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Cromatografía de intercambio iónico

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Cromatografía de intercambio iónico se utiliza ampliamente en la separación y aislamiento de compuestos cargados, particularmente grandes biomoléculas.

Este tipo de cromatografía líquida utiliza una columna de llenos granos de fase estacionaria, llamado resina. La técnica separa analitos basados en su afinidad con la resina cargada.

Hay dos tipos principales de esta técnica. En cromatografía de intercambio catiónico, resina con carga negativa se utiliza para enlazar analitos cargados positivamente. Del mismo modo, en intercambio, analitos cargados negativamente se unen a resina cargado positivamente. Los compuestos son lavados a través de la columna, y el analito entonces puede ser colectado en un recipiente separado.

Este video se introducen los fundamentos de la cromatografía de intercambio iónico y demostrar la técnica de separación de una mezcla de proteína en el laboratorio.

La fase estacionaria es un componente clave para una exitosa separación. Resinas de intercambio catiónico fuerte normalmente cuentan con fuertes grupos funcionales ácidos, como ácido sulfónico. Resinas de intercambio catiónico débil disponen de grupos débiles, tales como ácidos carboxílicos.

Del mismo modo, resinas de intercambio aniónico fuerte utilizan bases fuertes, como las aminas cuaternarias, mientras que las resinas de intercambio aniónico débil utilizan aminas secundarias o terciarias. La selección de la resina dependerá de las propiedades de la mezcla de muestra y el analito de interés.

Los buffers usados, colectivamente llamados la fase móvil, también son importantes a la separación, particularmente en términos de pH. Para las proteínas, pH se selecciona de acuerdo con su punto isoeléctrico o pI. En un pH igual al pI de la proteína, la proteína es neutral. Sobre pI, tendrá una carga negativa neta, mientras que por debajo de la pI, tendrá una carga positiva neta. El pH del buffer debe seleccionarse para que la proteína está correctamente cargada y capaces de enlazar con la fase estacionaria.

Cromatografía de intercambio iónico es generalmente un proceso de cuatro pasos. En primer lugar, una columna empaquetada con cualquier resina de intercambio aniónico o catiónico es equilibrada mediante buffer. Para columnas de intercambio, esto implica protonating la resina, asegurando que se carga positivamente.

A continuación, la muestra se carga sobre la columna. El buffer debe tener baja conductividad, como especie cargada puede competir con la muestra para las interacciones con la resina. Compuestos de carga opuesta se unen a la resina. Moléculas que no están cargadas, o llevan la misma carga, siguen sin estar consolidadas.

En el tercer paso, la columna se lava con buffer adicional para eliminar los componentes no enlazados de la columna, dejando el límite.

Finalmente, el cuarto paso es la elución del analito límite. Esto se logra utilizando un gradiente de sal, donde se aumenta gradualmente la concentración de sal, o utilizando un tampón de elución sal alta.

Las moléculas débilmente enlazados se eluyó en primer lugar, como la sal baja más fácilmente alterará su vinculación iónica a la resina. Compuestos que más fuertemente se procederá a la elución con altas concentraciones de sal.

Ahora que los fundamentos de la cromatografía de intercambio iónico han sido descritos, permite echar un vistazo a su uso en la separación de dos proteínas.

En primer lugar, para preparar la mezcla de proteína de separación, agregar 0,2 mL de tampón de Unión y de vortex para mezclar bien. Luego, centrifugar la mezcla para eliminar cualquier espuma. Para preparar la columna de intercambio catiónico, sujete verticalmente en un soporte de anillo y deje que la resina resolver.

Abra la tapa superior de la columna y luego la parte inferior. Permitir que el tampón de escurra bajo gravedad en un tubo de abajo.

Para preparar la columna, equilibrar por la carga de un columna-volumen de buffer, en este caso 0,3 mL. Deje que el búfer de gotear de la columna en un frasco de residuos. Después de que ha salido de un columna-volumen de tampón, repita el paso equilibrado.

Para ejecutar el experimento, colocar un tubo de centrífuga de 2 mL con la etiqueta "Sin consolidar 1" debajo de la columna. Cuidadosamente coloque 0.1 mL de la muestra de proteína en la parte superior de la columna.

Una vez que se ha cargado la muestra, lavar con un volumen de columna de búfer y permitir que fluya a través de todo el camino. Repita para un total de 5 lavados. Recoger cada colada en su propio tubo, con la etiqueta "Sin consolidar 1" a "5". Para los últimos 2 lavados, centrifugar la columna de 10 s para asegurarse de que todas las especies salen de la columna. Poner la columna en un tubo de colección de nuevo 2 mL centrífuga y una etiqueta "Bound 1". Carga de columna 1-volumen de tampón de elución en la cima de la columna. Centrifugar durante 10 s a 1.000 x g.

Repita el paso de elución 2 veces más para la colección del analito límite. Etiquetar los tubos "Límite 2" y "3". Registrar cualquier cambio de color u observaciones sobre las fracciones.

En este ejemplo, la hemoglobina y el citocromo C se separaron. Hemoglobina tiene un pI de 6,8, mientras que el citocromo C tiene un pI de 10.5. En el buffer de pH 8.1, la hemoglobina se carga negativamente y no se une a la columna. Por el contrario, el citocromo C está cargado positivamente a pH 8.1 y se une a la columna.

Hemoglobina, una proteína de color pardusca, se encontró en las fracciones no Unidas, mientras que el citocromo C, una proteína de color rojizo, fue observado en la fracción unida.

Hay muchas formas de cromatografía de líquidos, cada uno con diferentes habilidades para separar componentes de una mezcla.

En este ejemplo, cromatografía en columna se utiliza para separar una mezcla de simple y doble trenzado DNA. Hidroxiapatita, o HA, es una forma cristalina de fosfato de calcio se utiliza comúnmente como una fase estacionaria debido a sus iones de calcio cargados positivamente. En este caso, la columna HA era ideal para la separación de ADN como puede enlazar a espina dorsal el ADN cargado negativamente.

Otra forma de cromatografía en columna utilizada con frecuencia para separar las proteínas es la cromatografía de afinidad metálica inmovilizados, o IMAC. En IMAC, la fase estacionaria posee un ligando con un ion de metal, que se une a una etiqueta de histidina en la proteína de interés.

Todos los demás componentes de la mezcla de salida de la columna. La proteína entonces es eluted con una solución de imidazol, que tiene una estructura similar a la histidina y se une más fuertemente con los iones metálicos.

Una aplicación común de cromatografía en columna es cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC. HPLC es ampliamente utilizado en química analítica para la identificación y separación de compuestos biológicos y no biológicos en una mezcla.

HPLC es similar a la cromatografía de columna demostrada en este video, salvo que es automatizado y operado a presiones muy altas. Esto permite el uso de pequeños granos de fase estacionaria, con un mayor área superficial al cociente del volumen. Así, mejora las interacciones entre la fase estacionaria y los componentes en la fase móvil son posibles.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la cromatografía de intercambio iónico. Ahora debe entender los conceptos detrás de él, los 4 pasos y algunas técnicas relacionadas.

¡Gracias por ver!

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