Overview
ソース: ケイ ・ スチュワート、RLATG、RVT CMAR;ヴァレリー A. シュレーダー、RVT、RLATG。ノートルダムのノートルダム大学
1959 年に、3 R の W.M.S. ラッセルと r. l. トリーバーチによって彼らの本で導入された人道的な実験技術の原則です。3 R の交換、削減、および研究における動物の使用の洗練。1研究動物由来組織培養細胞の使用は多くの実験を行うことができるので、交換手法体外。組織や細胞・組織培養用臓器を収穫、組織の汚染を避けるため無菌技術が必要です。滅菌の収穫も蛋白質および RNA の解析や組織の代謝プロファイリングの必要です。本稿では、ラットおよびマウスの生殖不能の臓器収穫のプロセスを議論します。
Principles
無菌技術は組織の無菌性を確保するために従わなければなりません。アルコールで消毒された層流フードで収穫を行います。使用されるすべての材料を滅菌する必要があります。収穫を行う技術者は、滅菌手術用手袋、滅菌手術用ガウン、マスク、ふっくなど保護具をドンする必要があります。ガウンは、開かれた体腔、ペトリ皿、または生殖不能媒体に皮膚細胞の脱落を防ぐために手首をカバーする必要があります。技術者の無菌性を維持するためには、この手順は、2 番目の非滅菌の技術者が動物の安楽死と滅菌の技術者を支援する必要です。
組織の代謝プロファイルを必要とする実験、組織収穫法は収集されたデータの品質に大きな影響を及ぼします。2安楽死両方プロシージャおよび組織の整合性に影響することができます収穫かかる時間の長さ。低酸素、炭酸ガスで安楽死の結果は、組織の代謝に大きな影響を持っている示されています。肺組織の血管の出血は、安楽死のため二酸化炭素の使用によっても発生します。組織の除去対象となる組織の連郭清を行うときの順序は、組織の時代へを開始または収穫の際に崩壊代謝の変化を引き起こす可能性が。
最も滅菌収穫は一つの臓器をターゲットとしながらもがあります 1 つ以上の臓器が必要であります。シーケンシャルの解剖時に必要な組織は除去されるべき順序を定めます。2急速に低下する組織は、可能な次の安楽死、早く収穫する必要があります。楽器の無菌性を維持するために腹腔内から収穫器官は次の順序で削除されます: 脾臓、肝臓、腎臓、副腎、卵巣や精巣、副生殖器 (前立腺、精嚢、子宮、卵管)、膵組織、リンパ節、膀胱、消化管 (胃、小さく、大きい腸)。胸腔内からの器官の収穫の順序は、まず心臓や肺胸腺、リンパ節、食道のコレクションに続いてを取り除くことです。3新しい手袋が必要各マウスです。
滅菌収穫器官のいくつかは保存する必要があります。液体窒素 (LN2) または LN2と 2 methylbutane の組み合わせで凍結組織の保全を実現します。LN2だけで、組織が滅菌生理食塩水で洗浄、余分な水分を使い果たす無菌の吸収性の布の滅菌アルミ箔正方形に配置、LN2にすぐに水中に沈みます。2免疫学的標本 2-methylbutane が追加されます。組織は、LN2で冷却されて 2-methylbutane に実際に浸水します。組織が白になっている、2 methylbutane から削除、滅菌パックに配置、LN2に直接配置されます。
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Procedure
1. 準備
- 一般的な材料は、ホヤの瓶、滅菌 20-25 g 針、アイリスのはさみと親指鉗子 (皮膚に 1 つ) と内部の組織の 1 つ、ペーパー タオル、生殖不能の外科医の手袋、滅菌ペトリネットの滅菌器具の 2 つのパックで 70% アルコールを含む料理、生殖不能媒体と滅菌生理食塩水。
- フードのファンは、手続きの前に、少なくとも 15 分間実行する必要がある、それは 70% アルコールで消毒する必要があります。
- フードには紫外線殺菌ランプが装備されている場合は、さらに作業面の消毒に使えます。
- フードのセットアップのきれいな手袋が着用されます。機器は、彼らが使用する、通常左から右への順序でフードに読み込まれます。きれいな項目を汚染からダーティな項目を防ぐ方向ワークフローで実施する作業が可能になります。これは、動物の死体からの偶発的な汚染から収穫された組織や臓器を保護します。
- パッケージの生殖不能の内部を尊重する滅菌器パックが開かれます。無菌性を維持、パックをテーブルのセンターに配置、各フラップは滅菌フィールドまたはパックの内側に交差することがなく開かれます。非滅菌の人は、彼/彼女のそれを離れて反射によって最初の上部フラップを開きます。各フラップの両方の手の 1 つを使用して側フラップを開きます、-パックからそれらを引っ張る。最終的なフラップは、パックの内側のサーフェスのいずれかに触れることを避けるために世話、パックを開く人に向かって引っ張られます。
- ボンネットにペーパー タオルを置き、アルコールとそれらをウェットします。
- 非滅菌の人が動物を安楽死させます。
- 不妊の人は、滅菌手術用手袋の 2 つのセットを着ています。
- 非滅菌の人はペーパー タオルに死体を配置し、70% アルコールで死体を完全に浸します。
- 滅菌はさみと鉗子のセットを使用して、(男性) の包皮や (女性) で骨盤の骨にちょうど前方皮膚の水平カットを作る。腹部の筋肉を切断を避けます。
- 楽器置いておきます。
2. 組織の収穫
- 女性と男性の包皮の上に骨盤にちょうど前方の小さなカットを作る。
- カットの下で親指を置き、カットの頭蓋の端を把握します。もう一方の手を使用して、安全に後肢を保持、尾の頭に向かって皮膚を引っ張りながら。
- 皮膚は後肢のすぐ上の体から引き離すだろうし、頭や前足にインサイド アウトになることが。これは効果的に器官の収穫時期に髪の汚染物質を削除します。
- 70% アルコールで再び体を浸すし、滅菌は、もはや手袋の表面的なペアを削除します。
- 滅菌器具を使用して腹腔内を開きます。
- 脾臓
- 脾臓を収穫、体は右横ずれの臥床に配置されます。
- 脾臓は腹部の筋肉を視覚化できます。
- はさみカットは、脾臓の上に直接行われます。
- 脾臓は優しく体腔から取り消されます。
- 脾臓、胃、膵組織のすべての添付ファイルをカットするときは、穿刺または器官を引き裂くことを避けてください。
- 肝臓
- その他の腹部の臓器を収穫、体は背臥位に。
- 腹部の筋肉を持ち上げて切り取る、腹腔内に直接開く楕円形を残してします。
- 腹腔内を公開した後横隔膜から尾側の肝臓を反映します。
- 横隔膜に肝臓をアタッチする任意の膜を慎重に断ちます。
- カットをする血管を通って背骨に垂直な肝臓と横隔膜の間表示されます。
- 肝臓を持ち上げ、その下にある添付ファイルを視覚化するダイヤフラムへ反映します。
- 胃と小腸は、中断する必要がありますに小さい肝葉をアタッチする薄い膜があります。
- その下側の肝臓の中心部に線維性のノードをつかんで、すべての添付ファイルを見つけるための器官。基になる臓器や組織から肝臓を分離します。
- 肝臓は壊れやすいと簡単にパンクすることができます血液の解放に終ってことを注意してください。したがって、それは注意深く扱われなければなりません。
- 腎臓
- 右腎を視覚化する左または左の腎臓を視覚化する右腹腔内を公開した後、腸をプッシュします。
- 腎臓を削除するには、体から臓器を分離する腎臓の下に把握する鉗子ブレードを使用します。体から腎臓をカットはさみやメス刃を使用します。腎臓の損傷を避けるために鉗子でカットをします。
- 腎臓を削除すると、任意の脂肪は臓器からトリミングことができます。
- 卵巣
- 腹腔内を公開した後、子宮を視覚化するため頭側腸に移動します。
- 左し、右の卵巣に子宮角に従ってください。
- 卵巣が小さいです。古い動物の彼らは脂肪に埋め込まれる可能性があります。
- 体からそれを分離するために卵巣の下で鉗子をスライドさせ、脂肪と卵管から無料でカットします。
- 精巣
- 腹腔内を開いたら、優しく鼠径の脂肪パッドを持ち、前方引き出します。
- これは陰嚢から精巣を引っ張ってくる。
- 精巣を露出すると、一度は、陰嚢や体から輸精管に添付ファイルをカットします。
- これは、それぞれの精巣。
- 脾臓
- 胸腔内の開いた胸部臓器を削除するには
- 体は背臥位に。胸腔臓器を収穫する場合皮膚が頭の上にも反映されるが不可欠です。
- 剣状突起と肋骨にちょうど尾側腹部の筋肉のカットを許可するリフトを把握します。両側に胸郭の下のカーブに沿ったカットを拡張します。横隔膜の可視化できるようになります。
- 胸郭のそれぞれの側に可能な限り最も外側の点をカット小することによって横隔膜を穿刺します。肋骨からダイヤフラムをカットします。
- 胸部の臓器を視覚化する剣状の肋骨を持ち上げます。
- 両側、胸骨の上部に横方向のカットを拡張し、胸を開きます。
- 心臓と肺は最も簡単に一緒に削除されます。
- 鉗子を気管に垂直に置き、気管をしっかりと把握します。
- はさみを使って気管鉗子にちょうど前方に垂直カットをします。このカットは、気管と食道を断つ必要があります。
- 気管のグリップをゆるめることがなく立ち上がって尾側気管を持ち上げます。
- 心臓を持ち上げ、心膜嚢を慎重にカットします。
- 大動脈は、動物の左側中心の頭蓋の側面です。
- 大動脈を鉗子で保持、カットをする遠位大動脈, 心臓のホールドを保持鉗子に。
- 前方の上大静脈、肺動脈と静脈を断つと大動脈を把握します。
- 大動脈の動脈によって胸腔内の無料の心を持ち上げます。
- 楽器の無菌性を維持するために次の順序で収穫している臓器: 胸腺, リンパ節, 食道。
- 特殊な状況で脳は無菌培養のために収穫する必要があります。
- 他の器官の収穫後、脳は最後に収穫されます。
- 脳が収集する唯一の臓器の場合、皮膚が、体からは削除できませんが、カットの首のうなじで作られ、正中線に沿って背側頸部から鼻の先端に延長の代わりに。
- 頭蓋骨から皮膚を横に引っ張って後、露出骨が 70% アルコールに浸した、汚れた手袋が削除されます。
- 専用滅菌脳収穫はさみのペアを使用して、頭蓋骨のベースで背骨をカットします。
- 後頭にはさみのポイントを配置し、正中線に沿って切断して頭蓋骨を開きます。
- 脳から頭頂骨をレバーにシザーの刃の平らな終わりを使用します。
- 慎重に脳幹部と親指鉗子の終了ポイントを使用して、脳の下にある視交叉神経の添付ファイルが中断されます。
- 同様に、脳の前方下に鉗子閉鎖をスライドさせ、嗅球で添付ファイルを分割します。
- 脳は、生殖不能媒体に頭蓋骨からドロップすることができます。
- 脳を収穫すると 1 つの手、みなされます非滅菌頭蓋骨をカットしながら、頭を安定させるためにあごの下に反映される頭骨および削除脳から皮膚にチャッキングします。
- 乳腺組織
- 乳腺組織は、胸骨柄、胸骨の上から腹側表面に生殖器の開口部に発見され、ほぼ腰と肩に背側表面に触れて、両側を横方向に拡張します。
- 大衆、変色や異常を探す乳腺組織を調べます。授乳中、または妊娠中の女性は、乳腺組織のボリュームを増加しているでしょうし、ミルクがあります。
- 乳腺の切除では、親指の鉗子で腺の端をつかみ、皮膚に添付ファイルを緩めるに鈍的切離を使用してを必要があります。腺は、皮膚から分離されている、一度アイリスはさみは残り添付ファイルをカットに使用できます。
- 70% アルコールで表面を浸漬し、滅菌器具の新しいセットを使用して組織の収穫を開始します。
- 収穫された組織は、培地のそれを配置する前に滅菌生理食塩水で洗浄です。
- 皮下腫瘍
- 多くの場合、腫瘍細胞を動物に注入され繰り返しと、結果の腫瘍は腫瘍細胞株を維持するために収穫されます。
- 皮下腫瘍の無菌組織収穫が皮膚の完全性の侵害の前に実行することが不可欠です。
- 質量がすり減りや壊死、収集組織は質の良いされず、滅菌できない場合があります。
- 体は、関心のある領域を公開する配置されます。皮膚は、腫瘍の 1 つの側面に沿って切断されます。
- 慎重に腫瘍を公開するスキンが反映されます。側に皮膚の楽器を置き、70% アルコールで露出した組織を吸収します。
- 新しい滅菌器具、基になる添付ファイルから質量を解剖し、血管の固まりを断ちます。
- 腫瘍は培養液中に配置されます。
多くの実験は、摘出組織からの細胞のコレクションを要求します。このような場合、滅菌方法で組織収穫手順を実行することが不可欠です。実施する生体外で、多くの実験細胞の組織培養研究の動物に由来する使用ことができます whichin ターン研究の動物の使用量が軽減します。
このビデオでは、無菌実験動物から一般的に摘出した臓器の収穫法について説明します。これ、異なる研究目標を達成するためにこの滅菌手法を採用いくつかの例の実験の短いレビューが続きます。
動物組織の収穫時期にスペース ・機器・人員の不稔を確保するため必要な準備中の手順から始めましょう。
層流フードでこの手順を実行するとします。、プロセスの前にフード ファン、少なくとも 15 分間実行し、地域は 70% のアルコールで消毒する必要があります。次に、フードにいくつかの紙タオルを置き、70% エタノールでウェットします。その後、滅菌装置をロードし、各計測器使用されます、通常左から右へ順に整理します。動物の死骸からの偶発的な汚染を防止する一方向性の方法で発生するワークフローが可能になります。
非滅菌の技術者が滅菌の技術者を支援するために存在することをお勧めします。両方の演算子には、マスクと、ふっくを着用しなければなりません。滅菌の技術者は、滅菌ガウンと滅菌手袋の 2 つのペアをドンする必要があります。ガウンと手袋がオープンした体腔、ペトリ皿、または生殖不能メディアに皮膚細胞の脱落を防ぐために手首をカバーする必要がありますに注意してください。
非滅菌の人は、生殖不能の人は無菌ツールを削除することができますので、内側の表面に触れることがなく滅菌器パッケージを開きます。最後に、非滅菌の技術者は、動物を euthanizes し、ペーパー タオルの上の死体の場所完全に生殖不能の人が収穫を始めることができますので、70% アルコールに浸します。
まず、腹部臓器、脾臓、肝臓、腎臓、卵巣、精巣などの抽出を検討します。
水平カット男性の包皮、女性の骨盤の骨にちょうど前方皮膚滅菌はさみと鉗子のセットを使用します。腹部の筋肉を切断を避けます。次に、カットの下に親指を置き、カットの頭蓋の端を把握します。もう一方の手を使用して、安全に保持後肢と尾、頭に向かって皮膚を引っ張りながら。
脾臓を収穫、右外側の臥床で体を配置します。脾臓は腹部の筋肉を介して表示されます。脾臓の上に直接にカットをすることはさみを使用し、優しく体から臓器を撤回します。脾臓、胃、膵臓の組織間のすべての添付ファイルをカットが、穿刺や器官を引き裂くことを避けるため。
すべての他の腹部の臓器を収穫、背臥床で体を配置します。その後、持ち上げ、腹腔内に直接開く楕円形を残して腹部の筋肉を切り取る。肝臓を収穫、横隔膜から尾の方の臓器を反映します。今はさみを使用して、2 つの構造間の膜を慎重に切断します。次に、血管を通って背骨に垂直カットをします。肝臓を持ち上げて、下にある添付ファイルを視覚化するダイヤフラムへ反映します。胃や小腸に小さな肝葉をアタッチする薄い膜があります。下側の肝臓の中心部に線維性のノードをつかんで、すべての添付ファイルを見つけるための器官。今基礎となる組織から器官を区切ります。肝臓は壊れやすい、血液の過剰なリリースで簡単にパンクすることができることに注意してください。したがって、それは注意深く扱われなければなりません。
腎臓を収穫、右腎を公開する左または左の腎臓を公開する権利、腸を押してください。今腎臓と体から臓器を削除する鉗子の下をカットするはさみを使用して下に把握する鉗子ブレードを使用します。
収穫の卵巣を子宮を視覚化するため頭側腸に移動します。卵巣は左と右子宮角に従ってください。これらの小器官でありより古い動物の彼らは脂肪に埋め込まれる可能性があります。体からそれを分離し、脂肪と卵管から無料でカットするために卵巣の下で鉗子をスライドさせます。
男性の精巣を削除、そっとつかんで鼠径の脂肪パッド、前方。これは陰嚢から精巣を引っ張ってくる。彼らは見えるようになる、一度は、陰嚢や体からこれらの構造体を解放する精管に添付ファイルをカットします。
次に、心臓や肺などの胸部臓器を収穫する方法を学びましょう。心臓と肺は最も簡単に一緒に削除されます。胸腔内を開く背臥床に動物を配置することによって開始します。まず、つかみ、剣状突起を持ち上げます。肋骨にちょうど尾側腹部の筋肉のカットを行います。横隔膜を公開、両側に胸郭の下のカーブに沿ったカットを拡張します。
次に、胸郭のそれぞれの側に可能な限り最も外側の点をカット小することによって横隔膜を穿刺します。その後、肋骨からダイヤフラムをカットします。今胸部臓器を視覚化する剣状の肋骨を持ち上げます。胸を開きに両側に胸骨の上にカット外側を拡張します。鉗子を気管に垂直に配置し、気管をしっかりと把握します。今、はさみを使って、鉗子にちょうど前方垂直カットをします。これは、気管と食道を断つ必要があります。気管のグリップをゆるめることがなく尾の方持ち上げて、胸郭肺の脊髄の表面に添付ファイルを以下略します。心臓と肺は胸部キャビティの自由を持ち上げることができるまで、繰り返します。
心だけを取り除き、器官を持ち上げて心膜嚢を慎重にカットします。次に、大動脈を鉗子で保持し、鉗子にカットを遠位。それから前方上大静脈、肺動脈、静脈を断ちます。その後、胸腔内の無料の心を解除することができます。
今、収穫している無菌技術を使用して脳の手順を確認してみましょう。脳が収集する唯一の臓器の場合、準備中の手順は、同じです。
収穫を開始、アルコールで体を飽和すると、頭蓋骨に前に - としての体から皮膚を取り除きます。これにより、このポイント前方から無菌であることすべてのため。その後、再び動物を飽和させるアルコールで取り外して外側の手袋を皮膚に使用される器械を廃棄します。うなじのところでカットし、鼻の先端に背側頸部から正中線に沿ってそれを拡張します。
今、専用滅菌脳収穫はさみのペアを使用して、頭蓋骨のベースで背骨をカットをします。頭蓋を開き、後頭ではさみの点を配置し正中線に沿ってカットします。この脳の採取術、中に 1 つの手と見なされることに把握して頭蓋骨から肌と、非滅菌滅菌手の頭蓋骨をカットに使用中に、頭を安定させるためにあごの下に反映に注意してください。その後、脳から頭頂骨をレバーにシザーの刃の平刃を使用します。また脳幹と脳の下にある視交叉神経の添付ファイルが中断、ヘラを使って慎重に。最後に、閉じ鉗子を前方にスライドし、嗅球で添付ファイルを分割します。滅菌のメディアに直接脳が頭蓋骨から削除されるが。
無菌組織収穫の要点を確認しましたところ、今、この方法では、生物医学研究の多くの用途のいくつかを説明しましょう。
神経幹の研究者は成長するこれら細胞の in vitroマウス新生児脳から組織を抽出するのに生殖不能の収穫技術を使用します。これにより、開発および癌の進行における神経幹細胞の役割を研究します。
組織の収穫を含む研究の別のアクティブな領域はメタボリック ・ プロファイリング、サンプルに異なる代謝物を分析することによって組織の生理学を勉強します。この例では、無菌テクニックを使用して、科学者は野生型および無菌マウスを用いた肝生検で採取、動物個体の肝代謝プロファイルの違いを明らかにする核磁気共鳴分光法や核磁気共鳴を使用します。
最後に、免疫は多くの場合感染の広がりを研究する無菌組織収穫を実行します。この特定の実験では、研究者は菌緑膿菌慢性肺感染症を誘発する気管内投与を実行します。
無菌技術を使用して実験動物からのティッシュを収穫にゼウスのビデオを見てきただけ。上手く収穫を通じて無菌性が維持されることを確保するために必要な手順が必要です。組織に損傷を与えずにこれらの動物からの腹部や胸部の臓器や脳を抽出することができます。いつも見てくれてありがとう!
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Applications and Summary
滅菌の器官の収穫のための手順の多くは、標準的な剖検と同じ生殖不能の技術の使用は実験手順は、摘出組織から細胞を収穫を含む価値がある組織のために不可欠。無菌性が維持されない場合、プロファイルまたは組織からの RNA の収集が危険にさらされることができます。
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References
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- Parkinson, C.M., O'Brien, A., Albers, T.M., Simon, M.A., Clifford, C.B., and Pritchett-Corning, K.R. 2011. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. 54. e2966. 1-7.
