Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Analytical Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

Cromatografia de Troca de Íons

Overview

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia

Cromatografia de troca de íons é um tipo de cromatografia que separa analitos com base na carga. Uma coluna é usada que é preenchida com uma fase estacionária carregada em um suporte sólido, chamada de resina de troca de íons. A cromatografia forte de troca de cations separa preferencialmente os ceados usando uma resina carregada negativamente, enquanto a cromatografia forte de troca de ânions seleciona preferencialmente os ânions usando uma resina carregada positivamente. Esse tipo de cromatografia é popular para a preparação da amostra, por exemplo, na limpeza de proteínas ou amostras de ácido nucleico.

Cromatografia de troca de íons é um processo de duas etapas. Na primeira etapa, a amostra é carregada na coluna em um buffer de carregamento. A vinculação da amostra carregada à resina da coluna baseia-se em interações iônicas da resina para atrair a amostra da carga oposta. Assim, amostras carregadas de polaridade oposta à resina estão fortemente ligadas. Outras moléculas que não são carregadas ou são da carga oposta não estão ligadas e são lavadas através da coluna. O segundo passo é elutar o analito que está ligado à resina. Isso é feito com um gradiente de sal, onde a quantidade de sal no tampão é lentamente aumentada. As frações são coletadas no final da coluna à medida que ocorre a elução e a amostra purificada de interesse pode ser recuperada em uma dessas frações. Outra técnica, como a espectroscopia, pode ser necessária para identificar qual fração contém a amostra. A cromatografia de troca de íons é especialmente útil em estudos proteicos, para isolar proteínas de interesse que tenham uma carga ou tamanho específicos, pois o tamanho pode determinar o número de interações com a resina.

Cromatografia de troca de íons é uma técnica de separação mais geral do que a cromatografia de afinidade, que também é frequentemente usada no preparo de amostras proteicas, onde um anticorpo é anexado a uma coluna para ligar um analito específico. Uma nova coluna de afinidade deve ser comprada para cada analito, enquanto o mesmo tipo de coluna de troca de íons, muitas vezes com diferentes condições de eluição, pode ser usado para limpar muitas proteínas da mesma carga. A cromatografia de troca de íons também pode ser usada em conjunto com outros tipos de cromatografia que se separam com base em outras propriedades. Por exemplo, a cromatografia de exclusão de tamanho separa-se com base no tamanho e poderia ser usada antes da cromatografia de troca de íons para escolher compostos de apenas um determinado tamanho.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A cromatografia de troca de íons é regida pelos princípios das interações químicas iônicas que levam à adsorção reversível do analito na fase estacionária. A força da ligação entre a amostra e o suporte sólido é regida pelo número e tipos de grupos funcionais na amostra e na resina. O tampão de carga geralmente tem baixa condutividade, a fim de promover interações entre a amostra e a resina. Resinas de troca de cation forte normalmente apresentam grupos funcionais de ácido sulfônico, enquanto resinas fracas de troca de cáção têm ácidos carboxílicos. Resinas de troca aniônica forte contêm aminas quaternárias, enquanto resinas fracas de troca de ânion apresentam aminas secundárias ou terciárias. Os termos fortes e fracos referem-se às propriedades ácido/base do material da coluna e não quão bem ele liga um analito. Resinas fracas são carregadas sobre uma faixa de pH menor do que resinas fortes, mas ainda ligam os analitos de forma muito eficaz, e podem ser uma boa escolha se forem carregadas na faixa de pH necessária. Antes do uso, as colunas de troca de íons são equilibradas em um pH usando um buffer de equilíbrio.

Para elutar a amostra de interesse, é usado um gradiente de sal. Amostras que estão menos firmemente ligadas à resina irão elute primeiro, pois o sal irá mais facilmente perturbar sua ligação iônica com a coluna. Amostras mais apertadas se estotarão mais tarde, quando forem utilizadas maiores quantidades de sal. Normalmente, é usado um gradiente linear de sal, onde a concentração de sal aumenta ao longo do tempo de forma linear. No entanto, gradientes de passo também podem ser usados onde a concentração de sal é intensificada ao longo do tempo.

Uma consideração importante para experimentos de troca de íons é o pH dos buffers. O pH precisa ser mantido para que o analito de juros seja cobrado e se ligue à resina. Para proteínas, a carga é baseada no ponto isoelétrico da proteína, onde a proteína é carregada neutramente, e medida como i PEI. O pH em comparação com a proteína pI fornece informações sobre a carga de proteína esperada. Na cromatografia de troca de cáation, o aumento do pH fará com que o analito seja menos carregado positivamente e menos propenso a interagir com a resina negativamente carregada. Da mesma forma, na cromatografia de troca de anion, a redução do pH fará com que o analito seja menos carregado negativamente e menos propenso a interagir com a resina positivamente carregada. Assim, ajustes de pH também podem ser usados para elute seletivamente analitos da coluna. O uso de ajustes de pH em vez de sais poderia ser vantajoso para separar dois tipos diferentes de proteínas com diferentes valores de II.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Preparando a Amostra e a Coluna

  1. Nesta demonstração, uma mistura de 2 proteínas será separada em uma coluna de troca de cáation: hemoglobina e citocromo C. Adicione 0,2 mL tampão de equilíbrio (pH 8.1) à amostra de proteína e vórtice para misturar completamente. Centrifuga por 2 minutos para remover qualquer espuma.
  2. Coloque a coluna de troca de cation em um tubo de ensaio por 5 minutos para permitir que a resina se instale. Aperte o tubo de ensaio com a coluna em um suporte de anel para ter certeza de que está ereto.
  3. Abra a tampa superior da coluna e, em seguida, a tampa inferior. Deixe o buffer na coluna escorrer sob gravidade para o tubo de ensaio.
  4. Lave a coluna duas vezes com um volume de coluna (neste caso, o volume da coluna é de 0,3 mL) de tampão de equilíbrio. Deixe que o primeiro volume de coluna (0,3 mL) do tampão de equilíbrio escorra no frasco de resíduos antes de adicionar o segundo volume de coluna. Esta etapa permite que a coluna equilibre com o buffer de equilíbrio. Adicione o tampão de equilíbrio lentamente nesta etapa para não perturbar a resina.

2. Executando uma amostra de proteína através de uma coluna de troca de cation

  1. Coloque a coluna em um tubo de centrífugas de 2 mL rotulado como "Unbound 1". Carregue cuidadosamente 0,1 mL da amostra de proteína na parte superior da coluna.
  2. Uma vez que a amostra tenha sido carregada na parte superior da coluna, lave-a com 0,3 mL de tampão de equilíbrio adicionando o buffer na parte superior da coluna e permitindo que ela escorra por todo o caminho. Repita esta etapa 4x (para um total de 5 lavagens) e colete cada lavagem em um tubo de centrífuga separado de 2 mL. Rotule os tubos como "Unbound 1-5".
  3. Para as últimas 2 lavagens, centrífuga por 10 s a 1.000 x g para garantir que todas as espécies desvinculas saiam da coluna. Qualquer amostra que se ligue à coluna não deve estar nestas lavagens, mas a amostra que não se ligar será lavada sem ser retida. A centrifugação fornece mais força para lavar materiais não vinculados da coluna.
  4. Coloque a coluna em um novo tubo de coleção de centrífugas de 2 mL rotulado como "Bound 1". Coloque 0,3 mL de tampão de eluição (sal alto, pH 5,5) em cima da coluna. Centrifugar o eluente resultante para 10 s a 1.000 x g.
  5. Repita a etapa de eluição mais 2 vezes colocando a coluna em um novo tubo de centrífuga, adicionando 0,3 mL e centrifugando para 10 s. Rotule estes "Bound 2 e 3".
  6. Regisso regissão qualquer alteração de cor ou observações sobre as frações. A hemoglobina é uma proteína colorida que parece marrom-avermelhada, enquanto o citocromo C é de cor avermelhada.

3. Resultados: Cation-troca de Hemoglobina e Citocromo C

  1. Cytochrome C tem um iPI de 10,5 e hemoglobina um iPI de 6,8. Assim, quando um tampão de equilíbrio pH 8.1 é usado, a hemoglobina não se liga à coluna porque é carregada negativamente. O Citocromo C é carregado positivamente neste pH e se liga à coluna porque o pH < pI.
  2. A hemoglobina é observada nas frações não ligadas porque não está ligada à coluna.
  3. O citocromo C é observado em frações vinculadas, porque estava ligado à coluna de troca de delitos.

Figure 1
Figura 1. Imagem de fração desvinculada (hemoglobina) e fração amarrada (citocromo C).

A cromatografia de troca de íons é amplamente utilizada na separação e isolamento de compostos carregados, particularmente grandes biomoléculas.

Este tipo de cromatografia líquida usa uma coluna de contas estacionárias embaladas, chamadas resina. A técnica separa analitos baseados em sua afinidade com a resina carregada.

Existem dois tipos principais dessa técnica. Na cromatografia de troca de cation, a resina carregada negativamente é usada para ligar analitos carregados positivamente. Da mesma forma, na troca de ânion, analitos carregados negativamente se ligam à resina carregada positivamente. Os compostos desvinculados são lavados através da coluna, e o analito pode então ser coletado em um recipiente separado.

Este vídeo introduzirá o básico da cromatografia de troca de íons, e demonstrará a técnica separando uma mistura de proteínas em laboratório.

A fase estacionária é um componente-chave para uma separação bem sucedida. Resinas fortes de troca de cation normalmente apresentam grupos funcionais ácidos fortes, como o ácido sulfônico. Resinas fracas de troca de cá de cá de cásming apresentam grupos fracos, como ácidos carboxílicos.

Da mesma forma, resinas fortes de troca de ânion utilizam bases fortes, como aminas quaternárias, enquanto resinas fracas de troca de ânion usam aminas secundárias ou terciárias. A seleção da resina dependerá das propriedades da mistura amostral e do analito de interesse.

Os buffers utilizados, chamados coletivamente de fase móvel, também são importantes para a separação, particularmente em termos de pH. Para proteínas, o pH é selecionado com base em seu ponto isoelétrico, ou i PI. Em um pH igual ao iE da proteína, a proteína é neutra. Acima do i PI, ele terá uma carga negativa líquida, enquanto abaixo do i PI, ele terá uma carga positiva líquida. O pH tampão deve ser selecionado para que a proteína seja devidamente carregada e capaz de se ligar à fase estacionária.

Cromatografia de troca de íons é geralmente um processo de quatro etapas. Primeiro, uma coluna embalada contendo resina de ânion ou cation-exchange é equilibrada usando buffer. Para colunas de troca de íons, isso envolve protonar a resina, garantindo que ela seja carregada positivamente.

Em seguida, a amostra é carregada na coluna. O tampão deve ter baixa condutividade, pois as espécies carregadas podem competir com a amostra para interações com a resina. Compostos de carga oposta se ligam à resina. Moléculas que não são carregadas, ou carregam a mesma carga, permanecem desvinculados.

Na terceira etapa, a coluna é lavada com tampão adicional para remover os componentes desvinculados da coluna, deixando o limite para trás.

Finalmente, o quarto passo é a elução do analito vinculado. Isso é feito usando um gradiente de sal, onde a concentração de sal é gradualmente aumentada, ou usando um tampão de eluição de sal elevado.

Moléculas que estão fracamente ligadas serão elu iludidas primeiro, pois o sal baixo perturbará mais facilmente sua ligação iônica com a resina. Compostos mais fortemente ligados se elute com maiores concentrações de sal.

Agora que o básico da cromatografia de troca de íons foi delineado, vamos dar uma olhada no seu uso na separação de duas proteínas.

Primeiro, para preparar a mistura de proteínas para separação, adicione 0,2 mL de tampão de ligação e vórtice para misturar bem. Em seguida, centrifufique a mistura para remover qualquer espuma. Para preparar a coluna de troca de cá, aperte-a verticalmente em um suporte de anel e deixe a resina se instalar.

Abra a tampa superior da coluna e, em seguida, a parte inferior. Deixe o buffer escorrer sob gravidade em um tubo abaixo.

Para preparar a coluna, equilibre-a carregando uma coluna-volume de buffer, neste caso 0,3 mL. Deixe o tampão escorrer da coluna em um frasco de resíduos. Após a saída de um volume de coluna de buffer, repita a etapa de equilíbrio.

Para executar o experimento, coloque um tubo de centrífuga de 2 mL rotulado "Unbound 1" abaixo da coluna. Carregue cuidadosamente 0,1 mL da amostra de proteína na parte superior da coluna.

Uma vez que a amostra tenha sido carregada, lave com um volume de coluna de buffer e deixe fluir todo o caminho. Repita para um total de 5 lavagens. Colete cada lavagem em seu próprio tubo, rotulado de "Unbound 1" através de "5". Para as últimas 2 lavagens, centrifugar a coluna por 10 s para garantir que todas as espécies não ligadas lavem a coluna. Coloque a coluna em um novo tubo de coleção de centrífugas de 2 mL e rotule-a de "Bound 1". Carregue 1 coluna-volume de tampão de eluição na parte superior da coluna. Centrifugar para 10 s a 1.000 x g.

Repita a etapa de eluição mais 2 vezes para garantir a coleta do analito vinculado. Rotule os tubos "Bound 2" e "3". Regisso regissão qualquer alteração de cor ou observações sobre as frações.

Neste exemplo, hemoglobina e citocromo C foram separados. A hemoglobina tem um IPI de 6,8, enquanto o citocromo C tem um iPI de 10,5. No tampão pH 8.1, a hemoglobina é carregada negativamente e não se liga à coluna. Por outro lado, o citocromo C é carregado positivamente no pH 8.1 e se liga à coluna.

A hemoglobina, uma proteína cor-de-marrom, foi encontrada nas frações não ligadas, enquanto o citocromo C, uma proteína de cor avermelhada, foi observado na fração vinculada.

Existem muitas formas de cromatografia líquida, cada uma com habilidades diferentes para separar componentes de uma mistura.

Neste exemplo, a cromatografia da coluna foi usada para separar uma mistura de DNA único e duplo encalhado. Hidroxiapatita, ou HA, é uma forma cristalina de fosfato de cálcio comumente usado como uma fase estacionária devido aos seus íons de cálcio positivamente carregados. Neste caso, a coluna HA foi ideal para a separação do DNA, pois pode se ligar à espinha dorsal negativamente carregada do DNA.

Outra forma de cromatografia de coluna frequentemente usada para separar proteínas é a cromatografia de afinidade metálica imobilizada, ou IMAC. No IMAC, a fase estacionária possui um ligante com um íon metálico, que se liga a uma tag histidina na proteína de interesse.

Todos os outros componentes da mistura saem da coluna. A proteína é então elucidada com uma solução de imidazol, que tem uma estrutura semelhante à histidina, e se liga mais fortemente com o íon metálico.

Uma aplicação comum de cromatografia de coluna é cromatografia líquida de alto desempenho, ou HPLC. O HPLC é amplamente utilizado em química analítica tanto para a identificação quanto separação de compostos biológicos e não biológicos em uma mistura.

O HPLC é semelhante à cromatografia da coluna demonstrada neste vídeo, exceto que é automatizada e operada a pressões muito altas. Isso permite o uso de contas estacionárias menores, com maior relação superfície/volume. Assim, são possíveis interações melhoradas entre a fase estacionária e os componentes da fase móvel.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à cromatografia de troca de íons. Agora você deve entender os conceitos por trás disso, os 4 passos envolvidos, e algumas técnicas relacionadas.

Obrigado por assistir!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A cromatografia de troca de íons é amplamente utilizada na bioquímica para isolar e purificar amostras de proteínas. As proteínas têm muitos aminoácidos com grupos funcionais que são carregados. As proteínas são separadas com base na carga líquida, que depende do pH. Algumas proteínas são mais positivamente carregadas, enquanto outras são mais carregadas negativamente. Além disso, as etiquetas de peptídeos podem ser geneticamente adicionadas a uma proteína para dar-lhe um ponto isoelétrico que não está na gama de proteínas normais, tornando possível separar completamente. A cromatografia de troca de íons é útil para separar complexos proteicos multimédicos, pois diferentes configurações teriam diferentes quantidades de carga e diferentes interações.

Outra grande aplicação da cromatografia de troca de íons é a análise da água. A cromatografia de troca de ânion pode ser usada para medir a concentração de ânions, incluindo sulfatos, nitratos, nitritos, flúor e cloreto. A cromatografia de troca de cá de cáção é usada para medir a concentração de cáções como sódio, potássio, cálcio e magnésio. Um tipo de cromatografia de troca de íons também é usado na purificação da água, pois a maioria dos amaciantes filtram íons de magnésio e cálcio em água dura, vinculando-os a uma resina, que libera sódio vinculado. Metais pesados, como cobre ou chumbo, também podem ser removidos da água usando cromatografia de troca de íons.

A cromatografia de troca de íons também é útil na purificação metálica. Pode ser usado para purificar actanides, como plutônio, e removê-lo de barras de combustível de reator nuclear gastas. Também pode ser usado para recolher urânio e removê-lo da água ou outras amostras ambientais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter