Overview
출처: 박사의 실험실.B 질 벤턴 - 버지니아 대학
이온 교환 크로마토그래피는 충전에 따라 문체를 분리하는 크로마토그래피의 한 유형입니다. 이온 교환 수지라고 하는 솔리드 지지대에서 충전된 고정 단계로 채워진 열이 사용됩니다. 강력한 양이온 교환 크로마토그래피는 음전하 수지를 사용하여 양이온을 우선적으로 분리하고 강력한 음이온 교환 크로마토그래피는 양전하 수지를 사용하여 음이온을 우선적으로 선택합니다. 크롬 토그래피의 이 모형은 단백질 또는 핵산 견본의 정화에서 예를 들면 견본 준비를 위해, 예를 들면 인기 있습니다.
이온 교환 크로마토그래피는 2단계 과정입니다. 첫 번째 단계에서 샘플은 로딩 버퍼의 열에 로드됩니다. 컬럼 수지에 충전된 샘플의 바인딩은 반대 전하의 샘플을 유치하기 위해 수지의 이온 상호 작용을 기반으로 합니다. 따라서, 수지에 반대 극성의 충전 된 샘플은 강하게 결합된다. 충전되지 않거나 반대 전하인 다른 분자는 결합되지 않으며 열을 통해 세척됩니다. 두 번째 단계는 수지에 바인딩된 별무를 엘로우트하는 것입니다. 이것은 완충제의 소금 양이 천천히 증가하는 소금 그라데이션으로 수행됩니다. 분수는 용출이 발생하고 이러한 분획 중 하나에서 정제 된 관심 샘플을 복구 할 수 있습니다으로 컬럼의 끝에 수집됩니다. 분광법과 같은 또 다른 기술은 샘플을 포함하는 분획을 식별하기 위해 필요할 수 있습니다. 이온 교환 크로마토그래피는 단백질 연구에서 특히 유용하며, 크기가 수지와의 상호 작용 수를 결정할 수 있으므로 특정 충전 또는 크기가 있는 관심 있는 단백질을 분리하는 데 특히 유용합니다.
이온 교환 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피보다 일반적인 분리 기술이며, 이는 항체가 하나의 특정 문체를 결합하기 위해 컬럼에 부착되는 단백질 샘플을 준비하는 데 자주 사용된다. 각 별무에 대해 새로운 친화성 컬럼을 구입해야 하며, 동일한 유형의 이온 교환 컬럼을 사용하여 동일한 충전의 많은 단백질을 정리하는 데 사용할 수 있습니다. 이온 교환 크로마토그래피는 다른 특성에 따라 분리되는 다른 유형의 크로마토그래피와 함께 사용할 수도 있습니다. 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피는 크기에 따라 구분되며 이온 교환 크로마토그래피 전에 지정된 크기의 화합물만 선택하도록 사용할 수 있습니다.
Principles
이온 교환 크로마토그래피는 고정 된 단계에서 분석을 가역적 인 흡착으로 이어지는 이온 화학 상호 작용의 원칙에 의해 지배됩니다. 시료와 고체 지지대 사이의 결합 강도는 시료 및 수지의 기능성 그룹의 수와 유형에 의해 좌우됩니다. 로딩 버퍼는 일반적으로 샘플과 수지 간의 상호 작용을 촉진하기 위해 낮은 전도도를 갖는다. 강한 양이온 교환 수지는 일반적으로 황포산 기능성 군을 특징으로 하며, 약한 양이온 교환 수지에는 카복실산이 있습니다. 강력한 애니온 교환 수지에는 사분면 아민이 들어 있으며 약한 애니온 교환 수지에는 보조 또는 삼차 마인이 있습니다. 강하고 약한 용어는 컬럼 재질의 산/기본 특성을 참조하며, 아닐 때 는 아닐 수 있습니다. 약한 수지는 강한 수지보다 더 작은 pH 범위에 걸쳐 충전되지만 여전히 문체를 매우 효과적으로 묶고 필요한 pH 범위에서 충전될 경우 좋은 선택이 될 수 있습니다. 사용하기 전에 이온 교환 열은 평형 버퍼를 사용하여 pH에서 평형화됩니다.
관심 있는 샘플을 예우하기 위해 소금 그라데이션이 사용됩니다. 수지에 덜 단단히 묶인 샘플은 소금이 열에 대한 이온 결합을 가장 쉽게 방해하기 때문에 먼저 엘루트됩니다. 더 단단히 묶인 견본은 소금의 더 높은 양이 사용될 때 나중에 elute 것입니다. 일반적으로 소금의 선형 그라데이션이 사용되며, 소금 농도는 시간이 지남에 따라 선형 방식으로 증가합니다. 그러나, 단계 그라데이션은 시간이 지남에 따라 소금의 농도가 강화되는 곳에서도 사용될 수 있다.
이온 교환 실험의 한 가지 중요한 고려 사항은 버퍼의 pH입니다. pH는 관심 있는 문체가 청구되고 수지에 결합되도록 유지되어야 합니다. 단백질의 경우, 전하는 단백질이 중화되고 pI로 측정되는 단백질의 등산 지점을 기반으로 합니다. pH는 단백질 pI에 비해 예상 단백질 전하에 대한 정보를 제공한다. 양이온 교환 크로마토그래피에서 pH를 올리면 분석체가 양해충전이 적고 음전하 수지와 상호 작용할 가능성이 줄어듭니다. 유사하게, 음이온 교환 크로마토그래피에서, pH를 낮추면 분석체가 덜 부정적으로 충전되고 양전하 수지와 상호 작용할 가능성이 적습니다. 따라서 pH 조정은 컬럼에서 아닐리바이트를 선택적으로 엘루트하는 데사용할 수도 있다. 염 대신 pH 조정을 사용하면 두 가지 유형의 단백질을 다른 pI 값으로 분리하는 데 유리할 수 있습니다.
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Procedure
1. 샘플 및 열 준비
- 이 데모에서, 2 단백질의 혼합물은 양이온 교환 컬럼에 분리될 것이다: 헤모글로빈과 사이토크롬 C. 단백질 샘플및 소용돌이에 0.2 mL 평형 버퍼(pH 8.1)를 추가하여 철저히 섞는다. 2 분 동안 원심 분리기는 거품을 제거합니다.
- 수지침이 정착할 수 있도록 5분 동안 시험관에 양이온 교환 컬럼을 놓습니다. 테스트 튜브를 링 스탠드에 컬럼으로 고정하여 똑바로 세워 있는지 확인합니다.
- 열의 위쪽 캡을 열고 아래쪽 캡을 엽니다. 컬럼의 버퍼가 중력 하에서 테스트 튜브로 흘러 내도록 합니다.
- 열 볼륨(이 경우 열 볼륨은 0.3 mL)으로 열을 평형 버퍼로 두 번 세척합니다. 평형 버퍼의 첫 번째 열 부피(0.3 mL)가 두 번째 열 볼륨을 추가하기 전에 폐기물 바이알에 드립하게 합니다. 이 단계를 사용하면 열이 평형 버퍼와 일치할 수 있습니다. 이 단계에서 계피 버퍼를 천천히 추가하여 수지를 방해하지 않습니다.
2. 양이온 교환 컬럼을 통해 단백질 샘플 실행
- "언바운드 1"이라고 표시된 2mL 원심분리기 튜브에 컬럼을 넣습니다. 단백질 샘플의 0.1 mL을 조심스럽게 컬럼 의 상단에 적재합니다.
- 샘플이 컬럼 의 상단에 로드되면 컬럼 상단에 버퍼를 추가하고 끝까지 떨어 뜨릴 수 있도록하여 평형 버퍼0.3mL로 세척하십시오. 이 단계4배(총 5개의 세척용)를 반복하고 별도의 2mL 원심분리기 튜브에서 각 세척을 수집합니다. 튜브를 "언바운드 1-5"로 레이블을 지정합니다.
- 마지막 2 개의 세하의 경우 원심분리기는 1,000 x g에서 10 초 동안 원심분리기를 사용하여 모든 언바운드 종들이 열에서 벗어날 수 있도록 합니다. 열에 바인딩하는 모든 샘플은 이러한 세척에 없어야하지만 바인딩되지 않는 샘플은 유지되지 않고 씻어 내게 됩니다. 원심 분리는 열에서 언바운드 재료를 씻는 데 더 많은 힘을 제공합니다.
- "바운드 1"이라고 표시된 새로운 2mL 원심분리기 수집 튜브에 컬럼을 넣습니다. 0.3mL의 용출 버퍼(높은 소금, pH 5.5)를 열 위에 놓습니다. 원심 분리는 1,000 x g에서 10 s에 대한 결과 용액을 합니다.
- 용출 단계를 2회 더 반복하여 컬럼을 새로운 원심분리기 튜브에 넣고 0.3mL를 추가하고 10초동안 원심분리를 합니다. 이 "바운드 2 및 3"에 레이블을 지정합니다.
- 분수에 대한 색상 변경 또는 관찰을 기록합니다. 헤모글로빈은 붉은 갈색으로 보이는 색의 단백질이며, 사이토크롬 C는 붉은 색입니다.
3. 결과: 헤모글로빈과 사이토크롬 C의 양이온 교환
- 사이토크롬 C는 pI가 10.5이고 헤모글로빈은 6.8의 pI를 가지고 있습니다. 따라서 pH 8.1 평형 버퍼가 사용되는 경우, 헤모글로빈은 음전하되기 때문에 열에 결합하지 않습니다. Cytochrome C는 이 pH에서 양호하게 충전되며 pH가 pI를 < 때문에 열에 바인딩됩니다.
- 헤모글로빈은 열에 바인딩되지 않기 때문에 언바운드 분수에서 관찰됩니다.
- Cytochrome C는 양이온 교환 열에 바인딩되었기 때문에 바운드 된 분획으로 관찰됩니다.
그림 1. 언바운드 분수(헤모글로빈)와 바운드 분수(시토크롬 C)의 그림입니다.
이온 교환 크로마토그래피는 충전 된 화합물, 특히 큰 생체 분자의 분리 및 격리에 널리 사용됩니다.
액체 염색체의 이 모형은 수지에게 불린 포장된 고정상 구슬의 컬럼을 이용합니다. 이 기술은 충전된 수지와의 친화성에 따라 별채를 분리합니다.
이 기술의 두 가지 주요 유형이 있습니다. 양이온 교환 크로마토그래피에서 음전하 수지는 양전하 분석물을 결합하는 데 사용됩니다. 마찬가지로 음전 교환에서는 음전하 분석이 양충전 수지에 결합합니다. 언바운드 화합물은 컬럼을 통해 세척되고, 아닐리바이트는 별도의 용기로 수집될 수 있다.
이 비디오는 이온 교환 크로마토그래피의 기초를 소개하고 실험실에서 단백질 혼합물을 분리하여 기술을 시연할 것입니다.
고정 된 단계는 성공적인 분리의 핵심 구성 요소입니다. 강한 양이온 교환 수지는 일반적으로 황포산과 같은 강한 산 성 기능 군을 특징으로 합니다. 약한 양이온 교환 수지는 카복실산과 같은 약한 군을 특징으로 합니다.
마찬가지로, 강력한 애니온 교환 수지는 사분위 암석과 같은 강력한 기지를 이용하며, 약한 애니온 교환 수지는 보조 또는 고등 아민을 사용합니다. 수지의 선택은 샘플 혼합물의 특성 및 관심있는 질립에 따라 달라집니다.
모바일 위상이라고 통칭하는 버퍼는 특히 pH 측면에서 분리하는 데 중요합니다. 단백질의 경우, pH는 동전점 또는 pI에 기초하여 선택된다. 단백질의 pI와 동일한 pH에서 단백질은 중립적입니다. pI 위에, 그것은 순 음전하를해야합니다, pI 아래 동안, 그것은 순 긍정적 인 요금을해야합니다. 완충제 pH는 단백질이 제대로 충전되고 고정 된 단계에 결합 할 수 있도록 선택해야합니다.
이온 교환 크로마토그래피는 일반적으로 4단계 과정입니다. 첫째, 음이온 또는 양이온 교환 수지중 하나를 포함하는 포장 된 열은 버퍼를 사용하여 평형됩니다. 애니온 교환 열의 경우 수지 양성으로 수지가 양전하됩니다.
다음으로 샘플이 열에 로드됩니다. 완충제종은 수지와의 상호 작용을 위해 샘플과 경쟁할 수 있기 때문에 버퍼는 전도율이 낮어야 합니다. 반대 전하의 화합물은 수지에 결합합니다. 충전되지 않거나 동일한 전하를 운반하지 않는 분자는 언바운드 상태로 유지됩니다.
세 번째 단계에서 열은 추가 버퍼로 세척되어 열에서 언바운드 구성 요소를 제거하여 바인딩된 상태로 둡니까됩니다.
마지막으로, 네 번째 단계는 바운드 된 문별물의 용출이다. 이것은 소금 농도가 점차 증가하는 소금 그라데이션을 사용하거나 높은 염용 용출 버퍼를 사용하여 수행됩니다.
약한 결합분자는 먼저 용출될 것이며, 낮은 소금은 수지에 대한 이온 결합을 가장 쉽게 방해할 것입니다. 더 강하게 결합된 화합물은 더 높은 염 농도로 엘루트것입니다.
이제 이온 교환 크로마토그래피의 기본이 설명되었으므로 두 단백질의 분리에 대한 사용을 살펴 볼 수 있습니다.
먼저, 분리를 위해 단백질 혼합물을 준비하려면, 0.2mL의 결합 완충제와 소용돌이를 추가하여 철저히 섞는다. 그런 다음 혼합물을 원심분리하여 거품을 제거합니다. 양이온 교환 열을 준비하려면 링 스탠드에 수직으로 고정하고 수지가 정착하도록 합니다.
열의 위쪽 캡을 열고 아래쪽을 엽니다. 버퍼가 중력 하에서 아래 튜브로 흘러 내도록 합니다.
열을 준비하려면 이 경우 0.3mL의 열 버퍼 볼륨을 로드하여 해당 열을 평가합니다. 버퍼가 컬럼에서 떨어지는 것을 폐기물 유리병으로 넣습니다. 버퍼의 열 볼륨이 종료된 후 평형 단계를 반복합니다.
실험을 실행하려면 컬럼 아래에 "언바운드 1"이라고 표시된 2mL 원심분리기 튜브를 배치합니다. 단백질 샘플의 0.1 mL을 조심스럽게 컬럼 의 상단에 적재합니다.
샘플이 로드되면 열 량의 버퍼로 세척하고 끝까지 흐르도록 합니다. 총 5개의 세시즈를 반복합니다. "5"를 통해 "언바운드 1"이라고 표시된 자체 튜브에서 각 세척을 수집합니다. 마지막 2 개의 세척의 경우, 10 초동안 열을 원심 분리하여 모든 언바운드 종들이 열을 씻어 내도록 합니다. 컬럼을 새로운 2mL 원심분리기 수집 튜브에 넣고 "바운드 1"이라고 표시합니다. 열 위에 1열 볼륨의 용출 버퍼를 로드합니다. 1,000 x g에서 10 s의 원심 분리기.
구속된 해석물의 수집을 보장하기 위해 용출 단계를 2회 더 반복합니다. 튜브를 "바운드 2"와 "3"에 레이블을 지정합니다. 분수에 대한 색상 변경 또는 관찰을 기록합니다.
이 예에서는 헤모글로빈과 사이토크롬 C가 분리되었다. 헤모글로빈은 6.8의 pI를 가지고 있으며, 사이토크롬 C는 10.5의 pI를 가지고 있습니다. pH 8.1 버퍼에서 헤모글로빈은 음전하로 충전되며 열에 바인딩되지 않습니다. 반대로, 사이토크롬 C는 pH 8.1에서 양호하게 충전되고 열에 바인딩됩니다.
헤모글로빈, 갈색 색깔의 단백질은, 불변의 분수에서 찾아냈고, 사이토크롬 C는, 붉은 색깔의 단백질, 결합된 분수에서 관찰되었습니다.
액체 크로마토그래피의 많은 형태가 있다, 혼합물의 구성 요소를 분리 하는 다른 능력을 가진 각.
이 예에서, 열 크로마토그래피는 단일 및 이중 좌초 된 DNA의 혼합물을 분리하는 데 사용되었다. 하이드록시아파티트(HYDROxyapatite) 또는 HA는 양전하 칼슘 이온으로 인해 일반적으로 고정된 단계로 사용되는 칼슘 인산염의 결정형태입니다. 이 경우 HA 컬럼은 DNA의 음전하 중추에 결합할 수 있으므로 DNA분리에 이상적이었습니다.
단백질을 분리하는 데 자주 사용되는 또 다른 형태의 컬럼 크로마토그래피는 고정 금속 친화성 크로마토그래피 또는 IMAC입니다. IMAC에서 고정 된 단계는 관심있는 단백질에 히스티딘 태그에 결합하는 금속 이온이있는 리간드를 보유하고 있습니다.
혼합물의 다른 모든 구성 요소는 컬럼을 종료합니다. 단백질은 히스티딘과 유사한 구조를 가진 이미다졸의 용액으로 용출되고 금속 이온으로 더 강하게 결합합니다.
컬럼 크로마토그래피의 일반적인 적용은 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC입니다. HPLC는 혼합물에서 생물학적 및 비 생물학적 화합물의 식별 및 분리를 위해 분석 화학에 널리 사용된다.
HPLC는 자동화되고 매우 높은 압력으로 작동한다는 것을 제외하고는 이 비디오에서 입증된 열 크로마토그래피와 유사합니다. 이를 통해 더 작은 고정 위상 구슬을 사용할 수 있으며 표면적대 부피 비율이 높습니다. 따라서, 이동상에서 고정된 위상과 구성요소 간의 상호작용이 개선될 수 있다.
당신은 방금 이온 교환 크로마토그래피에 대한 JoVE의 소개를 지켜보았습니다. 이제 그 뒤에 있는 개념, 관련된 4단계 및 일부 관련 기술을 이해해야 합니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
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Applications and Summary
이온 교환 크로마토그래피는 단백질 샘플을 분리하고 정화하기 위해 생화학에 널리 사용됩니다. 단백질에는 충전되는 기능성 그룹이 있는 많은 아미노산이 있습니다. 단백질은 pH에 의존하는 순 전하에 따라 분리됩니다. 몇몇 단백질은 그 외가 더 부정적으로 충전되는 동안 더 긍정적으로 충전됩니다. 또한, 펩티드 태그는 단백질에 유전적으로 첨가되어 정상 단백질의 범위에 있지 않은 등산지점을 제공하여 완전히 분리할 수 있게 한다. 이온 교환 크로마토그래피는 다른 구성이 다른 양의 전하와 다른 상호 작용을 가질 것이기 때문에 다황 단백질 복합체를 분리하는 데 유용합니다.
이온 교환 크로마토그래피의 또 다른 주요 적용은 물 분석입니다. 음이온 교환 크로마토그래피는 황산염, 질산염, 아질산염, 불소 및 염화물을 포함한 음이온의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있습니다. 양이온 교환 크로마토그래피는 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘과 같은 양이온농도를 측정하는 데 사용됩니다. 대부분의 물 연화제가 결합된 나트륨을 방출하는 수지에 결합하여 경수에서 마그네슘과 칼슘 이온을 걸러내기 때문에 이온 교환 크로마토그래피의 유형은 수질 정제에도 사용됩니다. 구리 나 납과 같은 중금속은 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 물에서 제거 할 수 있습니다.
이온 교환 크로마토그래피는 금속 정화에도 유용하다. 플루토늄과 같은 액타니드를 정화하고 소비된 원자로 연료 봉에서 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 우라늄을 청소하고 물 이나 다른 환경 샘플에서 제거 하는 데 사용할 수 있습니다.
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