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Fondamenti di allevamento e svezzamento
 
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Fondamenti di allevamento e svezzamento

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

Milioni di topi e ratti vengono allevati per l'uso nella ricerca biomedica ogni anno. In tutto il mondo, ci sono diverse grandi strutture di allevamento commerciale che forniscono topi ai laboratori di ricerca, ma molte strutture scelgono di allevare anche topi e ratti internamente per ridurre i costi e aumentare le opzioni di ricerca. Durante l'allevamento nella struttura animale, i ricercatori sono in grado di manipolare la genetica degli animali, cronodare le gravidanze per soddisfare le esigenze della ricerca e lavorare con embrioni e neonati come richiesto.

Topi e ratti possono essere allevati in una varietà di schemi e metodi. Procedure tecniche, come l'uso della citologia vaginale, la visualizzazione dell'area vaginale e l'osservazione dei tappi copulatori, sono state sviluppate per aiutare con la sincronizzazione dell'allevamento per corrispondere alle esigenze di ricerca. Questo manoscritto è una panoramica dei fondamenti di base dell'allevamento di topi e ratti e delle procedure tecniche utilizzate. Descrizioni più dettagliate dei complessi schemi di allevamento e la descrizione completa dei metodi per la citologia vaginale sono disponibili nell'elenco dei riferimenti.

Principles

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Tipi comuni di ceppi e scorte

Topi e ratti sono comunemente allevati come ceppi di razza, ceppi inbred e ceppi ibridi. Gli animali di razza hanno caratteristiche simili, ma non sono identici geneticamente. Sono allevati casualmente per mantenere l'eterozigosi o la varianza genetica. Al contrario, gli animali consanguinei sono stati incrociati con almeno 20 generazioni di accoppiamento fratello-sorella o genitore-prole e sono geneticamente omozigoti. Infine, gli animali ibridi sono la progenie dell'accoppiamento di due ceppi inbred.

Fattori che influenzano il comportamento riproduttivo

Ci sono molti fattori che possono influenzare le prestazioni riproduttive di topi e ratti. Il vigore delle allevatrici femminili dipende in gran parte dal livello di consanguineità. Gli animali che sono allevati sono molto più resistenti e vigorosi, quindi producono cucciolate più grandi e più forti. Alcuni ceppi comunemente usati, come il topo C57BL/6, mostrano comportamenti aggressivi che possono interferire con la riproduzione. Quando si alleva un ceppo aggressivo, tutte le cucciolate dovrebbero essere attentamente osservate. Gli animali di una cucciolata contenente cuccioli aggressivi non dovrebbero essere usati per l'allevamento. Le fluttuazioni di temperatura, umidità e illuminazione possono causare diminuzioni dell'efficienza riproduttiva. Anche il rumore e le vibrazioni all'interno delle sale di riproduzione hanno dimostrato di causare effetti deleteri. Il controllo di queste variabili all'interno dell'impianto di allevamento ridurrà al minimo alcuni effetti. 1 Gli animali con modificazioni genetiche tendono ad essere meno resistenti e fertili e alcune mutazioni possono provocare la letalità dei cuccioli prima o subito dopo la nascita.

Schemi di riproduzione

Gli schemi di riproduzione sono simili per topi e ratti. I sistemi comunemente usati sono l'accoppiamento monogamo di una femmina allevata a un maschio o l'accoppiamento poligamo di due o più femmine allevate a un maschio. Sia il topo femmina che il ratto sono poliestrosi e subiscono un estro postpartum circa 20-24 ore dopo il parto. Durante l'estro postpartum, la femmina può concepire una cucciolata. Per i ceppi di topi o ratti che hanno una breve durata di vita riproduttiva a causa di una mutazione genetica, è comune lasciare il maschio nella gabbia con la femmina in modo che possa immediatamente concepire un'altra cucciolata. Questo schema di allevamento intensivo può essere stressante per la femmina, poiché allatta e gezza continuamente. Uno schema non ad alta sensibilità comporta la separazione della femmina una volta che è visibilmente incinta; non viene restituita alla gabbia del maschio fino a quando la sua cucciolata non è stata svezzata. Questo sistema è molto meno esigente per la femmina.

Allevamento a fini di manipolazione genetica

Gli animali geneticamente modificati (TA) sono animali knockout che hanno avuto geni rimossi dal loro genoma o animali transgenici che hanno avuto geni di una specie diversa aggiunti nel loro genoma. I TA vengono quindi allevati come ceppo inbred e sono spesso allevati con altri GEA per creare un animale complesso e geneticamente manipolato per progetti di ricerca molto specifici. Schemi di allevamento complessi vengono utilizzati per creare ceppi con alcuni geni rimossi e altri aggiunti. Modelli animali per molti disturbi correlati ai geni - inclusi, ma non limitati a, morbo di Alzheimer, cancro, ictus e altri disturbi del sangue, diabete e pigmentos retinico - sono stati sviluppati attraverso l'ingegneria genetica degli animali.

La maggior parte degli schemi di allevamento può fare affidamento sulla genetica mendeliana per fare previsioni sui rapporti di genotipo. Quando un topo wildtype viene allevato con un topo con un gene modificato (un eterozigote), i risultati attesi sarebbero il 50% di animali wildtype e il 50% di eterozigoti. Un topo wildtype incrociato con un topo con due geni modificati (un omozigote) farà in modo che tutta la prole sia eterozigote. Quando si incrociano due animali eterozigoti, tutti e tre i genotipi dovrebbero essere presenti nelle seguenti percentuali: 25% wildtype, 50% eterozigoti e 25% omozigoti. È da queste aspettative che possono essere rilevati geni letali embrionali(cioè,se non viene prodotta prole omozigote).

Figure 1
Figura 1. Possibili accoppiamenti e risultati basati sulla genetica mendeliana. Gli animali selvatici non sono geneticamente modificati e sono designati come (+/+). Gli animali eterozigoti hanno una copia di un gene modificato e sono designati come (-/+); gli animali omozigoti hanno entrambe le copie di un gene modificato e sono designati come (-/-).

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Procedure

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1. Le informazioni necessarie per l'accoppiamento degli animali includono il ceppo /stock dell'animale che utilizza la nomenclatura corretta, le date di nascita per il maschio e la femmina dell'allevatore e la data di installazione. Una registrazione accurata è imperativa con le colonie riproduttive.

2. La determinazione del sesso di topi e ratti viene effettuata confrontando le distanze anogenitali. Nelle femmine, la distanza tra l'ano e i genitali esterni è più breve di quanto non sia per i maschi. La presenza di un sacco scrotale negli animali maschi è un altro indicatore sessuale.

3. Selezione e impostazione dello schema di accoppiamento

NOTA: è possibile utilizzare due schemi di accoppiamento.

  1. Accoppiamento temporizzate proestro/estro: questo metodo si basa sull'accoppiamento delle femmine con i maschi nel punto di massima ricettività e fertilità.
    1. Il ciclo estrale deve essere monitorato nelle femmine sia mediante esame visivo dei genitali esterni per i cambiamenti indicativi di proestro ed estro, sia mediante citologia delle secrezioni vaginali (vedi sotto).
    2. Quando una femmina è determinata ad essere in estro o estro, è accoppiata con un maschio alla fine della giornata, poiché gli animali generalmente si accoppiano di notte.
    3. La mattina seguente, la femmina viene esaminata per un tappo copulatorio (vedi sotto). Se non è presente alcuna spina, la femmina può rimanere con il maschio durante il giorno e controllata per una spina copulatoria alla fine della giornata. In alternativa, se si determina che non è più in estro o estro, viene rimossa dalla gabbia di riproduzione.
  2. Accoppiamento casuale a tempo: questo metodo si basa sul fatto che il ciclo estrale dei roditori è molto breve, lungo 4-5 giorni.
    1. Per questo metodo, gli accoppiamenti possono essere impostati in qualsiasi momento e le femmine vengono quindi controllate per i tappi copulatori ogni mattina e sera fino a quando non viene osservata una spina.
    2. Una femmina è accoppiata con un maschio la sera.
    3. Viene controllata per una spina copulatoria all'inizio e alla fine di ogni giorno fino a quando non viene osservata una spina. Di solito ci vogliono 3 o più giorni per vedere una spina quando si utilizza questo metodo.

4. Prevedere la gravidanza

Poiché la palpazione dei cuccioli è difficile fino a più tardi durante la gravidanza, intorno al giorno 10-12, sono stati sviluppati sistemi ad ultrasuoni commerciali per roditori; tuttavia, poche strutture di ricerca sugli animali hanno questa tecnologia. Pertanto, la visualizzazione di tappi copulatori, l'osservazione dei cambiamenti vaginali o la citologia vaginale sono comunemente usati per aiutare con la previsione di quando una femmina ha concepito una cucciolata (vedi sotto). Tuttavia, nessuno di questi metodi è in grado di confermare la gravidanza. Una volta osservato un tappo copulatorio, la femmina deve essere monitorata per segni di gravidanza, come l'aumento di peso.

5. Determinazione dello stadio del ciclo estrale

  1. Ispezione visiva
    NOTA: Per l'accoppiamento a tempo di topi e ratti, l'osservazione visiva della vagina per i cambiamenti indicativi di proestro ed estro è il metodo più rapido per determinare la fase del ciclo estrale e non richiede attrezzature speciali.
    1. Quando si valuta il ciclo estrale utilizzando il metodo visivo, è importante eseguire l'ispezione visiva nella stessa area rispetto all'illuminazione della stanza, poiché la fonte di luce può cambiare il colore percepito dei tessuti vaginali e rendere difficile la valutazione. Ad esempio, la tonalità viola proiettata dalle luci a LED rende più difficile il rilevamento visivo.
    2. Per valutare lo stadio del ciclo estrale mediante osservazione visiva, ogni topo deve essere trattenuto manualmente dalla coda, con le zampe posteriori appoggiate su un coperchio della gabbia.
    3. L'apertura vaginale di ogni femmina viene valutata in base alle condizioni del tessuto che circonda l'area vaginale e alle dimensioni dell'apertura vaginale. 2
      1. Durante il proestro, l'apertura vaginale è ampia ed è caratterizzata da gonfiore del tessuto circostante. Il tessuto è di colore rosa e molto umido. Spesso ci sono rughe o striature lungo i bordi dorsale e ventrale dell'apertura.
      2. Durante l'estro, il gonfiore dei tessuti che circondano l'apertura vaginale è ridotto e i tessuti non sono così umidi e rosa.
      3. Durante il metestro l'apertura vaginale è minima e c'è un gonfiore trascurabile.
      4. Durante il diestro, non c'è gonfiore dei tessuti intorno all'area vaginale e l'apertura vaginale è piccola e chiusa.
  2. Citologia vaginale
    Poiché sia i topi che i ratti sono poliestri, la durata del ciclo di estro è molto breve, che va da 4-5 giorni. A volte è necessario identificare tutti e quattro gli stadi dell'estro: proestro, estro, metestro e diestro. La citologia vaginale è un metodo molto accurato per determinare queste fasi. Esistono anche due metodi di raccolta del campione: il metodo non invasivo della lavanda vaginale e il metodo invasivo del tampone vaginale del canale.
    1. Lavanda vaginale
      1. I materiali necessari sono punte sterili per pipette da 200 μl, bulbi in lattice, acqua sterile a doppio distillato (ddH20) e vetrini puliti.
      2. Posizionare un bulbo di lattice all'estremità di una punta sterile da 200 μl. Aspirare circa 100 μl di ddH2O sterile nella pipetta.
      3. Solleva il topo dalla gabbia e mettilo sulla parte superiore della gabbia della barra di filo con la coda verso di te.
      4. Afferrare saldamente la coda ed elevare i quarti posteriori del topo. Il mouse avrà ora solo le zampe anteriori che afferrano il coperchio.
      5. Se il topo urina, attendere che la minzione si fermi. Se dovesse essere lasciata urina all'ingresso del canale vaginale, l'apertura può essere risciacquata con un piccolo spruzzo di ddH2O. Cambia la punta che è stata utilizzata per il risciacquo.
      6. Posizionare l'estremità della punta riempita di ddH2O all'apertura del canale vaginale senza penetrare nell'orifizio.
      7. Premere delicatamente il bulbo per espellere da un quarto a metà del volume d'acqua (~ 25-50 μl) all'apertura del canale vaginale. Il liquido aspira spontaneamente nel canale senza inserimento della punta. Rilasciare lentamente la pressione esercitata sulla lampadina. Il fluido si ritirerà di nuovo nella punta.
      8. Evitare di rilasciare la pressione troppo rapidamente per impedire l'aspirazione del fluido nella lampadina. Un suggerimento filtrato può essere utile per questo scopo.
      9. Ripetere il passaggio precedente 4-5 volte utilizzando la stessa punta, bulbo e fluido per ottenere un numero sufficiente di cellule in un singolo campione.
      10. Posizionare il fluido su un vetrino e lasciare asciugare completamente lo striscio a temperatura ambiente.
      11. Utilizzare una nuova pipetta per ogni mouse.
      12. Una volta asciutti, questi strisci estrali possono essere macchiati immediatamente o conservati e macchiati in un secondo momento. La colorazione Wright-Giemsa è più comunemente usata per macchiare le diapositive. Questa macchia è disponibile in commercio come una macchia in un solo passaggio che non richiede la fissazione del vetrino per evitare che le cellule si lavano durante il processo di colorazione. La diapositiva viene posizionata nella macchia per 45-60 secondi, secondo le istruzioni del produttore.
      13. I vetrini vengono poi esaminati al microscopio, e le cellule viste corrispondono allo stadio del ciclo: 1) se la femmina è in proestro, le cellule sono viste come gruppi di cellule epiteliali nucleate rotonde e ben formate con un nucleo che si colora più scuro del citoplasma; 2) se la femmina è in estro, la maggior parte delle cellule sono cellule epiteliali squamose cornificate che mancano di un nucleo, sono di aspetto angolare e si presentano in gruppi densamente imballati; 3) se la femmina è in metestro, le cellule sono tipicamente globuli bianchi (in particolare neutrofili con alcune cellule epiteliali squamose cornificate presenti) con nuclei macchiati di scuro che hanno la forma di due salsicce collegate tra loro; 4) durante il diestro, le cellule presenti sono normalmente globuli bianchi con la presenza di poche cellule epiteliali nucleate.
    2. Tamponi vaginali
      1. I materiali necessari sono applicatori sterili con punta in cotone con punta di 2 mm di diametro, vetrini per microscopi in vetro pulito e soluzione fisiologica sterile.
      2. Bagnare un applicatore con punta di cotone con soluzione salina.
      3. Inserire la punta dell'applicatore nella vagina del mouse trattenuto.
      4. Girare delicatamente e rotolare la punta contro la parete vaginale. Rimuovere con attenzione il tampone.
      5. Le cellule vengono trasferite in un vetrino asciutto facendo rotolare il tampone attraverso il vetrino.
      6. Una volta che la diapositiva è asciutta, può essere macchiata con la macchia Wright-Giemsa.
        Il tampone è considerato una procedura stressante e, quando sono stressati, i topi possono avere cicli estrali interrotti. La stimolazione vaginale e cervicale causata dal tampone può indurre pseudogravidanza. Tamponi ripetuti della mucosa vaginale possono causare danni se non eseguiti delicatamente, con la dovuta moderazione e con i tamponi di cotone di dimensioni corrette. 3,4

Figure 2
Figura 2. Citologia vaginale - diverse fasi del ciclo dell'estro del roditore

6. Visualizzazione di una spina copulatoria

Questo tappo è costituito da liquido vaginale e sperma e persiste nella vagina per 12-24 ore di postcopulazione. La presenza della spina conferma l'accoppiamento, ma non garantisce che la femmina sia incinta. Se la femmina collegata è incinta, il primo giorno di gestazione è considerato il giorno dopo la scoperta della spina.

  1. Solleva il topo dalla gabbia e posizionalo sulla parte superiore della gabbia della barra metallica con la coda verso di te.
  2. Posizionare il mouse applicando una pressione appena sopra la coda per inarcare la schiena per consentire una migliore presentazione dell'apertura vaginale.
  3. Osserva la sua apertura vaginale per una massa biancastra. La spina copulatoria potrebbe non essere visivamente evidente, ma può essere confermata con l'uso di una sonda smussata.
  4. Utilizzando la punta della sonda, inserirla delicatamente nell'apertura vaginale. La presenza di un tappo copulatorio impedirà l'avanzamento della sonda entro 0,5 cm dall'apertura vaginale.
  5. La sonda deve essere disinfettata con alcool e asciugata completamente prima di ogni utilizzo.

Poiché la femmina ha cucciolate, la data di nascita, le dimensioni della cucciolata, il numero di nati, il numero di svezzati, il rapporto tra cuccioli maschi e femmine e il rapporto tra genotipi dovrebbero essere tutti registrati. Se i genotipi all'interno di una cucciolata non corrispondono ai genotipi dei genitori, è necessario ripetere il test per verificare il vero genotipo.

7. Svezzamento

La gestazione per topi e ratti è di circa 21 giorni. I giovani vengono svezzati a 21-28 giorni di età. Sia i topi che i ratti possono riprodursi già a 8 settimane di età, quindi è imperativo che i cuccioli siano separati per sesso in tenera età. L'allevamento intensivo richiede che i cuccioli di ogni cucciolata siano svezzati al giorno 20 per evitare che i cuccioli più grandi siano presenti quando nasce la cucciolata successiva. Per l'allevamento non adintensivo, i cuccioli possono essere lasciati con la madre oltre i 20 giorni di età, spesso fino a 28 giorni di età. Questo può essere molto utile per molti ceppi geneticamente modificati, in quanto i cuccioli potrebbero non essere vigorosi come gli animali non ingegneri o selvatici.

I cuccioli maschi e femmine sono separati allo svezzamento. Quando possibile, i cuccioli appena svezzati non dovrebbero essere alloggiati da solo. Se una cucciolata contiene solo un cucciolo di un dato sesso, si dovrebbe tentare di ospitare questo cucciolo con altri dello stesso sesso. Le possibili opzioni di alloggio sono: 1) un singolo cucciolo femmina può rimanere con la madre se non in una gabbia di riproduzione intensiva; 2) un singolo cucciolo femmina o maschio può essere collocato con altri cuccioli dello stesso sesso di una cucciolata diversa della stessa età; 3) se i genitori sono una coppia monogama, la femmina può essere rimossa dalla gabbia per permettere ad un singolo cucciolo maschio di essere alloggiato con il padre; e 4) un singolo cucciolo maschio può essere ospitato con fratelli femmine fino a 5 settimane di età. Il sesso dei cuccioli dovrebbe essere verificato una settimana dopo lo svezzamento per prevenire cucciolate indesiderate da cuccioli impropriamente segregati.

Topi e ratti svezzati dovrebbero essere controllati quotidianamente per assicurarsi che stiano prosperando. Sebbene la Guida per la cura e l'uso degli animalida laboratorio5 affermi che il cibo deve essere presentato agli animali in modo tale da evitare che venga sporcato da feci e urina, ai topi appena svezzati dovrebbe essere fornita una piccola quantità di cibo (un pellet per topo) posto in una capsula di vetro (capsula di Petri) sul pavimento della gabbia. Ciò incoraggerà gli animali a passare ad avere il chow dei roditori come unica fonte di cibo. Anche per gli animali che sono alloggiati su rack che forniscono acqua alle gabbie attraverso un sistema di irrigazione automatico, una bottiglia d'acqua può essere aggiunta alla gabbia se i topi sembrano essere disidratati.

Nome Tipo di colonia Descrizione
ICR · Allevato Albino
Svizzera-Webster Allevato Albino
Balb/c Innato Albino
FVB · Innato Albino
C57BL/6 · Innato Colore del mantello nero
C3H Innato Colore del mantello marrone
DBA/2 Innato Colore mantello marrone/grigio
Nudi atimici (nu/nu) Innato Glabro
SCID Innato Topi immunodefici combinati gravi - vari colori del mantello

Tabella 1. Macchie e scorte di topo comunemente usate.

Nome Tipo di colonia Descrizione
Sprague-Dawley Allevato Albino
Wistar · Allevato Albino
Fisher 344 · Innato Albino
Lewis Innato Albino
Lungo Evans Innato Incappucciato, bianco e nero

Tabella 2. Ceppi e scorte di ratto comunemente usati.

Milioni di topi e ratti vengono allevati per l'uso nella ricerca biomedica ogni anno e molte istituzioni scelgono questo in-house per ridurre i costi e aumentare le opzioni di ricerca. I vantaggi dell'allevamento interno sono: 1) i ricercatori sono in grado di manipolare la genetica degli animali attraverso l'allevamento selettivo 2) possono programmare le gravidanze per soddisfare le esigenze di ricerca e 3) possono lavorare con embrioni e neonati se necessario. Tuttavia, per impostare uno schema di allevamento di successo, si dovrebbe capire il ciclo estrale del roditore. Inoltre, dovrebbero avere conoscenza dei diversi schemi di accoppiamento, dei fattori che influenzano il comportamento di allevamento dei roditori e delle considerazioni sullo svezzamento ... tutto ciò sarà discusso in questo video di presentazione.

Iniziamo con la revisione del ciclo estrale del roditore. Sia i ratti femmina che i topi sono poliestri, il che significa che hanno più di un ciclo di estro in un anno o in una stagione riproduttiva. Ogni ciclo dura 4-5 giorni e può essere suddiviso in 4 fasi: metestro, diestro, proestro ed estro. L'estro è la fase ovulatoria, il che significa che se la femmina è nella fase del proestro o dell'estro, è pronta a concepire.

Un modo per determinare la fase del ciclo estrale è l'esame visivo. Trattenere manualmente l'animale per la coda e con le zampe anteriori appoggiate su un coperchio della gabbia e ispezionare attentamente le dimensioni dell'apertura vaginale e del tessuto circostante. Durante la fase del proestro, l'apertura vaginale è ampia ed è caratterizzata da gonfiore del tessuto circostante, che è di colore rosa e molto umido. Spesso ci sono rughe o striature lungo i bordi dorsale e ventrale dell'apertura. Durante l'estro, il gonfiore che circonda l'apertura vaginale è ridotto e i tessuti non sono così umidi e rosa. Durante il metestro, l'apertura vaginale è minima e c'è un gonfiore trascurabile. Durante il diestro, non c'è gonfiore dei tessuti intorno all'area vaginale e l'apertura è piccola o chiusa.

Un altro approccio più accurato per determinare lo stadio del ciclo estrale è la citologia vaginale per la quale i campioni cellulari vengono raccolti mediante lavaggio o tampone. Per il lavaggio, posizionare un bulbo di lattice all'estremità di una punta sterile da 200 microlitri e aspirare circa 100 microlitri di acqua sterile a doppio distillato nella pipetta. Quindi, solleva il topo dalla gabbia e posizionalo sulla parte superiore della gabbia della barra di filo con la coda verso di te. Afferrare saldamente la coda ed elevare i quarti posteriori del topo in modo tale che solo le zampe anteriori stiano afferrando il coperchio. Posizionare l'estremità della punta riempita all'apertura del canale vaginale senza penetrare nell'orifizio. Premere delicatamente il bulbo per espellere circa 25-50 microlitri d'acqua all'apertura vaginale. Il liquido aspira spontaneamente nel canale senza inserimento della punta. Rilasciare lentamente la pressione esercitata sulla lampadina e il fluido si ritirerà di nuovo nella punta. Ripeti 4-5 volte usando la stessa punta, bulbo e fluido per ottenere un numero sufficiente di cellule in un singolo campione. Posizionare il fluido su un vetrino e lasciare asciugare completamente lo striscio a temperatura ambiente. Una volta asciutti, questi strisci estrali possono essere conservati per un uso successivo, oppure possono essere macchiati immediatamente utilizzando la macchia Wright-Giemsa, che è una macchia a un passo e non richiede fissazione. La diapositiva viene posizionata nella macchia per 45-60 secondi.

D'altra parte, per il tampone, bagnare un applicatore con punta di cotone da 2 mm con soluzione salina. Inserire la punta dell'applicatore nella vagina del topo trattenuto e girare delicatamente e rotolare la punta contro la parete vaginale. Quindi rimuovere il tampone con attenzione e trasferire le cellule su un vetrino asciutto facendo rotolare il tampone sul vetrino. Questa procedura è considerata stressante e può causare danni se non eseguita delicatamente, con la dovuta moderazione e con i tamponi di cotone di dimensioni corrette. Come il lavaggio, una volta che lo scivolo è asciutto, può essere macchiato con la macchia wright-giemsa. Dopo la colorazione, i vetrini possono essere esaminati al microscopio.

Se la femmina è in proestro, le cellule sono viste come gruppi di cellule epiteliali rotonde, ben formate, nucleate con un nucleo che si macchia più scuro del citoplasma. Se è in fase di estro, la maggior parte delle cellule sono cellule epiteliali squamose cornificate che mancano di un nucleo. Sono di aspetto angolare e sono in gruppi densamente imballati. Se la femmina è in metestro, le cellule sono tipicamente globuli bianchi, in particolare neutrofili, con alcune cellule epiteliali squamose cornificate presenti. Durante il diestro, le cellule presenti sono normalmente globuli bianchi con la presenza di alcune cellule epiteliali nucleate.

Ora che hai una comprensione del ciclo estrale del roditore, discutiamo come impostare l'accoppiamento. Il primo passo è la determinazione del sesso, che viene effettuata confrontando le distanze anogenitali. Nelle femmine, la distanza tra l'ano e i genitali esterni è più breve di quanto non sia per i maschi. Sulla base delle esigenze di ricerca e dell'efficienza riproduttiva del ceppo, lo schema di accoppiamento può essere monogamo - dove una femmina viene allevata a un maschio O poligama - dove due o più femmine sono allevate a un maschio.

In termini di tempistica, dato che il ciclo estrale del roditore è breve - solo 4-5 giorni - si può impostare l'accoppiamento in modo casuale. Oppure possono impostare un "accoppiamento a tempo", che comporta l'introduzione della femmina nella gabbia di accoppiamento quando si trova nel punto di massima ricettività e fertilità, cioè durante il proestro o la fase di estro. In entrambi i casi, l'accoppiamento dovrebbe essere impostato alla fine di una giornata, poiché i roditori sono notturni e tendono ad accoppiarsi di notte. La mattina seguente, la femmina viene esaminata per un tappo copulatorio - una massa biancastra costituita da liquido vaginale e sperma che persiste per 12-24 ore dopo l'copulazione. Se il tappo copulatorio non è visivamente evidente, inserire delicatamente la punta di una sonda smussata nell'apertura vaginale. La presenza di un tappo copulatorio impedirà l'avanzamento della sonda entro 0,5 cm dall'apertura vaginale. In caso di accoppiamento casuale, l'aspetto copulatorio della spina richiede comunemente tre giorni. La presenza di una spina conferma che l'accoppiamento non garantisce che la femmina sia incinta.

Una volta osservato un tappo copulatorio, la femmina deve essere monitorata per segni di gravidanza come l'aumento di peso. Se la femmina collegata è incinta, il giorno in cui è stata trovata la spina è il giorno embrionale zero o E0 e il giorno successivo è considerato come il primo giorno di gestazione, o E1, e così via fino al parto - che sta dando alla luce - che è tra 19 e 21 giorni. Circa 20-24 ore dopo il parto, sia i ratti femmina che i topi subiscono un estro e possono concepire di nuovo.

In uno schema di allevamento intensivo, che è comunemente usato per gli animali con una breve durata della vita riproduttiva a causa di una mutazione genetica, gli animali maschi vengono lasciati nella gabbia con la femmina e i cuccioli, in modo che la femmina possa concepire immediatamente un'altra cucciolata. Questo schema può essere stressante per la femmina in quanto allatta e gesta continuamente. Al contrario, lo schema di allevamento non intensivo prevede la separazione della femmina una volta che è visibilmente incinta e non riportarla nella gabbia del maschio fino a quando la sua cucciolata non è stata svezzata, rendendo questo schema di allevamento meno impegnativo.

Ci sono molti fattori che possono influenzare le prestazioni riproduttive di topi e ratti. Esaminiamo alcuni di essi, che vengono fuori più frequentemente. Il vigore delle allevatrici femminili dipende in gran parte dal livello di consanguineità. Gli animali che sono allevati sono molto più resistenti e vigorosi, quindi producono cucciolate più grandi e più forti. Un altro fattore che può influenzare le prestazioni riproduttive è il comportamento aggressivo. Alcuni ceppi comunemente usati, come i topi C57BL / 6, hanno la tendenza a mostrare aggressività, che può interferire con la riproduzione. Quando si alleva un ceppo aggressivo, tutte le cucciolate dovrebbero essere attentamente osservate. Gli animali di una cucciolata contenente cuccioli aggressivi non dovrebbero essere usati per l'allevamento. Le fluttuazioni di temperatura, umidità e illuminazione possono causare diminuzioni dell'efficienza riproduttiva. Anche il rumore e le vibrazioni all'interno delle sale di riproduzione hanno dimostrato di causare effetti deleteri. Gli animali con modificazioni genetiche tendono ad essere meno resistenti e fertili, e alcune delle mutazioni possono causare letalità dei cuccioli prima o subito dopo la nascita.

Ora esaminiamo brevemente come svezzare i cuccioli di questi animali da laboratorio. Il tempo per iniziare lo svezzamento differisce con lo schema di allevamento. In caso di allevamento non intensivo, i giovani possono essere svezzati a 21-28 giorni di età. Ma in caso di allevamento intensivo, i cuccioli di ogni cucciolata vengono svezzati al giorno 20 per evitare che i cuccioli più grandi siano presenti quando nasce la cucciolata successiva. Poiché i roditori possono iniziare l'accoppiamento a partire da 8 settimane, i cuccioli maschi e femmine vengono separati allo svezzamento. Quando possibile, i cuccioli appena svezzati non dovrebbero essere alloggiati da solo.

Se una cucciolata contiene un solo cucciolo di un dato sesso, si dovrebbe tentare di ospitare questo cucciolo con cuccioli dello stesso sesso di un'altra cucciolata. Le possibili opzioni di alloggiamento per lo svezzamento dei cuccioli sono elencate nel manoscritto qui sotto. Topi e ratti svezzati dovrebbero essere controllati quotidianamente per assicurarsi che stiano prosperando. Per l'approvvigionamento alimentare, una piccola quantità di cibo, un pellet per topo, deve essere posizionata sul pavimento della gabbia per i primi 7-10 giorni, con cibo aggiuntivo nella parte superiore della gabbia. Ciò incoraggerà gli animali a passare ad avere il chow dei roditori come unica fonte di cibo. Per l'approvvigionamento idrico, è necessario aggiungere una bottiglia anche se gli animali sono alloggiati su rack con sistema di irrigazione automatico. Questo per prevenire la disidratazione.

Infine, vediamo come gli scienziati stanno usando l'approccio di allevamento interno a loro vantaggio. Una delle applicazioni più comuni dell'impostazione dell'accoppiamento è quella di sviluppare topi con genotipo alterato. Per studiare la funzione di un gene, i ricercatori spesso interrompono il suo codice genetico. Tuttavia, questi animali come gli esseri umani sono diploidi e quindi hanno due copie dello stesso gene. Pertanto, al fine di interrompere completamente il gene, i topi alterati devono essere allevati per produrre un animale con entrambe le copie disfunzionali, in altre parole un knockout omozigote. I topi con una copia disfunzionale sono chiamati eterozigoti o hets.

L'altro vantaggio di impostare l'accoppiamento interno è testare l'effetto dell'esposizione prenatale ai composti in esame. Ad esempio, qui i ricercatori hanno fornito alla donna incinta una dieta liquida contenente alcol da E7 a E13. Poi su E13, hanno sezionato la femmina incinta, ottenuto cervelli fetali e li hanno tagliati in sezioni sottili. Infine, la colorazione dei vetrini ha rivelato che l'esposizione prenatale all'alcol ha aumentato la morte cellulare nel tessuto neurale.

Infine, l'allevamento interno consente anche lo studio dei disturbi post gravidanza come la depressione postpartum. In questo studio, gli scienziati hanno prima spostato la lettiera lontano dalla diga durante il periodo di allattamento. Poi, 60 minuti dopo, ha reintrodotto i cuccioli nella diga. E per indurre stress nella femmina, ha aggiunto un nuovo intruso maschio alla gabbia. Quindi, i ricercatori hanno osservato la diga per l'aggressività materna, che include l'attacco e il morso del maschio intruso, nonché per diversi comportamenti di cura materna come la toelettatura dei cuccioli e l'allattamento. I dati ottenuti hanno rivelato che lo stress ha un effetto significativo sia sull'aggressività materna postpartum che sulla cura.

Hai appena visto il video di JoVE sui fondamenti dell'allevamento e dello svezzamento di topi e ratti in laboratorio. Ora dovresti avere una migliore comprensione del ciclo dell'estro dei roditori e anche sapere come determinare la fase del ciclo e come usarla per impostare schemi di accoppiamento di successo. Abbiamo anche esaminato i fattori che possono influenzare il comportamento riproduttivo e spiegato come e quando svezzare topi e cuccioli di ratto. Come sempre, grazie per aver guardato!

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Le colonie riproduttive interne offrono flessibilità alla ricerca, in particolare con progetti che utilizzano embrioni o neonati. Utilizzando tecniche come l'accoppiamento a tempo con tappi copulatori e la citologia vaginale, la data del concepimento e la gestazione possono essere previste con maggiore precisione. Ciò consente ai ricercatori di pianificare più attentamente i loro esperimenti. Il controllo di fattori ambientali come cicli di luce, temperatura, umidità e vibrazioni ottimizzerà i risultati dell'allevamento.

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References

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