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腹部大動脈瘤の近赤外蛍光イメージング
 

腹部大動脈瘤の近赤外蛍光イメージング

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近赤外蛍光イメージングは、蛍光プローブを利用して組織の複雑な生体分子アセンブリを可視化する光学技術です。NIRFとも呼ばれるこの非侵襲的イメージング技術は迅速であり、電離放射線を必要としません。

NIRFでは、蛍光プローブを小分子と共役させ、がんや心血管疾患の進行を研究するために、より高い特異性を得ることができます。それらは組織の深部に浸透する近赤外光によって興奮し、これらの標的分子の濃度を変える病気の組織から健康な組織を導き出すために使用され得る。

このビデオでは、近赤外蛍光イメージングの原理と、様々な疾患を研究するために小動物で生体内およびex vivo実験を行う方法を説明します。

その名の通り、近赤外蛍光イメージングは、650ナノメートルから900ナノメートルまでの最初の近赤外窓内の光を利用して、フォトンを組織に送り込みます。蛍光色素と呼ばれる標的特異的蛍光分子は、通常、イメージングの前に遺伝子工学または注射を通じて動物に導入される。

これらの蛍光体は、地上状態S0から不安定な励起状態S1素数に分子のエネルギーを上昇させる光子エネルギーを吸収する。この状態は不安定であるため、分子は励起状態の中で最も低い振動エネルギーレベルまで緩和し、熱の形でエネルギーを放出します。蛍光色素は、現在、緩和された励起状態S1で、次いで、特定の波長の光を放出して、地上状態に戻る。

この光は、分子が最も低い振動エネルギーレベルに緩和するにつれて熱の形で消散するエネルギーのために、もともと蛍光色素に導入された光よりも長い波長を有する。その後、発光した光を蛍光イメージングシステムを用いて捕捉・記録します。

蛍光体の吸収と発光スペクトルのグラフは、蛍光体がそれぞれ吸収して放出できる波長の範囲を示しています。この基本的なシフトは、ピーク吸収とピーク発光波長のナノメートルの差であり、ストークスシフトと呼ばれます。各蛍光色素には、発光光を励起光と区別し、NIRFなどのイメージング技術を可能にする明確なストークスシフトがあります。

近赤外蛍光イメージングの主な原理を見直した後、動物を調製して画像化するステップバイステップの手順を順を追って説明しましょう。

まず、光ファイバ光源を蛍光イメージングシステムに接続するために、光ファイバ光源を使用します。サンプルに導入する蛍光の励起スペクトルに一致する励起フィルタを選択し、正しい波長の光が送達されるようにします。

次に、自己蛍光に起因する可能性のある望ましくないスペクトル成分をブロックする蛍光性の発光スペクトルに一致するように適切な発光フィルタを選択します。

生体内イメージングの準備を開始するには、ノックダウンチャンバーで動物を麻酔するためにアイソフルランを使用します。イメージングステージで固定された鼻コーンに動物を移します。モーションアーティファクトを最小限に抑えるために、動物の足を固定します。目的の領域から髪を削除するには、脱毛クリームを適用します。次に、動物の目に眼科軟膏を塗布して、角膜が乾燥するのを防ぎます。

この後、活性化可能な蛍光分子プローブを動物に注入する。画像取得を開始するには、分子イメージングソフトウェアを開きます。光ファイバ光源と蛍光イメージングシステムの両方をオンにします。

次に、取得ウィンドウを開き、スタディに適した露出のタイプを指定します。利用可能な露出には、単一の画像をキャプチャするための標準的な露出、一定の時間間隔で一連の画像をキャプチャする時間経過露出、および異なる露光時間における連続した一連の露出をキャプチャするプログレッシブ露出が含まれます。

次に、イルミネーション ソースとして UV トランスイルミネーションを選択します。プレビューイメージを参照として使用して、キャプチャシステムチャンバーのフォーカス、視野、およびFストップを調整して、サンプリングされた画質を最適化します。必要に応じて、サンプルの露光時間と位置を調整します。その後、プレビュー ウィンドウを閉じます。集録ウィンドウのすべてのパラメータがカメラとフィルタの設定と一致していることを確認します。[公開] をクリックして、イメージを取得して保存します。

ex vivoイメージングを準備するために、蛍光プローブの注入に続いて動物を人道的な方法で安楽死させる。鉗子を使用して、慎重に余分な腹外脂肪を除去します。次に、目的の組織または器官を外科的に抽出する。リン酸緩衝生理食塩水中の組織をすすいで残りの血液を除去する。次に、サンプルをイメージングステージ上に直接配置します。

生体内イメージングについて説明したのと同じプロトコルに従ってex vivo組織を画像化する。完了したら、ステージからサンプルを削除します。システムの電源を切り、イメージングステージをクリーニングします。

近赤外線フィールド画像を取得するためのプロトコルが完成したので、これらのスキャンの結果を確認しましょう。

これらの代表的な画像では、活性化可能な蛍光プローブを尾静脈を介して全身的に注入し、マトリックスメタロプロテイナーゼまたはMMP2を可視化する。ここでは、アンジオテンシンIIの注入に続いて腹部大動脈瘤を発症したアポリポプロテイン-E欠損マウスの生体内NIRF画像を見る。小さな高信号スポットのほとんどは皮膚の自己蛍光によるものであるが、血管系は高い蛍光シグナルを有する管状構造として視覚的に提示する。

第2の代表的な画像は、2つの異なる動物モデルからの腹部大動脈瘤のNIRF画像を比較する。一つは、アンジオテンシンII注入アポリポプロテイン-E欠損マウスにおける上骨腹部大動脈瘤である。そして2つは、豚膵臓エラスターゼを注入したラットにおける不毛腹部大動脈瘤である。

それぞれにおいて、腹部大動脈の動脈瘤領域におけるMMP2活性の増加が見られます。過剰な蛍光プローブを濾過し、腎臓に蓄積し、そこで観察される明るい蛍光シグナルを説明する。

次に、近赤外線フィールドイメージングの他のいくつかのアプリケーションを見てみましょう。まず、NIRFイメージングは、マウスモデルにおける心血管疾患の研究に用いることができる。

本研究では、ノックアウトマウスに2つの異なる近赤外蛍光プローブを注入する。大小田は24時間後に採取され、NIRFイメージングを介して評価される。結果は、有意なNIRF応答を示し、マクロファージ蓄積と共に位置する広範な石灰化の存在を示す。

NIRFイメージングは、生体内の腫瘍を見つけて評価するためにも使用できます。本研究では、蛍光腫瘍を模擬包含する乳房ファントムをシミュレートする組織が作成される。乳房保全手術中のNIRFイメージングの応用をシミュレートします。

その結果、腫瘍様の包含は、約2センチメートルの深さまでNIRFによって検出可能であることを示す。これより深い包含は、重なり合う幻影組織に切開が行われた後に検出可能である。包含が取り除かれた後、外科医はNIRFイメージを評価する。腫瘍の存在を示す残りの蛍光は、不完全な除去を示し、その後切除される。

JoVE の近赤外線イメージングの紹介を見たばかりです。ここで、蛍光色素の励起と放出の原理、生体内およびex vivo NIRFイメージングのための動物の調製方法、およびいくつかの生物医学アプリケーションを理解する必要があります。見ていただきありがとうございます!

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