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Ionenaustausch Chromatographie

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Ionenaustausch Chromatographie ist weit verbreitet in der Trennung und Isolation der geladenen Verbindungen, besonders große Biomoleküle.

Diese Art der Flüssigchromatographie verwendet eine Spalte verpackt stationäre Phase Kügelchen, genannt Harz. Die Technik trennt Analyten basierend auf ihre Verbundenheit mit dem aufgeladenen Harz.

Es gibt zwei Haupttypen von dieser Technik. Kationenaustausch Chromatographie wird negativ geladene Harz zur positiv geladenen Analyten binden. In ähnlicher Weise im Anion-Austausch binden negativ geladene Analyten an positiv geladenen Harz. Die ungebundenen Verbindungen werden durch die Säule gewaschen und der Analyten kann dann in einem separaten Behälter gesammelt werden.

Dieses Video wird Grundkenntnisse über Ionenaustausch Chromatographie und zeigen die Technik durch die Trennung einer Proteinmischung im Labor.

Die stationäre Phase ist ein wichtiger Bestandteil für eine erfolgreiche Trennung. Starke Kationenaustausch Harze verfügen in der Regel stark sauren funktionellen Gruppen, z. B. Sulfonsäure. Schwache Kationenaustausch Harze verfügen über schwache Gruppen, wie z. B. Carbonsäuren.

In ähnlicher Weise nutzen starke Anionen-Austausch Harze starke Basen, wie quartäre Amine, während schwache Anion-Austausch Harze sekundäre oder tertiäre Amine verwenden. Die Auswahl des Harzes hängt von den Eigenschaften der Probe-Mischung und der Analyten von Interesse.

Die Puffer verwendet, sind zusammen genannt die mobile Phase auch wichtig, Trennung, besonders in Bezug auf die pH. PH-Wert ist für Proteine basierend auf seinen isoelektrischen Punkt oder pI ausgewählt. Bei einem pH-Wert entspricht das Protein pI ist das Protein neutral. Über die pI haben es net negativ geladen, während unten die pI, es muss eine positive Nettoladung. Der Puffer pH-Wert muss ausgewählt werden, so ist das Protein ordnungsgemäß geladen und in der Lage, an die stationäre Phase binden.

Ionenaustausch Chromatographie ist in der Regel ein vier-Stufen-Prozess. Erstens ist eine verpackte Spalte mit entweder Anion oder Kationenaustauschermembran Harz equilibriert mit Puffer. Für Anionen-Austausch Spalten handelt es sich um Protonating des Harzes, sicherzustellen, dass es positiv geladen ist.

Als nächstes wird die Probe in der Spalte geladen. Der Puffer muss geringen Leitfähigkeit, wie geladene Spezies mit der Probe für Interaktionen mit dem Harz konkurrieren können. Verbindungen der entgegengesetzte Ladung an das Harz gebunden. Moleküle, die werden nicht berechnet, oder tragen die gleiche Ladung bleiben ungebunden.

Im dritten Schritt wird die Spalte mit zusätzlichen Puffer, die ungebundenen Bestandteile aus der Spalte, die Grenze zu hinterlassen entfernen gewaschen.

Schließlich ist der vierte Schritt der Elution des gebundenen Analyten. Dies geschieht entweder durch einen Salz Farbverlauf, wo ist die Salzkonzentration schrittweise erhöht oder verwenden einen hohen Salz Elution Puffer.

Moleküle, die schwach gebunden sind werden zuerst eluiert werden, wie wenig Salz ihre ionische Bindung an das Harz am leichtesten stören wird. Verbindungen, die stärker gebunden sind, werden mit höherer Salzkonzentration eluieren.

Nun, da die Grundlagen der Ionenaustausch-Chromatographie dargelegt haben, werfen wir einen Blick auf seine Verwendung in der Trennung der beiden Proteine.

Fügen Sie zunächst um die Proteinmischung für die Trennung vorzubereiten, 0,2 mL Bindung Puffer und Wirbel, gründlich mischen. Zentrifugieren Sie dann die Mischung um jede Schaum zu entfernen. Um den Kationenaustausch Spalte vorzubereiten, Klemmen Sie es vertikal auf einem Ring Stand und lassen Sie das Harz zu begleichen.

Öffnen Sie die Abdeckkappe der Spalte, und dann unten. Lassen Sie den Puffer heraus unter Schwerkraft in ein Rohr unten zu Tropfen.

Zur Vorbereitung der Spalte equilibrate es durch eine Spalte des Puffers, in diesem Fall 0,3 mL Ladevolumen. Lassen Sie den Puffer aus der Spalte in einem Abfall Fläschchen tropft. Nachdem eine Spalte-Volumen des Puffers beendet wurde, wiederholen Sie den Gleichgewichtherstellung Schritt.

Um das Experiment auszuführen, legen Sie ein 2-mL Zentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung "Unbound 1" unter der Spalte. Laden Sie sorgfältig 0,1 mL der Protein-Probe auf dem oberen Rand der Spalte.

Sobald die Probe geladen wurde, waschen mit einem Spalte-Volumen des Puffers und lassen Sie es ganz durch zu fließen. Wiederholen Sie für insgesamt 5 Wäschen. Sammeln Sie jedem Waschen in eine eigene Röhre, mit der Bezeichnung "Unbound 1" bis "5". Für die letzten 2 Wäschen Zentrifugieren die Spalte für 10 s um sicherzustellen, dass die Spalte alle ungebundene Arten abwaschen. Setzen Sie die Spalte in eine neue Sammlung in 2-mL Zentrifugenröhrchen und Label es 1 "gebunden". Ladevolumen Sie 1 Spalte-der Elution Puffer oben auf die Spalte. Zentrifuge für 10 s bei 1.000 x g.

Wiederholen Sie den Elution Schritt 2 weitere Male zur Sammlung des gebundenen Analyten zu gewährleisten. Beschriften Sie die Rohre "Gebundenen 2" und "3". Nehmen Sie Farbänderungen oder Beobachtungen über die Fraktionen.

In diesem Beispiel wurden Hämoglobin und Cytochrom C getrennt. Hämoglobin hat einen pI von 6,8, Cytochrom C eine pI von 10,5. Im Puffer pH 8.1 Hämoglobin ist negativ geladen und bindet nicht an die Spalte. Im Gegensatz dazu Cytochrom C ist bei pH 8.1 positiv geladen und bindet an die Spalte.

Hämoglobin, ein bräunlich gefärbten Protein wurde in den ungebundenen Fraktionen gefunden, während Cytochrom C, ein rötlich gefärbten Protein in der gebundenen Anteil beobachtet wurde.

Es gibt viele Formen der Flüssigchromatographie, jeweils mit unterschiedlichen Fähigkeiten, Bestandteile einer Mischung zu trennen.

In diesem Beispiel wurde Säulenchromatographie verwendet, um eine Mischung aus Einzel- und Doppelzimmer stranded DNA zu trennen. Hydroxylapatit oder HA, ist eine kristalline Form von Calcium-Phosphat häufig verwenden als eine stationäre Phase aufgrund seiner positiv geladenen Calcium-Ionen. In diesem Fall war die HA-Spalte für die Trennung von DNA ideal, da es an negativ geladene Rückgrat der DNA binden kann.

Eine andere Form der Säulenchromatographie häufig verwendet, um Proteine zu trennen ist immobilisierten Metall Affinitätschromatographie oder IMAC. IMac besitzt die stationäre Phase ein Liganden mit einer Metall-Ionen, die an einem Histidin-Tag auf das Protein des Interesses bindet.

Alle anderen Komponenten des Gemisches beenden die Spalte. Das Protein wird dann mit einer Lösung von Imidazol, eluiert, hat eine ähnliche Struktur wie Histidin und stärker mit der Metall-Ionen bindet.

Eine häufige Anwendung der Säulenchromatographie ist Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder HPLC. HPLC ist verbreitet in der analytischen Chemie zur Identifizierung und Trennung von biologischer und nicht-biologischen Verbindungen in einer Mischung.

HPLC ist vergleichbar mit der Säulenchromatographie in diesem Video gezeigt, außer dass es ist automatisiert, und bei sehr hohen Drücken betrieben. Dies ermöglicht den Einsatz von kleineren stationären Phase Perlen mit einer höheren Fläche Volumen-Verhältnis. So sind verbesserte Interaktionen zwischen der stationären Phase und Komponenten in der mobilen Phase möglich.

Sie habe nur Jupiters Einführung Ionenaustausch Chromatographie beobachtet. Sie sollten nun die Konzepte dahinter, die 4 Schritte, und einige verwandten Techniken verstehen.

Danke fürs Zuschauen!

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