Colheita de tecido estéril

A técnica asséptica deve ser seguida para garantir a esterilidade dos tecidos. A colheita é realizada em um capô de fluxo laminar que foi desinfetado com álcool. Todos os materiais utilizados devem ser esterilizados. O técnico que realiza a colheita deve vestir equipamentos de proteção individual, incluindo máscara, bouffant, vestido cirúrgico estéril e luvas cirúrgicas estéreis. O vestido deve cobrir os pulsos para evitar o derramamento de células da pele na cavidade do corpo aberta, placas de petri ou meio estéril. Para manter a esterilidade do técnico, este procedimento requer que um segundo técnico não estéril auxilie o técnico estéril com a eutanásia dos animais.

Em experimentos que requerem os perfis metabólicos dos tecidos, o método de colheita de tecidos tem um grande impacto na qualidade dos dados coletados. ² Tanto o procedimento de eutanásia quanto o tempo que a colheita leva podem afetar a integridade dos tecidos. A hipóxia, uma consequência da eutanásia com dióxido de carbono, tem mostrado ter um efeito profundo sobre os metabólitos nos tecidos. A hemorragia dos vasos no tecido pulmonar também é causada pelo uso de dióxido de carbono para eutanásia. A ordem de remoção do tecido quando a dissecção sequencial de tecidos direcionados é realizada pode causar alterações metabólicas, à medida que os tecidos começam a envelhecer ou decair durante a colheita.

Embora a maioria das colheitas estéreis tenha como alvo um único órgão, pode haver momentos em que mais de um órgão é necessário. Durante a dissecção sequencial, os tecidos necessários ditarão a ordem em que devem ser removidos. ² Os tecidos que se degradam rapidamente devem ser colhidos o mais rápido possível após a eutanásia. Para manter a esterilidade dos instrumentos, os órgãos colhidos da cavidade abdominal são removidos na seguinte ordem: baço, fígado, rim, glândulas suprarrenais, ovário ou testículos, órgãos sexuais acessórios (próstata, vesículas seminal, útero, tubos de falópio), tecido pancreático, linfonodos, bexiga urinária e trato intestinal (estômago, intestino delgado e grande). A ordem da colheita do órgão da cavidade torácica é primeiro remover o coração e os pulmões seguidos pela coleta de timo, linfonodos e esôfago. ³ São necessárias luvas novas para cada rato.

Alguns dos órgãos estéreis colhidos podem precisar ser preservados. A preservação dos tecidos é realizada por congelamento de flash com nitrogênio líquido (LN₂) ou com uma combinação de LN₂ e 2-metilbutano. Somente para a LN_2, os tecidos são enxaguados em soro fisiológico estéril, manchados em um pano absorvente estéril para esgotar o excesso de umidade, colocados em quadrados de papel alumínio estéreis, e imediatamente submersos na LN₂. ² Para espécimes imunológicos, 2-metilbutano é adicionado. O tecido está realmente submerso no 2-metilbutano que foi resfriado pela LN₂. Quando os tecidos ficam brancos, eles são removidos do 2-metilbutano, colocados em embalagens estéreis, e depois colocados diretamente na LN₂.

1. Preparação

1. Os materiais comumente utilizados incluem 70% de álcool em uma garrafa de esguicho, agulhas estéreis de calibre 20-25, dois pacotes de instrumentos estéreis de tesoura de íris e fórceps de polegar (um para a pele e outro para os tecidos internos), toalhas de papel, luvas de cirurgião estérei, uma placa de petri estéril, meio estéril e solução salina estéril.
2. O ventilador do capô deve estar funcionando por pelo menos 15 minutos antes do procedimento, e deve ser desinfetado com 70% de álcool.
3. Se o capô estiver equipado com uma lâmpada de esterilização UV, pode ser usado para desinfetar ainda mais a superfície de trabalho.
4. Luvas limpas são usadas para a configuração do capô. O equipamento é carregado no capô na ordem em que serão usados, geralmente da esquerda para a direita. Isso permite que o trabalho seja realizado em um fluxo de trabalho unidirecional, impedindo que itens sujos contaminem itens limpos. Isso protegerá os tecidos ou órgãos colhidos da contaminação acidental das carcaças dos animais.
5. As embalagens de instrumentos estéreis são abertas, respeitando o interior estéril das embalagens. Para manter a esterilidade, a embalagem é colocada no centro da mesa, e cada aba é aberta sem atravessar o campo estéril ou o interior da embalagem. A pessoa não-estérile abre a primeira aba superior refletindo-a para ele/ ela. Os retalhos laterais são então abertos usando as duas mãos-um em cada retalho e puxando-os para longe da embalagem. A aba final é então puxada em direção à pessoa que abre o pacote, tomando cuidado para evitar tocar em qualquer uma das superfícies internas da embalagem.
6. Coloque as toalhas de papel no capô e molhe-as com álcool.
7. A pessoa não-súmile vai eutanásia os animais.
8. A pessoa estéril usa dois conjuntos de luvas cirúrgicas estéreis.
9. A pessoa não-estéria coloca a carcaça nas toalhas de papel e encharca completamente a carcaça com 70% de álcool.
10. Utilizando um conjunto de tesouras estéreis e fórceps, faça um corte horizontal na pele apenas antes do prepuce (em machos) ou do osso pélvico (em fêmeas). Evite cortar a musculatura abdominal.
11. Coloque os instrumentos de lado.

2. Colhendo tecidos

1. Faça um pequeno corte apenas anterior à pelve em fêmeas e acima do prepuce em machos.
2. Coloque o polegar sob o corte e segure a borda craniana do corte. Usando a outra mão, segure com segurança os membros traseiros e a cauda enquanto puxa a pele em direção à cabeça.
3. A pele se afastará do corpo logo acima dos membros traseiros e pode ser virada do avesso sobre a cabeça e as patas dianteiras. Isso remove efetivamente contaminantes capilares durante a colheita de órgãos.
4. Mergulhe o corpo novamente com 70% de álcool, e remova o par superficial de luvas que não são mais estéreis.
5. Abra a cavidade abdominal usando instrumentos estéreis.
   1. Baço
      1. Para colher o baço, o corpo está posicionado na recumbência lateral direita.
      2. O baço pode ser visualizado através do músculo abdominal.
      3. Um corte de tesoura é feito diretamente sobre o baço.
      4. O baço é suavemente retirado da cavidade corporal.
      5. Ao cortar todos os acessórios entre o baço, estômago e tecido pancreático, evite perfurar ou rasgar o órgão.
   2. Fígado
      1. Para colher qualquer outro órgão abdominal, o corpo é colocado em recumbência dorsal.
      2. O músculo abdominal é levantado e cortado, deixando uma abertura oval diretamente sobre a cavidade abdominal.
      3. Depois de expor a cavidade abdominal, reflita o fígado caudalmente longe do diafragma.
      4. Corte cuidadosamente todas as membranas que ligem o fígado ao diafragma.
      5. Faça um corte perpendicular à coluna através dos vasos sanguíneos visíveis entre o fígado e o diafragma.
      6. Levante o fígado e reflita-o em direção ao diafragma para visualizar os acessórios abaixo dele.
      7. Haverá membranas finas ligando os lóbulos menores do fígado ao estômago e intestino delgado, que precisarão ser interrompidos.
      8. Segure o nódulo fibroso no centro do fígado na parte inferior, e levante o órgão para encontrar todos os acessórios. Separe o fígado dos órgãos e tecidos subjacentes.
      9. Note que o fígado é frágil e pode ser facilmente perfurado, resultando na liberação de sangue; portanto, deve ser manuseado com cuidado.
   3. Rins
      1. Depois de expor a cavidade abdominal, empurre os intestinos para a esquerda para visualizar o rim direito, ou para a direita para visualizar o rim esquerdo.
      2. Para remover o rim, use lâminas fórceps para agarrar sob o rim para isolar o órgão do corpo. Usando uma tesoura ou uma lâmina de bisturi, corte o rim longe do corpo. Faça o corte sob os fórceps para evitar danificar o rim.
      3. Uma vez que o rim é removido, qualquer gordura pode ser aparada do órgão.
   4. Ovário
      1. Depois de expor a cavidade abdominal, mova os intestinos cranialmente para visualizar o útero.
      2. Siga a esquerda, e depois a direita, chifres do útero até os ovários.
      3. Os ovários são pequenos. Em animais mais velhos, eles podem ser embutidos em gordura.
      4. Deslize os fórceps sob o ovário para isolá-lo do corpo, e cortá-lo livre da gordura e do tubo de falópio.
   5. Testículos
      1. Depois de abrir a cavidade abdominal, segure suavemente a almofada de gordura inguinal e puxe-a anteriormente.
      2. Isso vai puxar o testis do escroto.
      3. Uma vez que o testíase é exposto, corte os acessórios ao escroto e o vas defere para libertá-lo do corpo.
      4. Isso é feito para cada teste.
6. A cavidade torácica é aberta para remover os órgãos torácculas
   1. O corpo é colocado em recumbência dorsal. É imperativo que a pele se reflita bem acima da cabeça se os órgãos da cavidade torácica forem colhidos.
   2. Segure o processo xifoide e levante para permitir um corte através do músculo abdominal apenas caudal para as costelas. Estenda o corte ao longo da curva inferior da caixa torácica em ambos os lados. Isso permitirá a visualização do diafragma.
   3. Puna o diafragma fazendo um pequeno corte na caixa torácica no ponto mais lateral possível de cada lado. Corte o diafragma longe das costelas.
   4. Levante as costelas no xifoide para visualizar os órgãos torácicos.
   5. Estenda o corte lateral até o topo do esterno em ambos os lados, e abra o peito.
   6. O coração e os pulmões são mais facilmente removidos juntos.
      1. Coloque os fórceps perpendiculares à traqueia, e segure a traqueia firmemente.
      2. Usando a tesoura, faça um corte perpendicular à traqueia antes das fórceps. Este corte deve cortar a traqueia e o esôfago.
      3. Sem afrouxar o aperto na traqueia, levante a traqueia para cima e caudally. Corte qualquer ligação dos pulmões à superfície espinhal na caixa torácica.
      4. O esôfago pode precisar ser cortado para ser capaz de levantar o coração e os pulmões livres da cavidade torácica.
   7. Somente coração
      1. Levante o coração e corte cuidadosamente o saco pericárdico.
      2. A aorta está no aspecto craniano do coração à esquerda do animal.
      3. Segurando a aorta com os fórceps, faça um corte distal nos fórceps, mantendo um porão na aorta e no coração.
      4. Segure a aorta enquanto você corta a veia cava anterior e artérias pulmonares e veias.
      5. Levante o coração livre da cavidade torácica pela artéria aórtica.
   8. Outros órgãos torácciis
      1. Os órgãos são colhidos na seguinte ordem para manter a esterilidade dos instrumentos: timo, linfonodos e esôfago.
7. Cérebro
   1. Em circunstâncias especiais, o cérebro precisará ser colhido para cultura estéril.
   2. O cérebro é colhido por último após qualquer outra colheita de órgãos.
   3. Nos casos em que o cérebro é o único órgão a ser coletado, a pele não é retirada do corpo, mas sim um corte é feito na nuca e estendido ao longo da linha média da área cervical dorsal até a ponta do nariz.
   4. Depois de puxar a pele para longe do crânio lateralmente, o osso exposto é encharcado com 70% de álcool e as luvas superiores sujas são removidas.
   5. Usando um par dedicado de tesouras de colheita cerebral estéreis, faça um corte na coluna na base do crânio.
   6. Abra o crânio colocando o ponto da tesoura no forame magnum e cortando ao longo da linha média.
   7. Use a extremidade plana da lâmina da tesoura para afastar os ossos parietal do cérebro.
   8. Interrompa cuidadosamente os apegos nervosos no tronco cerebral, e o quiasmo óptico sob o cérebro, usando o ponto fechado de fórceps do polegar.
   9. Da mesma forma, deslize os fórceps fechados anteriormente sob o cérebro e quebre os acessórios nas lâmpadas olfativas.
   10. O cérebro pode então ser jogado do crânio em meio estéril.
   11. Ao colher o cérebro, uma mão será considerada não-estérile, pois agarra a pele do crânio refletida sob o queixo para estabilizar a cabeça, enquanto o crânio é cortado e o cérebro removido.
8. Pele
   1. Tecido mamário
      1. O tecido mamário é encontrado desde o topo do esterno no manúbrio até a abertura genital na superfície ventral, e estende-se lateralmente para ambos os lados, quase tocando na superfície dorsal nos quadris e ombros.
      2. Examine o tecido mamário para procurar massas, descoloração ou anormalidades. Lactante ou fêmeas grávidas terão aumento do volume de tecido mamário, e o leite pode estar presente.
      3. A excisão das glândulas mamárias requer agarrar a borda da glândula com fórceps do polegar e usar dissecção contundente para afrouxar os apegos à pele. Uma vez que a glândula tenha sido separada da pele, a tesoura de íris pode ser usada para cortar quaisquer acessórios restantes.
      4. Mergulhe as superfícies expostas com 70% de álcool e comece a colheita de tecidos usando um novo conjunto de instrumentos estéreis.
      5. O tecido colhido é enxaguado com soro fisiológico estéril antes de colocá-lo em meio de cultura.
   2. Tumores subcutâneos
      1. Muitas vezes, as células tumorais são repetidamente implantadas em animais, e então o tumor resultante é colhido para manter a linha celular tumoral.
      2. É imprescindível que a colheita estéril de tecidos de tumores subcutâneos seja realizada antes da violação da integridade da pele.
      3. Se a massa tiver abrado ou for necrótica, o tecido coletado não será de boa qualidade e pode não ser estéril.
      4. O corpo está posicionado para expor a área de interesse. A pele é cortada ao longo de um lado do tumor.
      5. Reflita cuidadosamente a pele para expor o tumor. Coloque os instrumentos de pele para o lado e mergulhe os tecidos expostos com 70% de álcool.
      6. Com novos instrumentos estéreis, disseque a massa dos acessórios subjacentes e corte todos os vasos sanguíneos que alimentem a massa.
      7. O tumor é então colocado em meio de cultura.

Embora muitos dos procedimentos para a colheita de órgãos estéreis sejam semelhantes a uma necropsia padrão, o uso de técnica estéril é imperativo para que os tecidos sejam de valor para procedimentos experimentais, que incluem a colheita de células dos tecidos excisados. O perfil ou a coleta de RNA de tecidos podem ser comprometidos se a esterilidade não for mantida.