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Necroscopia diagnostica e prelievo di tessuti
 
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Necroscopia diagnostica e prelievo di tessuti

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

Molti esperimenti sugli animali si basano su punti temporali di raccolta dei dati finali che vengono raccolti dal prelievo e dal test di organi e tessuti. L'uso di metodi appropriati per la raccolta di organi e tessuti può influire sulla qualità dei campioni e sull'analisi dei dati raccolti per il test dei tessuti. Il metodo di eutanasia dell'animale può anche influire sulla qualità dei campioni. Questo manoscritto delineerà le tecniche di necropsia appropriate per i ratti.

Principles

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Il metodo di eutanasia più comunemente usato per topi e ratti è un sovradosaggio di anidride carbonica (CO2)gassoso. In conformità con l'American Veterinary Medical Association (AVMA), l'uso di CO2 è accettabile con condizioni che riducono al minimo l'avversione e l'angoscia. 1 Gli animali vengono lasciati nella loro gabbia domestica, che viene collocata in una camera. La CO2 viene gradualmente introdotta nella camera ad un tasso di spostamento dal 10% al 30% del volume della camera / min, il che fa perdere conoscenza agli animali prima della percezione del dolore associata all'attivazione del nocicettore da parte dell'acido carbonico. Il flusso viene quindi mantenuto nella camera una volta che si è verificato l'arresto respiratorio per garantire che l'animale sia morto. Un sovradosaggio di un'anestesia inalante è anche accettabile, specialmente per i progetti che richiedono l'uso di tessuto polmonare, poiché la CO2 causa danni al tessuto polmonare. Il dissanguamento dell'animale può anche essere richiesto per alcuni esperimenti per ridurre il volume di sangue nei tessuti.

La registrazione accurata di tutti i risultati è essenziale durante un'autopsia. Dovrebbe essere avviato un modulo che registri una storia completa dell'animale, compresa l'identificazione dell'animale, il sesso, le condizioni di stabulazione, la data di nascita, la data di morte, il numero di studio / numero di protocollo e il nome del ricercatore principale. Un esame interno grossolano viene condotto quando le cavità del corpo sono esposte per rivelare gli organi interni. Eventuali anomalie evidenti dovrebbero essere notate. 2

L'autopsia e la raccolta dei tessuti devono essere avviate immediatamente dopo l'eutanasia dell'animale, poiché la fuoriuscita batterica dal tratto intestinale può confondere alcuni test. Gli organi interni devono essere osservati a partire dalla cavità addominale e spostandosi nella cavità toracica. Prima di rimuovere qualsiasi campione di tessuto, è importante osservare gli organi in situ. 2 Il prelievo di organi e tessuti per l'esame istologico richiede che i tessuti siano adeguatamente preparati. I campioni di tessuto per l'istologia devono avere uno spessore di 0,5-1 cm per consentire una penetrazione sufficiente della soluzione fissativa. La fissazione preserva i tessuti biologici prevenendo il decadimento, l'autolisi e la putrefazione. Arresta inoltre qualsiasi reazione biochimica in corso e può aumentare la resistenza meccanica o la stabilità dei tessuti trattati. L'obiettivo generale della fissazione dei tessuti è quello di preservare le cellule e i componenti tissutali per consentire la preparazione di sezioni sottili e macchiate. Se non diversamente specificato, il fissativo più comunemente usato è il 10% di formalina con buffer neutro. La formalina con buffer neutro al 10% pronta all'uso è disponibile in commercio presso i principali fornitori. 3

Figure 1
Figura 1. Organi addominali e toracici di un ratto femmina.

Figure 2
Figura 2. Organi addominali e toracici di un ratto maschio.

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Procedure

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1. Esame esterno

Un esame esterno grossolano del corpo, che include l'ispezione visiva del corpo per lesioni e masse, dovrebbe essere eseguito come fase iniziale di un'autopsia. Il pelo deve essere esaminato per le aree di perdita di capelli. I denti e le unghie vengono valutati per una crescita o un'usura eccessiva. Qualsiasi colorazione della pelliccia alla bocca, alle narici, agli occhi, alle aperture anali e genitali dovrebbe essere notata. I test del nastro, il raschiamento della pelle e gli esami delle pelli devono essere eseguiti per rilevare i parassiti esterni (vedere le procedure di seguito).

  1. Test su nastro
    1. L'attrezzatura necessaria per un test su nastro include guanti, una striscia di nastro di cellophane trasparente, un vetrino per microscopio e forbici.
    2. I guanti sono sempre indossati quando si maneggia il nastro, poiché l'adesivo solleva oli e cellule della pelle dalle dita, oscurando i risultati o causando confusione durante la valutazione del vetrino.
    3. Tagliare un pezzo di nastro leggermente più stretto della larghezza e più corto della lunghezza del vetrino del microscopio.
    4. Premere con attenzione il lato appiccicoso del nastro sull'ano e sull'area circostante e rimuoverlo rapidamente.
    5. Usando l'estremità opposta del nastro, premerlo tra le scapole e rimuoverlo rapidamente.
    6. Applicare il nastro sul vetrino del microscopio.
    7. Il test su nastro è pronto per l'esame microscopico. Le uova di parassiti sono visibili con ingrandimento 4X, ma dovrebbero poi essere esaminate con ingrandimento 10X per identificare correttamente la specie.
    8. È importante evitare di toccare il lato adesivo del nastro. Il nastro solleverà i detriti dalle mani guantate e renderà difficile la lettura della diapositiva.
  2. Raschiatura della pelle
    1. Il test di raschiatura cutanea viene eseguito su qualsiasi area di alopecia, lesioni cutanee o escoriazione.
    2. L'attrezzatura necessaria per raschiare la pelle è un vetrino per microscopio in vetro pulito, olio minerale e una spatola metallica o una lama di bisturi.
    3. Posizionare alcune gocce di olio minerale sul vetrino del microscopio.
    4. Pizzicare la pelle in una piega sul bordo della lesione o dell'area di interesse.
    5. Metti una piccola quantità di olio minerale sulla pelle.
    6. Posizionare il bordo della spatola o della lama del bisturi sulla pelle e raschiare contro la direzione della crescita dei capelli.
    7. Continuare a raschiare fino a quando una piccola quantità di arrossamento è visibile sulla pelle.
    8. Posizionare i capelli e il tessuto raschiati dalla superficie della pelle nell'olio sul vetrino del microscopio. Se necessario, distribuire il materiale in modo che sia distribuito uniformemente nell'olio.
    9. Il vetrino è ora pronto per essere esaminato al microscopio. Se lo si desidera, è possibile applicare un coverslip alla goccia d'olio sul vetrino. Esaminare la diapositiva con ingrandimento 4X e 10X.
  3. Esame Pelt
    1. L'esame pelt è l'ultimo esame esterno eseguito; tuttavia, viene effettivamente fatto dopo che l'esame interno è stato completato.
    2. L'animale viene posto in una capsula di Petri di vetro o plastica dopo che sono stati raccolti tutti i campioni di organi interni.
    3. Il piatto viene posto in frigorifero per 15 minuti.
    4. Dopo 15 minuti, il piatto viene posto sotto un microscopio sezionante e la pelle viene esaminata per i parassiti esterni. La maggior parte degli acari della pelliccia si sposterà alle estremità dei peli e sarà facilmente osservabile.

2. Esame interno grossolano della cavità addominale

  1. Ascisare la pelle
    1. Un piccolo taglio è fatto appena anteriormente al bacino nelle femmine e sopra il prepuzio nei maschi.
    2. Il taglio della pelle è esteso al mento.
    3. La dissezione smussata viene utilizzata per allentare la pelle dalla fascia e dal muscolo.
    4. I tagli trasversali sono fatti anteriormente agli arti posteriori e posteriori agli arti anteriori. Bisogna fare attenzione a non irrecidere i vasi sanguigni nella zona ascellare.
    5. Utilizzare la dissezione smussata per esporre l'area cervicale e il torace. È necessario prestare particolare attenzione per evitare la rottura dei vasi giugulari e carotidi nel collo.
  2. Ghiandole mammarie
    1. Nelle femmine, esaminare il tessuto mammario per cercare masse, scolorimento o anomalie.
    2. Le femmine in allattamento o in gravidanza avranno un aumento del volume del tessuto mammario e il latte potrebbe essere presente.
    3. Il tessuto mammario si trova dalla parte superiore dello sterno al manubrio all'apertura genitale sulla superficie ventrale e si estende lateralmente su entrambi i lati quasi toccando la superficie dorsale ai fianchi e alle spalle.
    4. L'escissione delle ghiandole mammarie richiede di afferrare il bordo della ghiandola con una pinna per il pollice e l'uso di una dissezione smussata per allentare gli attaccamenti alla pelle. Una volta che la ghiandola è stata separata dalla pelle, le forbici dell'iride possono essere utilizzate per tagliare eventuali attacchi rimanenti prima di posizionare la ghiandola in una soluzione fissativa.
  3. Ghiandole sottocutanee
    1. Le ghiandole prepuziali sono accoppiate e situate appena anteriormente al prepuzio nel ratto maschio. Appaiono grandi e sono di colore da grigio a giallastro con un aspetto schiumoso.
    2. Le ghiandole salivari sottomandibolari sono accoppiate, situate nella mandibola, e si estendono lungo il collo fino al manubrio sterno. Hanno una copertura dura e sono strettamente aderenti ai muscoli.
    3. La rimozione di queste ghiandole richiede una dissezione smussata e una cura extra quando si lavora nella regione cervicale per prevenire la rottura dei vasi sanguigni. La dissezione smussata è una tecnica nella dissezione anatomica in cui i tessuti sono separati e le strutture sottostanti esposte senza taglio.
    4. Per la dissezione smussata, le forbici vengono utilizzate per disarti i tessuti, piuttosto che per tagliarli. Le punte chiuse vengono spinte nel tessuto e quindi aperte per dividere il tessuto lungo i piani naturali. Questo processo richiede pazienza e un tocco delicato, poiché lo stiramento del tessuto può causare danni agli organi e ai vasi sanguigni adiacenti.
    5. Le ghiandole, una volta liberate dai muscoli sottostanti, vengono sollevate e gli eventuali attaccamenti residui vengono recisi.
    6. Le ghiandole richiedono almeno un taglio per consentire la penetrazione del fissativo.
    7. Il grasso sottocutaneo viene valutato per quantità e deposizione. Un animale obeso può avere una grande quantità di grasso con la pelle che si sente ispessita. Gli animali disidratati avranno una ridotta elasticità della pelle e si sentiranno più sottili.
  4. Muscolo
    1. Osserva i muscoli addominali, intercostali ed esposti del collo e degli arti. Nota qualsiasi ispessimento anormale, masse o scolorimento.
    2. Se il muscolo è necessario per l'analisi, selezionare e tagliare via il campione prima di prendere qualsiasi organo addominale per ridurre la contaminazione del sangue.
  5. Apertura della cavità corporea
    1. Un piccolo taglio trasversale viene effettuato nel punto più caudale del muscolo addominale esposto.
    2. Sollevando il muscolo lontano dagli organi, tagliare lungo la linea alba allo xifoide.
    3. Tagliare i muscoli addominali dalla linea mediana lateralmente, appena sopra gli arti posteriori su entrambi i lati.
    4. Tagliare il muscolo addominale lungo la curva delle costole su entrambi i lati.
  6. Grasso addominale
    1. Valutare la quantità e l'accumulo di grasso corporeo. Un animale sano avrà cuscinetti di grasso addominale e un po 'di grasso lungo la superficie dorsale nella cavità addominale. Un animale eccessivamente magro, o un animale molto giovane, non avrà quantità apprezzabili di grasso che circondano i reni.
    2. Osservare il colore del grasso corporeo e notare eventuali anomalie.

3. Organi addominali

  1. Fegato
    1. Normalmente, il colore del fegato dovrebbe essere un rosso scuro. I margini dovrebbero essere lisci e avere un bordo nitido. Un fegato anormale avrà un bordo ispessito e può avere tacche o bordi smerlati.
    2. Bisogna fare attenzione quando si maneggia il fegato, in quanto è un tessuto friabile. Qualsiasi interruzione dell'integrità dell'organo comporterà la fuoriuscita di sangue nella cavità del corpo e l'oscuramento degli organi.
    3. Riflettere delicatamente il fegato lontano dal diaframma e fare un taglio attraverso i vasi sanguigni anteriori al fegato.
    4. Riflettere il fegato verso il diaframma e afferrare il nodo fibroso che collega tutti i lobi del fegato centralmente. Sollevare il fegato mentre si tagliano tutti gli attaccamenti al tratto intestinale e allo stomaco.
    5. Rimuovere il fegato in un unico pezzo e asciugare il sangue in eccesso dalla superficie dell'organo. Può essere posto in un bagno salino, o risciacquato in soluzione salina sterile, prima di tagliare in sezioni più sottili per consentire la penetrazione di soluzioni fissative.
  2. Cistifellea
    1. La cistifellea è un piccolo sacco trasparente che spesso appare giallo a causa dell'accumulo di bile. È presente nei topi, ma non nei ratti.
    2. La cistifellea si trova tra la parte superiore più lobi del fegato lungo la linea mediana. È generalmente collegato al diaframma da un frenulo sottile che può essere accidentalmente strappato, causando la rottura della cistifellea.
    3. La cistifellea può essere rimossa con il fegato e separata in seguito per l'esame.
  3. Milza
    1. La milza è rosso scuro e si trova lungo la curvatura inferiore dello stomaco. Dovrebbe essere di forma regolare, con una superficie leggermente opaca.
    2. È generalmente più grande nei maschi che nelle femmine. Gli animali con infezioni parassitarie interne, infezioni batteriche o malattie del sangue possono avere ingrossamento della milza.
    3. Poiché la milza filtra i globuli rossi danneggiati dalla circolazione, è piena di sangue. Quando si rimuove la milza, evitare di perforare l'organo.
    4. Per rimuoverlo, la milza viene sollevata e gli attacchi tagliati tra lo stomaco e la milza.
  4. Tratto intestinale
    1. I cambiamenti post-mortem si verificano rapidamente e includono il pooling di sangue nei tessuti, con conseguente comparsa di lividi e il gonfiaggio dell'intestino con gas, spesso prodotto da una crescita eccessiva batterica. Il tratto intestinale viene accuratamente esaminato dopo che è stato rimosso dal corpo.
  5. Stomaco
    1. Lo stomaco si trova all'estremità distale dell'esofago. Sembra essere bi-tonico, differenziando le porzioni muscolari e ghiandolari.
    2. Lo stomaco dovrebbe essere valutato per la presenza di cibo dal tatto. I roditori generalmente mangiano costantemente a causa di un alto tasso metabolico. Si dovrebbe notare uno stomaco vuoto, in quanto può essere indicativo di malattia.
    3. Non tagliare lo stomaco, poiché il contenuto contaminerà gli organi nella cavità addominale.
    4. Per rimuovere lo stomaco dal tratto intestinale, l'esofago viene reciso appena anteriormente allo stomaco. Se lo stomaco deve essere collocato in un contenitore comune di fissativo, un pezzo di sutura può essere legato attorno all'esofago per evitare la fuoriuscita del contenuto dello stomaco prima del taglio.
  6. Intestino tenue
    1. L'intestino tenue è composto da tre sezioni: il duodeno, il digiuno e l'ileo. Non conterrà pellet fecali.
    2. Il duodeno è una sezione più corta dallo sfintere dello stomaco posteriore all'inizio del digiuno. Il dotto biliare entra nell'intestino tenue al duodeno e il tessuto pancreatico è più saldamente attaccato a questa porzione dell'intestino tenue.
    3. Il digiuno è la porzione centrale dell'intestino tenue.
    4. I cerotti di Peyer, composti da tessuto linfoide in piccole macchie ovali, sono presenti sulla superficie non microeserica del digiuno e dell'ileo nel ratto. 3 Questi fanno parte del sistema immunitario e possono essere utili nella diagnosi delle malattie immunitarie.
    5. L'ileo è la porzione distale dell'intestino tenue ed è la parte più lunga, che termina al cieco.
  7. Cieco
    1. Il cieco è di colore verdastro e molto morbido.
    2. Si trova alla giunzione dell'intestino tenue e crasso.
    3. La fermentazione avviene nel cieco, quindi la puntura dell'organo si tradurrà in un cattivo odore e contaminazione degli organi con batteri.
  8. Intestino crasso
    1. L'intestino crasso inizia al cieco e continua fino all'ano. È facilmente identificabile, poiché i pellet fecali possono essere visualizzati all'interno del lume dell'intestino.
    2. Non ci dovrebbero essere aree di emorragia o scolorimento immediatamente dopo l'eutanasia.
  9. Mesentere
    1. L'intestino tenue e crasso sono ancorati al corpo dal mesentere, una membrana contenente vasi sanguigni, grasso e linfonodi.
    2. Dovrebbe essere esaminato per i linfonodi ingrossati e qualsiasi massa prima della rimozione del tratto intestinale.
  10. Pancreas
    1. Il pancreas è un organo diffuso situato sotto lo stomaco e tra le prime pieghe del duodeno. È di colore da marrone chiaro a grigio e composto da più piccoli lobi con bordi irregolari.
    2. Potrebbe non essere possibile rimuovere il pancreas in un unico pezzo.
    3. Se il tessuto pancreatico deve essere raccolto, deve essere fatto prima della rimozione del tratto intestinale.
    4. Il tessuto identificato come pancreatico deve essere accuratamente preso in giro lontano dal tessuto mesenterico che lo circonda.
  11. Rimozione del tratto intestinale
    1. Il tratto intestinale viene rimosso come un unico pezzo, iniziando con lo stomaco e estendendosi fino all'ano.
    2. Un taglio viene effettuato attraverso l'intestino crasso, appena anteriore all'ano. L'intero tratto intestinale può essere sollevato e tutti gli attacchi membranosi recisi. Il tratto intestinale può quindi essere rimosso dal mesentere, tagliato in sezioni e fissato.
    3. Quando si posizionano sezioni dell'intestino in barattoli contenenti altri organi, è imperativo che le estremità siano legate per prevenire la contaminazione dei tessuti con batteri intestinali.
    4. Il lume del tratto intestinale può essere esposto riducendone la lunghezza usando piccole forbici a punta fine. L'interno può essere risciacquato dopo aver esposto il lume.
    5. Alcuni studi possono richiedere che una porzione di intestino venga rimossa e lavata piuttosto che tagliata. Fissando un ago smussato in un'estremità del tessuto asportato, la soluzione salina o fissativa può essere forzata nell'intestino per lavare il contenuto.
  12. Rene
    1. I reni sono organi accoppiati situati contro i muscoli della schiena. Il rene destro è più alto del sinistro. I reni negli animali più anziani possono essere circondati da depositi di grasso, rendendoli difficili da visualizzare.
    2. Ha approssimativamente le dimensioni e il colore di un fagiolo scuro e le sue superfici dovrebbero essere lisce.
    3. Immediatamente anteriore al rene è la ghiandola surrenale, che appare come un piccolo nodulo rosa chiaro.
    4. Per rimuovere il rene, isolarlo usando una pinca e tagliare tra il rene e l'uretere.
    5. I reni hanno una capsula esterna dura che può essere staccata per visualizzare meglio le superfici. Tagliare un rene a metà lungo l'asse lungo e l'altro rene trasversalmente. Si noti che qualsiasi graniglia all'interno del rene potrebbe indicare la presenza di cristalli o depositi minerali.
  13. Sistema riproduttivo femminile
    1. L'utero è una struttura a forma di Y. Il corpo dell'utero è corto con le corna accoppiate a sinistra ea destra. Le corna terminano alle tube di Falloppio e alle ovaie. In una femmina non incinta, le corna saranno rosa pallido e sottili. In un animale in gravidanza, le corna appariranno più scure e avranno vasi sanguigni pronunciati che corrono adiacenti alle corna uterine. Man mano che la gestazione procede, le corna uterine avranno un aspetto "filo di perle". Gli embrioni in via di sviluppo creeranno un'area pallida all'interno del corno e, man mano che si sviluppano, l'utero si allungherà e il tessuto diventerà più sottile, consentendo la visualizzazione.
    2. Le ovaie si troveranno appena sotto i reni. Avranno una superficie ruvida a causa delle diverse fasi di maturazione dei follicoli. Le ovaie cistiche avranno vescicole piene di liquido. Questo fluido può variare da colore paglierino a sanguigno.
    3. Per rimuovere le ovaie, tagliare gli attaccamenti arteriosi anteriormente e la tuba di Falloppio posteriormente. Se lo si desidera, le ovaie possono essere tolte attaccate all'utero.
    4. Per rimuovere l'utero, deve essere afferrato delicatamente e la trazione applicata per essere in grado di tagliare sotto la cervice. Dopo il taglio, sollevare il corpo e le corna dell'utero, rompendo qualsiasi attaccamento nella cavità del corpo.
  14. Sistema riproduttivo maschile
    1. Le vescicole seminali sono strutture bianche, a forma di corno di ariete, accoppiate situate anteriormente alla vescica urinaria e attaccate sulla linea mediana alla ghiandola prostatica. Le dimensioni variano, ma possono essere grandi come il cieco.
    2. La ghiandola prostatica si trova intorno alla vescica urinaria alla base. Questo tessuto è generalmente un'abbronzatura leggera. Negli animali più anziani, può presentare iperplasia. Gli animali più anziani generalmente avranno più grasso corporeo che può rendere difficile la visualizzazione della ghiandola prostatica.
    3. I testicoli sono accoppiati e situati nelle sacche scrotali. La superficie deve essere liscia con una vascolarizzazione fine evidente sulla superficie. Topi e ratti mancano di un anello inguinale o sfintere, che consente all'animale di ritirare i testicoli nella cavità addominale. Per visualizzarli, afferrare i cuscinetti di grasso addominale situati nell'addome inferiore e tirarli anteriormente. Questo tirerà i testicoli dallo scroto per consentire l'esame. L'epididimo è lungo il margine inferiore del testicolo e si assottiglia verso l'alto. Il dotto deferente è attaccato all'estremità dell'epididimo e riconduce alla prostata.
    4. La rimozione dei testicoli può essere effettuata tagliando l'attacco allo scroto e tagliando i dotti deferenti.
    5. La rimozione della prostata e delle vescicole seminali richiede di afferrare la base della vescica urinaria e il sollevamento, mentre si tagliano gli attaccamenti sotto la prostata.

4. Cavità toracica

  1. Polmoni
    1. I polmoni sono normalmente di un colore rosa brillante e spugnosi nella consistenza con una superficie liscia. Tuttavia, l'eutanasia con CO2 può causare emorragie polmonari, con conseguenti macchie rosso scuro che possono coprire l'intera superficie polmonare.
  2. Cuore
    1. Il cuore è rosso scuro con quattro camere. I ventricoli sono muscolosi e si sentono fermi al tatto. Gli atri sono di colore rosso più scuro e si trovano nella parte superiore dei ventricoli. Sono molto meno muscolosi e appaiono flaccidi.
    2. Il sacco pericardico è una sottile membrana traslucida che circonda il cuore.
  3. Timo
    1. Il timo si trova anteriormente al cuore e si trova sopra la trachea. Dovrebbe essere liscio nella consistenza.
    2. Negli animali giovani, appare come abbronzatura con una consistenza grassa.
    3. Gli animali più anziani avranno infiltrazioni di tessuto adiposo nel timo, allargandolo e dando al timo un colore bianco.
  4. Trachea
    1. La trachea si estende dall'epiglottide alla biforcazione dei bronchi. È un tubo cartilagineo increspato che è flessibile.
    2. Dovrebbe essere chiaro e non avere alcun liquido fluido o schiumoso nel lume. L'eutanasia con CO2 può causare accumulo di liquidi (sierosanguino e/o schiumosi) nei polmoni e nella trachea a causa di emorragia.
  5. Esofago
    1. L'esofago si estende dalla cavità orale allo stomaco. È un tubo molto sottile che si trova direttamente dietro la trachea e dietro il cuore e passa attraverso il diaframma allo stomaco.
    2. L'esofago è difficile da rimuovere, in quanto è facilmente strappato anche se il tessuto è elastico. La rimozione dell'esofago viene eseguita più facilmente sezionandolo lontano dalla trachea dopo la rimozione del cuore e dei polmoni.
  6. Rimozione degli organi toracici
    1. Il cuore e i polmoni sono più facilmente rimossi insieme.
    2. Posizionare la pinna perpendicolare alla trachea e afferrare saldamente la trachea, appena sopra il timo.
    3. Usando le forbici, fare un taglio perpendicolare alla trachea appena anteriore alla pinza. Questo taglio dovrebbe tagliare la trachea e l'esofago.
    4. Senza allentare la presa sulla trachea, sollevare la trachea caudale e snip eventuali attacchi dei polmoni alla superficie spinale nella gabbia toracica.
    5. L'esofago potrebbe aver bisogno di essere tagliato per essere in grado di sollevare il cuore e i polmoni liberi dalla cavità toracica.
    6. Dopo che il cuore è stato rimosso dal corpo, può essere lavato con soluzione salina per rimuovere il sangue residuo e coaguli, oppure può essere riempito con fissativo attraverso l'aorta.
    7. Una volta che i polmoni sono asportati, vengono gonfiati con fissativo. Una legatura è posizionata liberamente intorno alla trachea. Un ago che è attaccato a una siringa contenente il fissativo di scelta viene infilato nel lume della trachea. La legatura viene stretta attorno all'ago e il fissativo viene iniettato fino a quando i polmoni non vengono gonfiati. Dopo la rimozione dell'ago, la legatura viene serrata per evitare perdite.
  7. Cavità orale
    1. Lingua
      1. La lingua dei roditori è liscia.
      2. Esaminare la superficie per le lesioni, compresa la parte inferiore.
      3. La lingua viene raramente raccolta ad eccezione di indagini specializzate come studi sul cancro orale.
      4. Per rimuovere la lingua, tagliare le superfici buccali su ciascun lato della cavità orale fino all'articolazione temporale-mandibolare.
      5. Dislocare la mandibola e riflettere la mascella per rivelare l'epiglottide e la base della lingua.
      6. Usando una pinna per estendere la lingua, tagliare gli attacchi sottostanti caudale alla base della lingua.
      7. Mantenendo la trazione, tagliare orizzontalmente alla base della lingua per liberarla dalla cavità orale.
    2. Denti
      1. La dentazione del ratto consiste di tre molari e un incisivo in ogni quadrante che è separato da un diastema sdentato. Sono coperti da smalto solo sul lato labiale; sulla superficie interna del dente è dentina.
      2. I denti di ratto sono normalmente di colore giallo/arancione. Questo colore è più pronunciato sullo smalto incisivo ed è dovuto alla presenza di un pigmento contenente ferro. Il colore inizia a circa 21 giorni dopo la nascita e si approfondisce con l'età.
      3. Esaminare i denti per la crescita eccessiva o la malocclusione.

5. Testa

  1. Occhi
    1. Gli occhi dovrebbero essere di dimensioni uguali e chiari dall'essudato. La congiuntiva dovrebbe essere liscia.
    2. Per rimuovere gli occhi, applicare una pressione sulla pelle che circonda l'occhio all'indietro e verso il basso per sporgere l'occhio dall'orbita. Utilizzando una pinna a punta curva, isolare il globo e tagliare gli accessori che lo tengono nella presa.
  2. Orecchie
    1. Osservare le orecchie per l'identificazione. Alcuni investigatori richiedono che i marchi auricolari siano inclusi nei campioni di organi per la conferma dell'identità animale.
    2. I canali uditivi vengono esaminati per eventuali lesioni, masse o essudato.
  3. Naso
    1. Il naso è osservato per fluido o essudato.
    2. Le narici dovrebbero essere simmetriche e chiare.

L'autopsia , cioè l'esame post mortem di organi e prelievi di tessuti sono componenti integranti di molti esperimenti di laboratorio, che si basano sui punti temporali di raccolta dei dati finali raccolti dalle analisi degli organi prelevati. Pertanto, è importante apprendere la corretta tecnica diagnostica di necroscopia e prelievo dei tessuti, poiché la procedura può influire in modo significativo sulla qualità dei campioni raccolti. Questa presentazione esaminerà il metodo di dissezione ed estrazione di organi addominali, riproduttivi e toracici da animali da laboratorio.

Prima di iniziare con la procedura, è necessario avviare un modulo che includa una storia completa dell'animale: numero di identificazione dell'animale, sesso, condizioni di stabulazione, data di nascita, data di morte, numero di studio / protocollo e il nome del ricercatore principale.

Quindi, preparare l'area di dissezione. Posare un rivestimento da banco, vassoio di dissezione, strumenti designati per l'autopsia, che include forbici, pinze, lama sterile per bisturi, taglierine per ossa, sonda smussata, piccola spatola e materiale di sutura non assorbibile. Il prelievo di organi e tessuti per l'esame istologico richiede che i tessuti siano conservati in una soluzione fissativa. Se non diversamente specificato, il fissativo più comunemente usato è la formalina tamponata neutra al 10%. Si noti che i campioni di tessuto devono avere uno spessore di 0,5-1 cm per consentire una penetrazione sufficiente della soluzione fissativa. La fissazione previene il decadimento, l'autolisi e la putrefazione; interrompe qualsiasi reazione biochimica in corso; e può aumentare la resistenza meccanica e la stabilità dei tessuti trattati.

Il metodo di eutanasia dell'animale può anche influire sulla qualità dei campioni. Il metodo di eutanasia più comunemente usato per topi e ratti è un sovradosaggio di gas di anidride carbonica. Gli animali vengono lasciati nella loro gabbia domestica, che viene collocata, in una camera, e la CO2 viene gradualmente introdotta nella camera ad un tasso di spostamento del 10-30% del volume della camera / min. Ciò fa sì che gli animali perdano conoscenza prima della percezione del dolore associato all'attivazione del nocicettore da parte dell'acido carbonico. Il flusso viene quindi mantenuto nella camera fino a quando non si è verificato l'arresto respiratorio e l'animale è morto.

Dopo l'eutanasia, eseguire prima un primo esame esterno ispezionando visivamente la carcassa per lesioni e masse, eccessiva crescita dei denti o qualsiasi colorazione della pelliccia alla bocca, alle narici, alle orecchie, agli occhi e alle aperture anali e genitali. Se giustificato, eseguire un test del nastro, raschiatura della pelle e esami delle pelli per rilevare parassiti esterni. Una volta completato l'esame esterno, è il momento di iniziare l'autopsia, a partire dalla cavità addominale. Si noti che prima di rimuovere qualsiasi campione di tessuto è importante osservare l'organo in situ.

Per iniziare ad ascisare la pelle, posizionare un piccolo taglio appena anteriore al bacino nelle femmine e sopra il prepuzio nei maschi. Quindi, utilizzando la tecnica di dissezione smussata, allentare la pelle dalla fascia e dal muscolo. La dissezione smussata è una tecnica nella dissezione anatomica in cui i tessuti sono separati e le strutture sottostanti esposte senza taglio. In questa tecnica, le forbici vengono utilizzate per spargere i tessuti piuttosto che per tagliarli. Le punte chiuse vengono spinte nel tessuto e quindi aperte per dividere il tessuto lungo i piani naturali. Questo processo richiede pazienza e un tocco delicato, poiché lo stiramento del tessuto può causare danni agli organi e ai vasi sanguigni adiacenti. Quindi estendere il taglio al mento. Successivamente, tagliare trasversalmente anteriormente agli arti posteriori e posteriori agli arti anteriori e utilizzare la dissezione smussata per esporre l'area cervicale e il torace. Prestare particolare attenzione per evitare di rompersi i vasi giugulari e carotidi nel collo.

Nelle femmine, con la pelle asportata, osservare il tessuto mammario dalla parte superiore dello sterno al manubrio all'apertura genitale sulla superficie ventrale; estendendosi lateralmente su entrambi i lati. Le femmine in allattamento o in gravidanza avranno un aumento del volume del tessuto mammario e il latte può essere presente. Per asportare le ghiandole mammarie, afferrare il bordo del tessuto con una pinna e utilizzare la dissezione smussata per allentare gli attaccamenti alla pelle. Una volta che la ghiandola è stata separata, può essere posta in una soluzione fissativa per la successiva analisi istologica.

In questa fase, è possibile osservare le ghiandole salivari sottomandibolari, che sono accoppiate e situate sulla mandibola - che si estendono lungo il collo fino al manubrio sterno. La rimozione di queste ghiandole richiede una dissezione smussata e una cura extra quando si lavora nella regione cervicale per prevenire la rottura dei vasi sanguigni. Una volta liberato dai muscoli sottostanti, sollevare le ghiandole e dissegre eventuali attaccamenti residui. Le ghiandole richiedono almeno un taglio per consentire la penetrazione del fissativo.

Inoltre, è possibile vedere la trachea, che si estende dall'epiglottide alla biforcazione dei bronchi. È un tubo cartilagineo increspato che è flessibile. Mentre normalmente chiaro, l'eutanasia con CO2 può causare l'accumulo di liquidi nei polmoni e nella trachea che sembra un liquido schiumoso e chiaro. Anche il grasso sottocutaneo sarà presente in quest'area. Valutalo per quantità e deposizione. Un animale obeso può avere una grande quantità di grasso con la pelle che si sente ispessita.

Prima di aprire la cavità corporea, osservare i muscoli addominali, intercostali ed esposti del collo e gli arti per qualsiasi ispessimento, massa o scolorimento. Per aprire la cavità corporea, prima fai un piccolo taglio trasversale nel punto più caudale del muscolo addominale esposto. Quindi sollevare il muscolo lontano dagli organi e tagliare lungo la linea alba allo xifoide. Quindi, sezionare i muscoli lateralmente dalla linea mediana a poco sopra gli arti posteriori su entrambi i lati. Infine, tagliare lungo la curva delle costole su entrambi i lati. Una volta aperta la cavità corporea, valutare la quantità e l'accumulo di grasso addominale. Un animale sano avrà cuscinetti di grasso addominale e un po 'di grasso lungo la superficie dorsale nella cavità. Osservare il colore di questo tessuto e notare eventuali anomalie.

Ora siamo pronti per iniziare il prelievo di organi addominali. Inizia individuando la milza, che è rosso scuro e si trova lungo la curvatura inferiore dello stomaco. Dovrebbe essere di forma regolare e con una superficie leggermente opaca. Per rimuovere la milza, sollevare l'organo e snip gli attacchi allo stomaco.

Lo stomaco si trova all'estremità distale dell'esofago. Sembra essere bi-tonico, differenziando le porzioni muscolari e ghiandolari. Sentilo per la presenza di cibo. Si dovrebbe notare uno stomaco vuoto, in quanto può essere indicativo di malattia. Non tagliare lo stomaco, poiché il contenuto contaminerà gli organi nella cavità addominale.

L'intestino tenue è collegato distalmente e inferiore allo stomaco. Ci sono tre sezioni distinte dell'intestino tenue. Il primo è il duodeno - una sezione più breve dallo sfintere dello stomaco posteriore all'inizio del digiuno. Il dotto biliare entra qui e il tessuto pancreatico è più saldamente attaccato a questa porzione dell'intestino tenue. Il digiuno è la porzione centrale. I cerotti di Peyer, che sono piccole aree ovali composte da tessuto linfoide, possono essere osservati sulla superficie del digiuno e dell'ileo. L'ileo è la porzione più lunga dell'intestino tenue che termina al cieco - situato alla giunzione dell'intestino tenue e crasso. Il cieco appare di colore verdastro ed è molto morbido.

L'intestino crasso continua dal cieco all'ano. È facilmente identificabile in quanto i pellet fecali possono essere visualizzati all'interno del lume di questa struttura. L'intestino tenue e crasso è ancorato al corpo dal mesentere, una membrana contenente vasi sanguigni, grasso e linfonodi. Questo dovrebbe essere esaminato per i linfonodi ingrossati e qualsiasi massa prima della rimozione del tratto intestinale. Il pancreas è un organo diffuso situato posteriormente allo stomaco. È di colore da marrone chiaro a grigio e composto da più piccoli lobi con bordi irregolari. Per raccogliere il pancreas, afferrare l'organo e stuzzicare delicatamente dal tessuto mesenterico circostante. Questo deve essere fatto prima della rimozione del tratto intestinale.

Per rimuovere l'intero tratto come un unico pezzo che inizia con lo stomaco e si estende fino all'ano, prima posizionare una legatura al retto e quindi fare un taglio attraverso l'intestino crasso appena anteriore all'ano. Quindi, posizionare una legatura alla giunzione dell'esofago e dello stomaco, a seguito della quale l'intero tratto intestinale può essere sollevato e gli eventuali attacchi membranosi recisi. Il tutto può quindi essere separato dal mesentere, tagliato in sezioni e fissato.

I reni sono organi accoppiati situati contro i muscoli della schiena. Dovrebbero avere le dimensioni e il colore di un fagiolo scuro e avere una superficie liscia. Immediatamente anteriore al rene è la ghiandola surrenale che appare come un piccolo nodulo rosa chiaro.

Per rimuovere un rene, isolarlo usando una pinza e tagliare tra l'organo e l'uretere. Lo strato esterno duro può quindi essere staccato per esaminare la superficie. Tagliare un rene a metà lungo l'asse lungo e l'altro trasversalmente. Qualsiasi graniglia all'interno può indicare la presenza di cristalli o depositi minerali. Infine, rimuovere il fegato, che è di colore rosso scuro e i suoi margini dovrebbero essere lisci con un bordo croccante. Bisogna fare attenzione quando si maneggia il fegato, in quanto è un tessuto friabile. Qualsiasi interruzione dell'integrità dell'organo comporterà la fuoriuscita di sangue nella cavità corporea e oscurerà altri organi.

Per rimuovere il fegato, prima riflettere delicatamente i lobi lontano dal diaframma e fare un taglio attraverso i vasi sanguigni anteriori alla struttura. Quindi, riflettere il fegato verso il diaframma e afferrare il nodo fibroso che collega tutti i lobi centralmente. Infine, sollevare l'organo mentre si tagliano tutti gli attaccamenti al tratto intestinale e allo stomaco.

Il sistema riproduttivo femminile consiste nell'utero e nelle ovaie. L'utero è una breve struttura a forma di Y con corna che si estendono in entrambe le direzioni. Le corna terminano alle tube di Falloppio e alle ovaie - situate appena sotto i reni. Le ovaie avranno una superficie ruvida a causa delle diverse fasi di maturazione dei follicoli.

Per rimuovere le ovaie, tagliare gli attaccamenti arteriosi anteriormente e la tuba di Falloppio posteriormente. Per rimuovere l'utero, afferrare delicatamente e tagliare sotto la cervice. Dopo il taglio, sollevare il corpo e le corna dell'utero rompendo eventuali attaccamenti nella cavità del corpo.

Nei maschi, puoi anche osservare le ghiandole prepuziali situate appena anteriormente al prepuzio. Appaiono grandi e sono di colore da grigio a giallastro con un aspetto schiumoso. La rimozione e il fissaggio di queste ghiandole è simile alle ghiandole sottomandibolari. Inoltre, il sistema riproduttivo maschile è costituito da vescicole seminali, ghiandola prostatica e testicoli. Le vescicole seminali sono strutture bianche a forma di "corno di ariete" situate anteriormente alla vescica urinaria e attaccate sulla linea mediana alla ghiandola prostatica.

La ghiandola prostatica - generalmente di colore marrone chiaro - si trova intorno alla vescica urinaria alla base. Per visualizzare i testicoli, afferrare i cuscinetti di grasso addominale situati nell'addome inferiore e tirarli anteriormente. Questo tirerà i testicoli dallo scroto per consentire l'esame. La superficie deve essere liscia con una vascolarizzazione fine evidente sulla superficie.

L'epididimo è lungo il margine inferiore del testicolo e si assottiglia verso l'alto. Il dotto deferente è attaccato all'estremità dell'epididimo e riconduce alla prostata. Per rimuovere i testicoli, tagliare l'attacco allo scroto e tagliare i dotti deferenti. Per rimuovere la prostata e le vescicole seminali, afferrare la base della vescica urinaria e sollevare mentre si tagliano gli attaccamenti sotto la prostata.

Passando agli organi all'interno della cavità toracica. Per esporre le strutture vitali, rimuovere il diaframma dall'attacco alle costole. Quindi, tagliare la gabbia toracica lateralmente su entrambi i lati fino alla parte superiore del manubrio sterno, quindi riflettere le ossa cranicamente per visualizzare gli organi toracici.

I polmoni sono normalmente di un colore rosa brillante, di consistenza spugnosa con una superficie liscia. Tuttavia, l'eutanasia con CO2 può causare emorragie polmonari con conseguenti macchie rosso scuro che possono coprire l'intera superficie polmonare.

Il cuore è rosso scuro e i ventricoli sono muscolosi, che si sentono fermi al tatto. Gli atri sono di colore rosso più scuro e si trovano nella parte superiore dei ventricoli. Sono molto meno muscolosi e appaiono flaccidi. Una sottile membrana traslucida chiamata sacco pericardico circonda il cuore.

Il timo si trova anteriormente al cuore e si trova sopra la trachea. Dovrebbe essere liscio nella consistenza. Puoi vedere la trachea come descritto prima, e l'esofago è un tubo molto sottile che si trova direttamente dietro la trachea e dietro il cuore e passa attraverso il diaframma allo stomaco.

Per rimuovere gli organi nella cavità toracica, iniziare afferrando la trachea appena sopra il timo e fare un taglio perpendicolare appena anteriore alla pinna. Mantenendo la presa, sollevare la trachea caudale e snip eventuali attacchi dei polmoni alla superficie spinale nella gabbia toracica. L'esofago potrebbe dover essere tagliato per essere in grado di sollevare il cuore e i polmoni liberi dalla cavità toracica

Dopo che il cuore è stato rimosso per il corpo, sciacquarlo con soluzione salina per rimuovere il sangue residuo e coaguli, o riempirlo con il fissativo attraverso l'aorta. Una volta che i polmoni sono stati asportati, posizionare una legatura sciolta attorno alla trachea. Quindi, infilare un ago attaccato a una siringa contenente il fissativo nel lume della trachea e stringere la legatura. Quindi iniettare il fissativo fino a quando i polmoni non sono gonfiati. Infine, rimuovere l'ago e stringere ulteriormente la legatura per evitare perdite.

Con questo respiro di conoscenza riguardante l'autopsia dei roditori e la raccolta dei tessuti, diamo un'occhiata ad alcuni degli attuali esperimenti di laboratorio che coinvolgono queste procedure.

L'autopsia diagnostica è un endpoint comune negli esperimenti di metastasi del cancro. In questo esempio, i ricercatori hanno iniettato cellule tumorali nella milza del roditore Poi, da trenta a sessanta giorni dopo, hanno condotto l'autopsia, che ha rivelato metastasi epatiche significative.

L'estrazione del tessuto è spesso seguita da analisi istologiche, che aiuta nello studio dell'anatomia microscopica del campione. Seguendo il protocollo di fissazione, incorporamento, sezionamento e colorazione dei tessuti, i ricercatori sono in grado di studiare le strutture microscopiche in questi organi e scoprire l'effetto degli interventi genetici o farmacologici a livello atomico.

A volte i ricercatori rimuovono i tessuti per studiare i processi fisiologici, come l'angiogenesi. Qui, gli sperimentatori hanno esternato il tessuto mesenterico di un ratto per stimolare la crescita vascolare. Quindi, hanno raccolto alcune sezioni e le hanno trattate con i marcatori che macchiano le cellule di qualsiasi vaso sanguigno, per studiare le dinamiche cellulari coinvolte nella crescita della rete vascolare.

Hai appena visto il video di JoVE che descrive in dettaglio le fasi dell'autopsia diagnostica e della raccolta dei tessuti negli animali da laboratorio. È importante utilizzare tecniche adeguate per il prelievo e la conservazione degli organi, in modo che la procedura di estrazione non abbia alcun effetto sull'interpretazione dei dati raccolti. Come sempre, grazie per aver guardato!

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Il passo finale in molti progetti di ricerca è l'autopsia degli animali da esperimento. Un'osservazione dettagliata delle strutture esterne e interne seguita dalla raccolta di tessuti per ulteriori analisi fornisce una grande quantità di dati di ricerca. Tecniche adeguate per la rimozione e la conservazione dei tessuti con le soluzioni fissative appropriate sono essenziali per la corretta interpretazione dei risultati.

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References

  1. Leary, S., Underwood, W., Anthony, R., Cartner, S., Corey, D., Grandin, T., et al. 2013. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition.
  2. Parkinson, C.M., O'Brien, A., Albers, T.M., Simon, M.A., Clifford, C.B. and Pritchett-Corning, K.R. 2011. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. 54. e2966. 1-7.
  3. Fiette, L. and Slaoui, M. 2011. Necropsy and Sampling Procedures in Rodents. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols, 39-67.
  4. Youngson, R.M. 2005. Collins dictionary of Medicine fourth edition.

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