocromo C).
La cromatografia a scambio ionico è ampiamente utilizzata nella separazione e nell'isolamento di composti carichi, in particolare biomolecole di grandi dimensioni.
Questo tipo di cromatografia liquida utilizza una colonna di perle in fase stazionaria imballate, chiamate resina. La tecnica separa gli analeti in base alla loro affinità con la resina carica.
Esistono due tipi principali di questa tecnica. Nella cromatografia a scambio cationico, la resina caricata negativamente viene utilizzata per legare analiti caricati positivamente. Allo stesso modo, nello scambio anionario, gli anati caricati negativamente si legano alla resina caricata positivamente. I composti non legati vengono lavati attraverso la colonna e l'analita può quindi essere raccolto in un contenitore separato.
Questo video introdurrà le basi della cromatografia a scambio ionico e dimostrerà la tecnica separando una miscela proteica in laboratorio.
La fase stazionaria è un componente chiave per una separazione di successo. Le resine a forte scambio cationico presentano tipicamente forti gruppi funzionali acidi, come l'acido solfonico. Le resine a scambio cationico debole presentano gruppi deboli, come gli acidi carbossilici.
Allo stesso modo, le resine a scambio anionica forte utilizzano basi forti, come le ammine quaternarie, mentre le resine a scambio anionale debole utilizzano ammine secondarie o terziarie. La selezione della resina dipenderà dalle proprietà della miscela campione e dall'analita di interesse.
I tamponi utilizzati, collettivamente chiamati fase mobile, sono anche importanti per la separazione, in particolare in termini di pH. Per le proteine, il pH viene selezionato in base al suo punto isoelettrico, o pI. A un pH uguale al pI della proteina, la proteina è neutra. Sopra il pI, avrà una carica negativa netta, mentre al di sotto del pI, avrà una carica positiva netta. Il pH tampone deve essere selezionato in modo che la proteina sia correttamente caricata e in grado di legarsi alla fase stazionaria.
La cromatografia a scambio ionico è generalmente un processo in quattro fasi. In primo luogo, una colonna imballata contenente resina a scambio anionico o cationico viene bilanciata utilizzando il tampone. Per le colonne a scambio anionico, ciò comporta la protonazione della resina, assicurando che sia caricata positivamente.
Successivamente, l'esempio viene caricato nella colonna. Il tampone deve avere una bassa conduttività, poiché le specie cariche possono competere con il campione per le interazioni con la resina. Composti di carica opposta si legano alla resina. Le molecole che non sono cariche, o portano la stessa carica, rimangono non legate.
Nel terzo passaggio, la colonna viene lavata con buffer aggiuntivo per rimuovere i componenti non associati dalla colonna, lasciando indietro il limite.
Infine, il quarto passo è l'eluizione dell'analita legato. Ciò si ottiene utilizzando un gradiente salino, in cui la concentrazione di sale viene gradualmente aumentata, o utilizzando un tampone di eluizione salina elevato.
Le molecole che sono debolmente legate saranno prima eluite, poiché il sale basso disturberà più facilmente il loro legame ionico con la resina. I composti che sono più fortemente legati eluiranno con concentrazioni di sale più elevate.
Ora che le basi della cromatografia a scambio ionico sono state delineate, diamo un'occhiata al suo uso nella separazione di due proteine.
In primo luogo, per preparare la miscela proteica per la separazione, aggiungere 0,2 ml di tampone legante e vortice per mescolare accuratamente. Quindi, centrifugare la miscela per rimuovere qualsiasi schiuma. Per preparare la colonna a scambio cationico, bloccarla verticalmente su un supporto ad anello e lasciare che la resina si depositi.
Aprire il cappuccio superiore della colonna e quindi il cappuccio inferiore. Lasciare che il tampone goccioli sotto gravità in un tubo sottostante.
Per preparare la colonna, equilibrarla caricando un volume di colonna di buffer, in questo caso 0,3 ml. Lasciare gocciolare il tampone dalla colonna in un flaconcino di scarico. Dopo l'uscita di un volume di colonne di buffer, ripetere il passaggio di bilanciamento.
Per eseguire l'esperimento, posizionare un tubo centrifugo da 2 ml etichettato "Unbound 1" sotto la colonna. Caricare con attenzione 0,1 ml del campione proteico sulla parte superiore della colonna.
Una volta caricato il campione, lavare con un volume di colonna di buffer e lasciarlo scorrere fino in fondo. Ripetere per un totale di 5 lavaggi. Raccogliere ogni lavaggio nel proprio tubo, etichettato da "Unbound 1" a "5". Per gli ultimi 2 lavaggi, centrifugare la colonna per 10 s per assicurarsi che tutte le specie non legate lavino via la colonna. Inserire la colonna in un nuovo tubo di raccolta centrifuga da 2 ml ed etichettarla "Bound 1". Caricare 1 volume di colonna del buffer di eluizione nella parte superiore della colonna. Centrifuga per 10 s a 1.000 x g.
Ripetere il passaggio di eluizione altre 2 volte per garantire la raccolta dell'analita legato. Etichettare i tubi "Bound 2" e "3". Registrare eventuali cambiamenti di colore o osservazioni sulle frazioni.
In questo esempio, l'emoglobina e il citocromo C sono stati separati. L'emoglobina ha un pI di 6,8, mentre il citocromo C ha un pI di 10,5. Nel tampone pH 8.1, l'emoglobina è caricata negativamente e non si lega alla colonna. Al contrario, il citocromo C è caricato positivamente a pH 8,1 e si lega alla colonna.
L'emoglobina, una proteina di colore brunastro, è stata trovata nelle frazioni non legate, mentre il citocromo C, una proteina di colore rossastro, è stato osservato nella frazione legata.
Esistono molte forme di cromatografia liquida, ognuna con diverse capacità di separare i componenti di una miscela.
In questo esempio, la cromatografia su colonna è stata utilizzata per separare una miscela di DNA a singolo e doppio filamento. L'idrossiapatite, o HA, è una forma cristallina di fosfato di calcio comunemente usato come fase stazionaria a causa dei suoi ioni calcio caricati positivamente. In questo caso, la colonna HA era ideale per la separazione del DNA in quanto può legarsi alla spina dorsale caricata negativamente del DNA.
Un'altra forma di cromatografia su colonna frequentemente utilizzata per separare le proteine è la cromatografia ad affinità metallica immobilizzata, o IMAC. In IMAC, la fase stazionaria possiede un ligando con uno ione metallico, che si lega a un tag istidina sulla proteina di interesse.
Tutti gli altri componenti della miscela escono dalla colonna. La proteina viene quindi eluita con una soluzione di imidazolo, che ha una struttura simile all'istidina e si lega più fortemente con lo ione metallico.
Un'applicazione comune della cromatografia su colonna è la cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC. L'HPLC è ampiamente utilizzato in chimica analitica sia per l'identificazione che per la separazione di composti biologici e non biologici in una miscela.
L'HPLC è simile alla cromatografia su colonna dimostrata in questo video, tranne per il fatto che è automatizzato e funziona a pressioni molto elevate. Ciò consente l'uso di perle in fase stazionaria più piccole, con un rapporto superficie/volume più elevato. Pertanto, sono possibili interazioni migliorate tra la fase stazionaria e i componenti nella fase mobile.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla cromatografia a scambio ionico. Ora dovresti capire i concetti alla base, i 4 passaggi coinvolti e alcune tecniche correlate.
Grazie per l'attenzione!
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Applications and Summary
La cromatografia a scambio ionico è ampiamente utilizzata in biochimica per isolare e purificare campioni di proteine. Le proteine hanno molti amminoacidi con gruppi funzionali che sono carichi. Le proteine vengono separate in base alla carica netta, che dipende dal pH. Alcune proteine sono caricate più positivamente mentre altre sono più caricate negativamente. Inoltre, i tag peptidici possono essere aggiunti geneticamente a una proteina per darle un punto isoelettrico che non è nella gamma delle proteine normali, rendendo possibile separarsi completamente. La cromatografia a scambio ionico è utile per separare complessi proteici multimerici, in quanto diverse configurazioni avrebbero diverse quantità di carica e diverse interazioni.
Un'altra importante applicazione della cromatografia a scambio ionico è l'analisi dell'acqua. La cromatografia a scambio anionico può essere utilizzata per misurare la concentrazione di anioni, inclusi solfati, nitrati, nitriti, fluoruro e cloruro. La cromatografia a scambio cationico viene utilizzata per misurare la concentrazione di cationi come sodio, potassio, calcio e magnesio. Un tipo di cromatografia a scambio ionico viene utilizzato anche nella purificazione dell'acqua, poiché la maggior parte degli addolcitori d'acqua filtra gli ioni magnesio e calcio in acqua dura legandoli a una resina, che rilascia sodio legato. I metalli pesanti, come il rame o il piombo, possono anche essere rimossi dall'acqua utilizzando la cromatografia a scambio ionico.
La cromatografia a scambio ionico è utile anche nella purificazione dei metalli. Può essere usato per purificare gli attinidi, come il plutonio, e rimuoverlo dalle barre di combustibile del reattore nucleare esaurito. Può anche essere usato per eliminare l'uranio e rimuoverlo dall'acqua o da altri campioni ambientali.
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