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Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung von Abdominalaortenaneurysmen
 

Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung von Abdominalaortenaneurysmen

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Die Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung ist eine optische Technik, bei der fluoreszierende Sonden komplexe biomolekulare Baugruppen in Geweben visualisiert werden. Diese nichtinvasive bildgebende Technik, die auch als NIRF bekannt ist, ist schnell und erfordert keine ionisierende Strahlung.

In NIRF können fluoreszierende Sonden mit kleinen Molekülen konjugiert werden, um krebs- und herzkargherzische Erkrankungen zu untersuchen. Sie werden durch Nahinfrarotlicht angeregt, das tief in das Gewebe eindringt und verwendet werden kann, um gesundes Gewebe aus krankem Gewebe abzuleiten, das die Konzentration dieser Zielmoleküle verändert.

Dieses Video wird die Prinzipien der Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung sowie die Durchführung von In-vivo- und Ex-vivo-Experimenten bei Kleintieren zur Untersuchung einer Vielzahl von Krankheiten veranschaulichen.

Wie der Name schon sagt, nutzt die Nahinfrarotfluoreszenz-Bildgebung Licht innerhalb des ersten Nahinfrarotfensters, das von 650 Nanometern bis 900 Nanometer reicht, um Photonen in das Gewebe zu liefern. Zielspezifische fluoreszierende Moleküle, sogenannte Fluorophore, werden in der Regel durch Gentechnik oder Injektion vor der Bildgebung in ein Tier eingeführt.

Diese Fluorophore absorbieren Photonenenergie, die die Energie der Moleküle vom Bodenzustand S0 in den instabilen angeregten Zustand S1 prime hebt. Da dieser Zustand instabil ist, werden sich die Moleküle auf das niedrigste Schwingungsenergieniveau innerhalb des angeregten Zustands entspannen und ihre Energie in Form von Wärme freisetzen. Die Fluorophore, die sich nun im entspannten aufgeregten Zustand S1 befinden, kehren dann in den Bodenzustand zurück und emittieren Licht einer bestimmten Wellenlänge.

Dieses Licht hat eine längere Wellenlänge als das Licht, das ursprünglich in das Fluorophor eingeführt wurde, aufgrund der Energie, die sich in Form von Wärme ableitet, während sich das Molekül auf das niedrigste Schwingungsenergieniveau entspannt. Das emittierte Licht wird dann mit einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem erfasst und aufgezeichnet.

Ein Diagramm der Absorptions- und Emissionsspektren für das Fluorophor zeigt den Wellenlängenbereich, den das Fluorophor aufnehmen und emittieren kann. Diese grundlegende Verschiebung, die den Unterschied in Nanometern zwischen der Spitzenabsorption und den Spitzenemissionswellenlängen darstellt, wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet. Jedes Fluorophor verfügt über eine eigene Stokes-Verschiebung, die es ermöglicht, das Emissionslicht vom spannenden Licht zu unterscheiden und bildgebende Verfahren wie NIRF zu ermöglichen.

Nachdem wir die wichtigsten Prinzipien der Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebung überprüft haben, gehen wir nun durch das Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ein Tier vorzubereiten und abzubilden.

Verwenden Sie zunächst eine faseroptische Lichtführung, um eine lichtoptische Lichtquelle mit dem Fluoreszenz-Bildgebungssystem zu verbinden. Wählen Sie den Anregungsfilter aus, der dem Anregungsspektrum der fluoreszenz entspricht, die in die Probe eingeführt werden soll, um sicherzustellen, dass die richtige Wellenlänge des Lichts geliefert wird.

Wählen Sie als Nächstes den geeigneten Emissionsfilter aus, um dem Emissionsspektrum des Fluorophors zu entsprechen, der unerwünschte Spektralkomponenten blockiert, die der Autofluoreszenz zugeschrieben werden können.

Um mit der Vorbereitung auf die In-vivo-Bildgebung zu beginnen, verwenden Sie Isofluran, um das Tier in einer Knockdown-Kammer zu beanten. Übertragen Sie das Tier auf einen Nasenkegel, der auf der Bildstufe fixiert ist. Befestigen Sie die Pfoten des Tieres, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Tragen Sie eine Enthaarungscreme auf, um das Haar aus dem Interessenbereich zu entfernen. Dann tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf, um das Trocknen der Hornhaut zu verhindern.

Anschließend injizieren Sie die aktivierbare fluoreszierende molekulare Sonde in das Tier. Um mit der Bildaufnahme zu beginnen, öffnen Sie die Software für molekulare Bildgebung. Schalten Sie sowohl die faseroptische Lichtquelle als auch das Fluoreszenz-Bildgebungssystem ein.

Öffnen Sie anschließend das Erfassungsfenster, und geben Sie die Art der Exposition an, die für die Studie geeignet ist. Zu den verfügbaren Belichtungen gehören standardexposure zur Aufnahme eines einzelnen Bildes, Zeitrafferbelichtung, um eine Reihe von Bildern über ein festes Zeitintervall zu erfassen, und progressive Belichtung, um eine kontinuierliche Abfolge von Belichtungen zu unterschiedlichen Belichtungszeiten zu erfassen.

Wählen Sie dann UV-Transillumination als Beleuchtungsquelle aus. Passen Sie mithilfe des Vorschaubilds als Referenz den Fokus, das Sichtfeld und den F-Stopp in der Erfassungssystemkammer an, um die bildbestückte Bildqualität zu optimieren. Passen Sie die Belichtungszeit und -position der Probe nach Bedarf an. Schließen Sie anschließend das Vorschaufenster. Stellen Sie sicher, dass alle Parameter im Erfassungsfenster mit den Kamera- und Filtereinstellungen übereinstimmen. Klicken Sie auf "Expose", um das Bild zu erfassen und zu speichern.

Um sich auf die Ex-vivo-Bildgebung vorzubereiten, müssen Sie das Tier nach der Injektion der Fluoreszenzsonde human einschläfern. Mit Zangen, entfernen Sie sorgfältig überschüssiges periaortisches Fett. Als nächstes, chirurgische extrahieren Sie das Gewebe oder Organ von Interesse. Spülen Sie das Gewebe in Phosphat gepufferte Saline, um Restblut zu entfernen. Platzieren Sie die Probe dann direkt auf der Bildstufe.

Stellen Sie das Ex-vivo-Gewebe nach dem gleichen Protokoll ab, wie es für die In-vivo-Bildgebung beschrieben wurde. Wenn sie abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe von der Bühne. Schalten Sie das System aus, und reinigen Sie die Bildgebungsstufe.

Nachdem wir nun das Protokoll zum Abrufen von Nahinfrarot-Feldbildern abgeschlossen haben, sollten wir die Ergebnisse dieser Scans überprüfen.

In diesen repräsentativen Bildern wird eine aktivierbare Fluoreszenzsonde systemisch über die Schwanzvene injiziert, um die Matrix Metalloproteinase oder MMP2 zu visualisieren. Hier sehen wir ein in vivo NIRF-Bild einer apolipoprotein-E-Mangelmaus, die nach der Infusion von Angiotensin II ein abdominales Aortenaneurysm entwickelte. Während die meisten der kleinen hohen Signalflecken aus der Hautautofluoreszenz stammen, präsentiert sich die Vaskulatur visuell als röhrenförmige Strukturen mit hohen fluoreszierenden Signalen.

Das zweite repräsentative Bild vergleicht NIRF-Bilder von abdominalen Aortenaneurysmen aus zwei verschiedenen Tiermodellen. Eines, ein suprarenales abdominales Aortenaneurysm in einer Angiotensin II-infundierten Apolipoprotein-E-Mangelmaus. Und zweitens ein infrarotes Bauchaortenaneurysm bei einer Ratte, die mit schweinepankreasischer Elastase infundiert ist.

In jedem sehen wir eine Zunahme der MMP2-Aktivität in der aneurysmalen Region der Bauchaorta. Überschüssige Fluoreszenzsonden werden gefiltert und in den Nieren angesammelt, was die dort beobachteten hellen Fluoreszenzsignale erklärt.

Betrachten wir nun einige andere Anwendungen der Nahinfrarot-Feldbildgebung. Erstens kann DIE NIRF-Bildgebung verwendet werden, um Herz-Kreislauf-Erkrankungen in murinen Modellen zu untersuchen.

In dieser Studie werden Knockout-Mäuse mit zwei verschiedenen Nahinfrarot-Fluoreszenzsonden injiziert. Die Aortas werden 24 Stunden später geerntet und mittels NIRF-Bildgebung bewertet. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante NIRF-Antwort, die auf das Vorhandensein einer umfangreichen Verkalkung hinweist, die mit Makrophagenakkumulation kolokalisiert ist.

NIRF-Bildgebung kann auch verwendet werden, um Tumore in vivo zu lokalisieren und zu bewerten. In dieser Studie werden Gewebesimulationen von Brustphantomen mit fluoreszierenden Tumor-Simulationseinschlüssen erstellt. Die Anwendungen der NIRF-Bildgebung während der Brustkonservierungschirurgie werden dann simuliert.

Die Ergebnisse zeigen, dass tumorähnliche Einschlüsse durch NIRF bis zu einer Tiefe von etwa zwei Zentimetern nachweisbar sind. Einschlüsse, die tiefer sind, sind nachweisbar, nachdem Schnitte in das überlagernde Phantomgewebe gemacht wurden. Nachdem die Einschlüsse entfernt wurden, wertet der Chirurg die NIRF-Bilder aus. Jede verbleibende Fluoreszenz, die auf das Vorhandensein von Tumoren hinweist, weist auf eine unvollständige Entfernung hin und wird dann ausgeschnitten.

Sie haben gerade JoVeEs Einführung in die Nahinfrarot-Bildgebung miterlebt. Sie sollten nun die Prinzipien der Fluorophor-Erregung und -emission verstehen, wie Sie ein Tier auf in vivo- und ex vivo NIRF-Bildgebung vorbereiten und einige biomedizinische Anwendungen. Danke fürs Zuschauen!

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