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Colheita de tecido estéril

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidade de Notre Dame, IN

Em 1959, os 3 R's foram introduzidos por W.M.S. Russell e R.L. Burch em seu livro The Principles of Humane Experimental Technique. Os 3 R's são substituição, redução e refinamento do uso de animais em pesquisas. 1 O uso de linhas celulares e culturas teciduais originárias de animais de pesquisa é uma técnica de substituição, pois permite que muitos experimentos sejam realizados in vitro. A colheita de tecidos e órgãos para uso em culturas celulares e tecidos requer técnica asséptica para evitar a contaminação dos tecidos. A colheita estéril também é necessária para análise de proteínas e RNA e perfil metabólico de tecidos. Este manuscrito discutirá o processo de colheita de órgãos estéreis em ratos e camundongos.

Principles

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A técnica asséptica deve ser seguida para garantir a esterilidade dos tecidos. A colheita é realizada em um capô de fluxo laminar que foi desinfetado com álcool. Todos os materiais utilizados devem ser esterilizados. O técnico que realiza a colheita deve vestir equipamentos de proteção individual, incluindo máscara, bouffant, vestido cirúrgico estéril e luvas cirúrgicas estéreis. O vestido deve cobrir os pulsos para evitar o derramamento de células da pele na cavidade do corpo aberta, placas de petri ou meio estéril. Para manter a esterilidade do técnico, este procedimento requer que um segundo técnico não estéril auxilie o técnico estéril com a eutanásia dos animais.

Em experimentos que requerem os perfis metabólicos dos tecidos, o método de colheita de tecidos tem um grande impacto na qualidade dos dados coletados. 2 Tanto o procedimento de eutanásia quanto o tempo que a colheita leva podem afetar a integridade dos tecidos. A hipóxia, uma consequência da eutanásia com dióxido de carbono, tem mostrado ter um efeito profundo sobre os metabólitos nos tecidos. A hemorragia dos vasos no tecido pulmonar também é causada pelo uso de dióxido de carbono para eutanásia. A ordem de remoção do tecido quando a dissecção sequencial de tecidos direcionados é realizada pode causar alterações metabólicas, à medida que os tecidos começam a envelhecer ou decair durante a colheita.

Embora a maioria das colheitas estéreis tenha como alvo um único órgão, pode haver momentos em que mais de um órgão é necessário. Durante a dissecção sequencial, os tecidos necessários ditarão a ordem em que devem ser removidos. 2 Os tecidos que se degradam rapidamente devem ser colhidos o mais rápido possível após a eutanásia. Para manter a esterilidade dos instrumentos, os órgãos colhidos da cavidade abdominal são removidos na seguinte ordem: baço, fígado, rim, glândulas suprarrenais, ovário ou testículos, órgãos sexuais acessórios (próstata, vesículas seminal, útero, tubos de falópio), tecido pancreático, linfonodos, bexiga urinária e trato intestinal (estômago, intestino delgado e grande). A ordem da colheita do órgão da cavidade torácica é primeiro remover o coração e os pulmões seguidos pela coleta de timo, linfonodos e esôfago. 3 São necessárias luvas novas para cada rato.

Alguns dos órgãos estéreis colhidos podem precisar ser preservados. A preservação dos tecidos é realizada por congelamento de flash com nitrogênio líquido (LN2) ou com uma combinação de LN2 e 2-metilbutano. Somente para a LN2, os tecidos são enxaguados em soro fisiológico estéril, manchados em um pano absorvente estéril para esgotar o excesso de umidade, colocados em quadrados de papel alumínio estéreis, e imediatamente submersos na LN2. 2 Para espécimes imunológicos, 2-metilbutano é adicionado. O tecido está realmente submerso no 2-metilbutano que foi resfriado pela LN2. Quando os tecidos ficam brancos, eles são removidos do 2-metilbutano, colocados em embalagens estéreis, e depois colocados diretamente na LN2.

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Procedure

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1. Preparação

  1. Os materiais comumente utilizados incluem 70% de álcool em uma garrafa de esguicho, agulhas estéreis de calibre 20-25, dois pacotes de instrumentos estéreis de tesoura de íris e fórceps de polegar (um para a pele e outro para os tecidos internos), toalhas de papel, luvas de cirurgião estérei, uma placa de petri estéril, meio estéril e solução salina estéril.
  2. O ventilador do capô deve estar funcionando por pelo menos 15 minutos antes do procedimento, e deve ser desinfetado com 70% de álcool.
  3. Se o capô estiver equipado com uma lâmpada de esterilização UV, pode ser usado para desinfetar ainda mais a superfície de trabalho.
  4. Luvas limpas são usadas para a configuração do capô. O equipamento é carregado no capô na ordem em que serão usados, geralmente da esquerda para a direita. Isso permite que o trabalho seja realizado em um fluxo de trabalho unidirecional, impedindo que itens sujos contaminem itens limpos. Isso protegerá os tecidos ou órgãos colhidos da contaminação acidental das carcaças dos animais.
  5. As embalagens de instrumentos estéreis são abertas, respeitando o interior estéril das embalagens. Para manter a esterilidade, a embalagem é colocada no centro da mesa, e cada aba é aberta sem atravessar o campo estéril ou o interior da embalagem. A pessoa não-estérile abre a primeira aba superior refletindo-a para ele/ ela. Os retalhos laterais são então abertos usando as duas mãos-um em cada retalho e puxando-os para longe da embalagem. A aba final é então puxada em direção à pessoa que abre o pacote, tomando cuidado para evitar tocar em qualquer uma das superfícies internas da embalagem.
  6. Coloque as toalhas de papel no capô e molhe-as com álcool.
  7. A pessoa não-súmile vai eutanásia os animais.
  8. A pessoa estéril usa dois conjuntos de luvas cirúrgicas estéreis.
  9. A pessoa não-estéria coloca a carcaça nas toalhas de papel e encharca completamente a carcaça com 70% de álcool.
  10. Utilizando um conjunto de tesouras estéreis e fórceps, faça um corte horizontal na pele apenas antes do prepuce (em machos) ou do osso pélvico (em fêmeas). Evite cortar a musculatura abdominal.
  11. Coloque os instrumentos de lado.

2. Colhendo tecidos

  1. Faça um pequeno corte apenas anterior à pelve em fêmeas e acima do prepuce em machos.
  2. Coloque o polegar sob o corte e segure a borda craniana do corte. Usando a outra mão, segure com segurança os membros traseiros e a cauda enquanto puxa a pele em direção à cabeça.
  3. A pele se afastará do corpo logo acima dos membros traseiros e pode ser virada do avesso sobre a cabeça e as patas dianteiras. Isso remove efetivamente contaminantes capilares durante a colheita de órgãos.
  4. Mergulhe o corpo novamente com 70% de álcool, e remova o par superficial de luvas que não são mais estéreis.
  5. Abra a cavidade abdominal usando instrumentos estéreis.
    1. Baço
      1. Para colher o baço, o corpo está posicionado na recumbência lateral direita.
      2. O baço pode ser visualizado através do músculo abdominal.
      3. Um corte de tesoura é feito diretamente sobre o baço.
      4. O baço é suavemente retirado da cavidade corporal.
      5. Ao cortar todos os acessórios entre o baço, estômago e tecido pancreático, evite perfurar ou rasgar o órgão.
    2. Fígado
      1. Para colher qualquer outro órgão abdominal, o corpo é colocado em recumbência dorsal.
      2. O músculo abdominal é levantado e cortado, deixando uma abertura oval diretamente sobre a cavidade abdominal.
      3. Depois de expor a cavidade abdominal, reflita o fígado caudalmente longe do diafragma.
      4. Corte cuidadosamente todas as membranas que ligem o fígado ao diafragma.
      5. Faça um corte perpendicular à coluna através dos vasos sanguíneos visíveis entre o fígado e o diafragma.
      6. Levante o fígado e reflita-o em direção ao diafragma para visualizar os acessórios abaixo dele.
      7. Haverá membranas finas ligando os lóbulos menores do fígado ao estômago e intestino delgado, que precisarão ser interrompidos.
      8. Segure o nódulo fibroso no centro do fígado na parte inferior, e levante o órgão para encontrar todos os acessórios. Separe o fígado dos órgãos e tecidos subjacentes.
      9. Note que o fígado é frágil e pode ser facilmente perfurado, resultando na liberação de sangue; portanto, deve ser manuseado com cuidado.
    3. Rins
      1. Depois de expor a cavidade abdominal, empurre os intestinos para a esquerda para visualizar o rim direito, ou para a direita para visualizar o rim esquerdo.
      2. Para remover o rim, use lâminas fórceps para agarrar sob o rim para isolar o órgão do corpo. Usando uma tesoura ou uma lâmina de bisturi, corte o rim longe do corpo. Faça o corte sob os fórceps para evitar danificar o rim.
      3. Uma vez que o rim é removido, qualquer gordura pode ser aparada do órgão.
    4. Ovário
      1. Depois de expor a cavidade abdominal, mova os intestinos cranialmente para visualizar o útero.
      2. Siga a esquerda, e depois a direita, chifres do útero até os ovários.
      3. Os ovários são pequenos. Em animais mais velhos, eles podem ser embutidos em gordura.
      4. Deslize os fórceps sob o ovário para isolá-lo do corpo, e cortá-lo livre da gordura e do tubo de falópio.
    5. Testículos
      1. Depois de abrir a cavidade abdominal, segure suavemente a almofada de gordura inguinal e puxe-a anteriormente.
      2. Isso vai puxar o testis do escroto.
      3. Uma vez que o testíase é exposto, corte os acessórios ao escroto e o vas defere para libertá-lo do corpo.
      4. Isso é feito para cada teste.
  6. A cavidade torácica é aberta para remover os órgãos torácculas
    1. O corpo é colocado em recumbência dorsal. É imperativo que a pele se reflita bem acima da cabeça se os órgãos da cavidade torácica forem colhidos.
    2. Segure o processo xifoide e levante para permitir um corte através do músculo abdominal apenas caudal para as costelas. Estenda o corte ao longo da curva inferior da caixa torácica em ambos os lados. Isso permitirá a visualização do diafragma.
    3. Puna o diafragma fazendo um pequeno corte na caixa torácica no ponto mais lateral possível de cada lado. Corte o diafragma longe das costelas.
    4. Levante as costelas no xifoide para visualizar os órgãos torácicos.
    5. Estenda o corte lateral até o topo do esterno em ambos os lados, e abra o peito.
    6. O coração e os pulmões são mais facilmente removidos juntos.
      1. Coloque os fórceps perpendiculares à traqueia, e segure a traqueia firmemente.
      2. Usando a tesoura, faça um corte perpendicular à traqueia antes das fórceps. Este corte deve cortar a traqueia e o esôfago.
      3. Sem afrouxar o aperto na traqueia, levante a traqueia para cima e caudally. Corte qualquer ligação dos pulmões à superfície espinhal na caixa torácica.
      4. O esôfago pode precisar ser cortado para ser capaz de levantar o coração e os pulmões livres da cavidade torácica.
    7. Somente coração
      1. Levante o coração e corte cuidadosamente o saco pericárdico.
      2. A aorta está no aspecto craniano do coração à esquerda do animal.
      3. Segurando a aorta com os fórceps, faça um corte distal nos fórceps, mantendo um porão na aorta e no coração.
      4. Segure a aorta enquanto você corta a veia cava anterior e artérias pulmonares e veias.
      5. Levante o coração livre da cavidade torácica pela artéria aórtica.
    8. Outros órgãos torácciis
      1. Os órgãos são colhidos na seguinte ordem para manter a esterilidade dos instrumentos: timo, linfonodos e esôfago.
  7. Cérebro
    1. Em circunstâncias especiais, o cérebro precisará ser colhido para cultura estéril.
    2. O cérebro é colhido por último após qualquer outra colheita de órgãos.
    3. Nos casos em que o cérebro é o único órgão a ser coletado, a pele não é retirada do corpo, mas sim um corte é feito na nuca e estendido ao longo da linha média da área cervical dorsal até a ponta do nariz.
    4. Depois de puxar a pele para longe do crânio lateralmente, o osso exposto é encharcado com 70% de álcool e as luvas superiores sujas são removidas.
    5. Usando um par dedicado de tesouras de colheita cerebral estéreis, faça um corte na coluna na base do crânio.
    6. Abra o crânio colocando o ponto da tesoura no forame magnum e cortando ao longo da linha média.
    7. Use a extremidade plana da lâmina da tesoura para afastar os ossos parietal do cérebro.
    8. Interrompa cuidadosamente os apegos nervosos no tronco cerebral, e o quiasmo óptico sob o cérebro, usando o ponto fechado de fórceps do polegar.
    9. Da mesma forma, deslize os fórceps fechados anteriormente sob o cérebro e quebre os acessórios nas lâmpadas olfativas.
    10. O cérebro pode então ser jogado do crânio em meio estéril.
    11. Ao colher o cérebro, uma mão será considerada não-estérile, pois agarra a pele do crânio refletida sob o queixo para estabilizar a cabeça, enquanto o crânio é cortado e o cérebro removido.
  8. Pele
    1. Tecido mamário
      1. O tecido mamário é encontrado desde o topo do esterno no manúbrio até a abertura genital na superfície ventral, e estende-se lateralmente para ambos os lados, quase tocando na superfície dorsal nos quadris e ombros.
      2. Examine o tecido mamário para procurar massas, descoloração ou anormalidades. Lactante ou fêmeas grávidas terão aumento do volume de tecido mamário, e o leite pode estar presente.
      3. A excisão das glândulas mamárias requer agarrar a borda da glândula com fórceps do polegar e usar dissecção contundente para afrouxar os apegos à pele. Uma vez que a glândula tenha sido separada da pele, a tesoura de íris pode ser usada para cortar quaisquer acessórios restantes.
      4. Mergulhe as superfícies expostas com 70% de álcool e comece a colheita de tecidos usando um novo conjunto de instrumentos estéreis.
      5. O tecido colhido é enxaguado com soro fisiológico estéril antes de colocá-lo em meio de cultura.
    2. Tumores subcutâneos
      1. Muitas vezes, as células tumorais são repetidamente implantadas em animais, e então o tumor resultante é colhido para manter a linha celular tumoral.
      2. É imprescindível que a colheita estéril de tecidos de tumores subcutâneos seja realizada antes da violação da integridade da pele.
      3. Se a massa tiver abrado ou for necrótica, o tecido coletado não será de boa qualidade e pode não ser estéril.
      4. O corpo está posicionado para expor a área de interesse. A pele é cortada ao longo de um lado do tumor.
      5. Reflita cuidadosamente a pele para expor o tumor. Coloque os instrumentos de pele para o lado e mergulhe os tecidos expostos com 70% de álcool.
      6. Com novos instrumentos estéreis, disseque a massa dos acessórios subjacentes e corte todos os vasos sanguíneos que alimentem a massa.
      7. O tumor é então colocado em meio de cultura.

Muitos experimentos exigem a coleta de células do tecido excisado. Nesses casos, é imprescindível que o procedimento de colheita de tecidos seja realizado de forma estéril. O uso de linhas celulares e culturas teciduais originárias de animais de pesquisa permite que muitos experimentos sejam realizados in vitro,o que, por sua vez, reduz o uso animal em pesquisas.

Neste vídeo, discutiremos o método asséptico para a colheita de órgãos comumente extraídos de animais de laboratório. E isso será seguido por uma breve revisão de alguns exemplos de experimentos que empregam essa técnica estéril para alcançar diferentes objetivos de pesquisa.

Vamos começar com os passos de preparação necessários para garantir a esterilidade do espaço, instrumentos e pessoal durante a colheita de tecidos animais.

Este procedimento é realizado em um capô de fluxo laminar. Antes do processo, o ventilador do capô deve funcionar por pelo menos 15 minutos e a área deve ser desinfetada com 70% de álcool. Em seguida, coloque algumas toalhas de papel no capô e molhe-as com 70% de etanol. Depois disso, carregue o equipamento estéril e organize-se pela ordem em que cada instrumento será utilizado, geralmente da esquerda para a direita. Isso permite que o fluxo de trabalho ocorra de forma unidirecional, evitando contaminação acidental da carcaça animal.

Recomenda-se que um técnico não estéril esteja presente para auxiliar o técnico estéril. Ambos os operadores devem usar uma máscara e um bouffant. O técnico estéril deve vestir um vestido estéril e dois pares de luvas cirúrgicas estéreis. Observe que o vestido e as luvas devem cobrir os pulsos para evitar o derramamento de células da pele na cavidade corporal aberta, placas de petri ou mídia estéril.

A pessoa não estéril abre a embalagem do instrumento estéril sem tocar na superfície interna, para que a pessoa estéril possa remover a ferramenta asepticamente. Por fim, o técnico não estéril eutanásia o animal, coloca a carcaça sobre as toalhas de papel e a encharca completamente com 70% de álcool, para que a pessoa estéril possa começar a colheita.

Primeiro, vamos rever a extração de órgãos abdominais, incluindo o baço, fígado, rins, ovários e testículos.

Usando um conjunto de tesouras estéreis e fórceps fazem um corte horizontal na pele apenas antes do prepuce em machos e o osso pélvico em fêmeas. Evite cortar a musculatura abdominal. Em seguida, coloque o polegar sob o corte e segure a borda craniana do corte. Usando a outra mão, segure com segurança os membros traseiros e a cauda, enquanto puxa a pele em direção à cabeça. A pele se afastará do corpo logo acima dos membros traseiros, e pode ser virada do avesso sobre a cabeça e as patas dianteiras. Isso remove efetivamente contaminantes capilares que podem interferir na colheita estéril de órgãos. Em seguida, mergulhe o corpo novamente com 70% de álcool e remova o par superficial de luvas, que não são mais estéreis. Descarte também todos os instrumentos utilizados na pele.

Para colher o baço, posicione o corpo na recência lateral direita. O baço deve ser visível através do músculo abdominal. Use uma tesoura para fazer um corte diretamente sobre o baço, e retire suavemente o órgão da cavidade corporal. Corte todos os acessórios entre o baço e o estômago e o tecido pancreático, mas evite perfurar ou rasgar o órgão.

Para colher todos os outros órgãos abdominais, coloque o corpo em recumedência dorsal. Em seguida, levante e corte o músculo abdominal deixando uma abertura oval diretamente sobre a cavidade abdominal. Para colher o fígado, reflita o órgão caudally longe do diafragma. Agora use uma tesoura para cortar cuidadosamente qualquer membrana entre as duas estruturas. Em seguida, faça um corte perpendicular à coluna através dos vasos sanguíneos. Em seguida, levante o fígado e reflita-o em direção ao diafragma para visualizar os acessórios abaixo dele. Haverá membranas finas ligando os lóbulos menores do fígado ao estômago e intestino delgado. Segure o nódulo fibroso no centro do fígado na parte inferior e levante o órgão para encontrar todos os acessórios. Agora separe o órgão dos tecidos subjacentes. Note que o fígado é frágil e pode ser facilmente perfurado resultando em liberação excessiva de sangue. Portanto, deve ser manuseado com cuidado.

Para colher os rins, empurre os intestinos para a esquerda para expor o rim direito ou à direita para expor o rim esquerdo. Agora use as lâminas fórceps para agarrar sob o rim e usando uma tesoura cortada sob os fórceps, removendo o órgão do corpo.

Para colher os ovários, mova os intestinos cranialmente para visualizar o útero. Siga os chifres uterinos esquerdo e direito até os ovários. Estes são órgãos pequenos e em animais mais velhos eles podem ser embutidos em gordura. Deslize os fórceps sob o ovário para isolá-lo do corpo e cortá-lo livre da gordura e do tubo de falópio.

No macho, para remover testículos, segure suavemente a almofada de gordura inguinal e puxe anteriormente. Isso vai puxar o testis do escroto. Uma vez que eles se tornam visíveis, corte os anexos ao escroto e o vas defere para libertar essas estruturas do corpo.

Em seguida, vamos aprender a colher órgãos torácciis, como o coração e os pulmões. O coração e os pulmões são mais facilmente removidos juntos. Para abrir a cavidade torácica, comece colocando o animal em recumbência dorsal. Primeiro, agarre e levante o processo xifoide. Em seguida, faça um corte através do músculo abdominal apenas caudal para as costelas. Estenda o corte ao longo da curva inferior da caixa torácica em ambos os lados, expondo o diafragma.

Em seguida, puna o diafragma fazendo um pequeno corte na caixa torácica no ponto mais lateral possível de cada lado. Em seguida, corte o diafragma longe das costelas. Agora levante as costelas no xiphoide para visualizar os órgãos toráccios. Estenda o corte lateral até o topo do esterno em ambos os lados para abrir o peito. Em seguida, coloque os fórceps perpendiculares à traqueia e segure firmemente a traqueia. Agora, usando uma tesoura, faça um corte perpendicular apenas antes dos fórceps. Isso deve cortar a traqueia e o esôfago. Sem afrouxar o aperto na traqueia, levante-a caudally e corte qualquer apego dos pulmões à superfície espinhal na caixa torácica. Continue até que você seja capaz de levantar o coração e os pulmões livres da cavidade torácica.

Para remover apenas o coração, levante o órgão e corte cuidadosamente através do saco pericárdio. Em seguida, segure a aorta com os fórceps e faça um corte distal para os fórceps. Em seguida, corte a veia cava anterior, artérias pulmonares e veias. Depois disso, você deve ser capaz de levantar o coração livre da cavidade torácica.

Agora, vamos rever o procedimento de colheita do cérebro usando técnica asséptica. Nos casos em que o cérebro é o único órgão a ser coletado, os passos de preparação são os mesmos.

Para começar a colheita, saturar o corpo com álcool, e tirar a pele do corpo como antes. Isso permite que tudo seja estéril daqui para frente. Em seguida, saturar o animal novamente com álcool, remover as luvas externas e descartar os instrumentos usados na pele. Agora faça um corte na nuca e estenda-a ao longo da linha média da área cervical dorsal até a ponta do nariz.

Agora, usando um par dedicado de tesouras de colheita cerebral estérei, faça um corte na coluna vertebral na base do crânio. Para abrir o crânio, coloque o ponto da tesoura no forames magnum e corte ao longo da linha média. Note que durante este procedimento de colheita cerebral, uma mão é considerada não estéril, pois agarra a pele do crânio refletida sob o queixo para estabilizar a cabeça, enquanto a mão estéril está sendo usada para cortar o crânio. Depois disso, use a borda plana da lâmina da tesoura para afastar os ossos parietal do cérebro. E usando a espátula, interrompa cuidadosamente os apegos nervosos no tronco cerebral e o quiasmo óptico sob o cérebro. Por fim, deslize as fórceps fechadas anteriormente e quebre os acessórios nas lâmpadas olfativas. E o cérebro pode ser jogado do crânio diretamente na mídia estéril.

Agora que revisamos o essencial da colheita de tecidos estéreis, vamos discutir alguns dos muitos usos deste procedimento em pesquisas biomédicas.

Pesquisadores de troncos neurais usam técnica de colheita estéril para extrair tecido do cérebro neonatal do camundongo, para cultivar essas células in vitro. Isso permite que eles estudem o papel das células-tronco neurais no desenvolvimento e a progressão do câncer.

Outra área ativa de pesquisa que envolve a colheita de tecidos é o perfil metabólico, que envolve estudar a fisiologia tecidual analisando os diferentes metabólitos em uma amostra. Neste exemplo, os cientistas, usando a técnica asséptica, coletaram biópsias hepáticas de camundongos selvagens e sem germes e usaram espectroscopia de ressonância magnética nuclear, ou RMN, para elucidar a diferença no perfil metabólico do fígado das duas populações animais.

Por fim, os imunologistas frequentemente realizam a colheita de tecidos estéreis para estudar a propagação da infecção. Neste experimento em particular, os pesquisadores realizaram injeção intratraqueal de bactérias Pseudomonas aeruginosa para induzir infecção pulmonar crônica. Depois disso, os animais foram eutanizados e os pulmões foram extraídos utilizando técnica asséptica para determinar a carga bacteriana aos 3, 7, 14 e 28 dias após a infecção.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre a colheita de tecidos de animais de laboratório usando técnica asséptica. Agora você deve ter uma melhor noção dos passos que você precisa tomar para garantir que a esterilidade seja mantida durante toda a colheita. E você deve ser capaz de extrair os órgãos abdominais e torácicas, e cérebros desses animais sem causar nenhum dano ao tecido. Como sempre, obrigado por assistir!

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Applications and Summary

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Embora muitos dos procedimentos para a colheita de órgãos estéreis sejam semelhantes a uma necropsia padrão, o uso de técnica estéril é imperativo para que os tecidos sejam de valor para procedimentos experimentais, que incluem a colheita de células dos tecidos excisados. O perfil ou a coleta de RNA de tecidos podem ser comprometidos se a esterilidade não for mantida.

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References

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  3. Parkinson, C.M., O'Brien, A., Albers, T.M., Simon, M.A., Clifford, C.B., and Pritchett-Corning, K.R. 2011. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. 54. e2966. 1-7.

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