Overview
출처: 아르빈 H. 소에프리아나1,켈시 에이 불렌스2, 크레이그 J. 괴르겐1
1 웰던 생물 의학 공학 대학, 퍼듀 대학, 웨스트 라파예트, 인디애나
2 인디애나 주 웨스트 라파예트 퍼듀 대학교 생화학학과
근적외선 형광(NIRF) 이미징은 형광 프로브를 활용하여 조직에 복잡한 생체 분자 어셈블리를 시각화하는 흥미로운 광학 기술입니다. NIRF 화상 진찰은 질병의 비침습적인 화상 진찰을 위한 전통적인 화상 진찰 방법 위에 많은 이점이 있습니다. 단일 광자 방출 컴퓨팅 단층 촬영(SPECT) 및 양전자 방출 단층 촬영(PET)과 달리 NIRF 이미징은 신속하고 높은 처리량이며 이온화 방사선을 포함하지 않습니다. 또한, 엔지니어링 표적 특이적 및 활성형 형광 프로브의 최근 개발은 NIRF에 높은 특이성과 민감성을 제공하여 암과 심혈관 질환을 연구하는 데 매력적인 양상을 제공합니다. 제시된 절차는 NIRF 화상 진찰의 뒤에 원리 및 다양한 질병을 공부하기 위하여 작은 동물에 있는 생체 내 및 전 생체 실험에서 행동하는 방법을 보여주기 위하여 디자인되었습니다. 여기에 표시된 특정 예는 매트릭스 메탈로프로틴아제-2(MMP2)를 위한 활성형 형광 프로브를 사용하여 복부 대동맥류(AAA)의 두 가지 설치류 모델에서 의기양생을 연구한다.
Principles
이름에서 알 수 있듯이 NIRF 이미징은 650 nm에서 900 nm에 이르는 첫 번째 근적외선 창 내에서 빛을 사용하여 광자를 조직으로 전달합니다. 광자의 에너지, E는방정식 1을 특징으로 하며, 여기서 h는 플랑크의 상수이며, c는 진공에서 빛의 속도이며, λ는 빛의 파장이다.
= 
(방정식 1)
형광경에게 불린 표적 특정 형광 분자는 전형적으로 화상 진찰의 앞에 유전 공학 또는 꼬리 정맥 주입을 통해 동물로 소개됩니다. 이러한 형광은 광자 에너지를 흡수하여 분자의 에너지를 지상 상태인 S0에서불안정하고 흥분된 상태 S1'으로증가시다. S1' 상태의 불안정으로 인해 분자는 해당 상태 내에서 가장 낮은 진동 에너지 수준으로 이완시키고 열 형태로 에너지를 방출합니다. 형광은 이제 편안하고 흥분 된 상태 S1에서특정 파장에서 빛을 방출하는 지상 상태 S0으로돌아갑니다. 열 형태의 에너지 의 방출로 인해 파장이 길어지는 방출 된 광은 형광 이미징 시스템을 사용하여 캡처되고 기록됩니다. 흡수와 방출 스펙트럼 사이의 근본적인 변화는 스토크스 시프트라고하며 흥분과 방출 광을 구별 할 수 있기 때문에 중요합니다.
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Procedure
다음 절차는 작은 동물에서 생체 및 전 생체 NIRF 이미지를 수집하는 데 필요한 자세한 단계를 제공합니다 :
1. 실험 설정
- 광섬유 광원 가이드를 사용하여 광섬유 광원을 형광 이미징 시스템에 연결합니다.
- 실험에 적합한 여기 필터를 선택합니다. 여기 필터는 시료에 전달되는 빛의 파장을 결정하고 시료에 도입된 플루오로포어의 내분 스펙트럼과 일치하도록 선택되어야 한다.
- 적절한 배출 필터를 선택합니다. 방출 필터는 자동 불발성에 기인할 수 있는 원치 않는 스펙트럼 성분을 차단하고, 형광의 방출 스펙트럼에 맞추기 위하여 선택되어야 합니다.
2. 샘플 준비
-
인 비보
- 유량계 다이얼에 3-4%의 농도로 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 동물을 마취시화합니다.
- 동물을 이미징 단계에 고정된 코 콘으로 옮기고, 1-2%의 농도로 이소플루란을 유지한다. 열원은 동물이 일반적으로 짧은 시간(> 5분)에만 이미지되기 때문에 필요하지 않으며 체온이 크게 감소하지 않습니다.
- 동물의 발을 고정하여 모션 아티팩트를 최소화합니다. 탈필 크림을 적용하여 관심 지역에서 머리카락을 제거합니다.
- 필요한 가장 작은 부위에 디필 레고 크림을 바르습니다. 30 s 후 거즈 패드로 닦아냅니다. 에틸 알코올 촉촉거제 패드로 이 지역을 두 번째로 닦아 데필 크림을 완전히 제거합니다.
- 각막건조를 방지하기 위해 안과 연고를 눈에 바치십시오.
- 활성 형광 분자 프로브를 동물에 주입하십시오. 이 특정 응용 프로그램의 경우, MMP2 활성 프로브는 꼬리 정맥에 정맥내 주입되었다. 이 시점에서 마우스를 이미지화할 수 있습니다. 계속하려면 이 프로토콜의 "이미지 인증"으로 진행합니다. 간단한 절차를 통해 규칙적인 호흡을 위해 동물을 모니터링하십시오.
-
엑스 비보
- 형광 프로브의 주입에 따라, 동물의 안락사에 대한 2013 AVMA 지침에 따라 인간적인 방법으로 동물을 안락사. 이산화탄소 (CO2)과다 복용은 작은 동물을 안락사하기위한 표준 관행이다.
- 외과적으로 관심있는 조직이나 장기를 추출하고 조심스럽게 집게와 과잉 지방 조직을 제거합니다.
- 인산염 완충식식염에 있는 조직을 헹폐하여 잔류 혈액을 제거하고 이미징 단계에 직접 샘플을 놓습니다.
3. 이미지 수집
- 분자 이미징 소프트웨어를 열고 광섬유 광원과 형광 이미징 시스템을 모두 켭니다.
- 획득 창을 열고 스터디에 적합한 노출 유형을 지정합니다. 사용 가능한 노출에는 단일 이미지를 캡처하는 표준 노출, 고정 된 시간 간격으로 일련의 이미지를 캡처하는 시간 경과 노출, 다양한 노출 시간에 연속 노출 시퀀스를 캡처하는 프로그레시브 노출 등이 있습니다.
- 자외선-트랜스실린미네이션을 일루미네이션 소스로 선택합니다.
- 미리 보기 된 이미지를 참조로 사용하여 캡처 시스템 챔버의 렌즈 초점, 시야 및 f 스톱 / 조리개를 조정하여 샘플링 된 이미지 품질을 최적화합니다. 샘플의 노출 시간과 위치를 조정합니다.
- 미리 보기 창을 닫고 획득 창의 모든 매개 변수가 카메라 및 필터 설정과 일치하는지 확인합니다.
- '노출'을클릭하여 이미지를 획득하고 저장합니다.
- 표준 분자 이미징 소프트웨어는 일반적으로 이미지 분석을 위한 형광 신호를 정량화하기 위해 다양한 분석, 측정 및 이미지 보정 도구를 제공합니다.
- 이미징 세션이 끝나면 샘플/동물을 제거하고 시스템을 끄고 이미징 단계를 청소하여 시스템 손상을 최소화합니다.
근적외선 형광 이미징은 형광 프로브를 활용하여 조직에 복잡한 생체 분자 어셈블리를 시각화하는 광학 기술입니다. NIRF로도 알려진 이 비침습적 이미징 기술은 빠르며 이온화 방사선이 필요하지 않습니다.
NIRF에서 형광 프로브는 암 과 심혈관 질환 진행을 연구하기 위해 더 높은 특이성을 위해 작은 분자와 결합 될 수 있습니다. 그(것)들은 조직에 깊숙이 침투하는 근적외선에 의해 흥분되고 이 표적 분자의 사격을 바꾸는 병들기 조직에서 건강한 조직을 묘사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 비디오는 근적외선 형광 이미징의 원리뿐만 아니라 다양한 질병을 연구하기 위해 작은 동물에서 생체 및 전 생체 실험에서 수행하는 방법을 설명합니다.
이름에서 알 수 있듯이 근적외선 형광 이미징은 650 나노미터에서 900 나노미터에 이르는 첫 번째 근적외선 창 내에서 빛을 사용하여 광자를 조직으로 전달합니다. 형광경에게 불린 표적 특정 형광 분자는 전형적으로 화상 진찰의 앞에 유전 공학 또는 주입을 통해 동물로 소개됩니다.
이러한 형광은 지상 상태 S0에서 불안정한 흥분 상태 S1 프라임에 분자의 에너지를 상승 광자 에너지를 흡수한다. 이 상태는 불안정하기 때문에 분자는 열 형태로 에너지를 방출하는 흥분 상태 내에서 가장 낮은 진동 에너지 수준으로 완화됩니다. 현재 완화된 흥분 상태 S1에서 형광은 지상 상태로 돌아와 특정 파장의 빛을 방출합니다.
이 빛은 분자가 가장 낮은 진동 에너지 수준으로 이완함에 따라 열 형태로 방출되는 에너지로 인해 원래 형광에 도입 된 빛보다 더 긴 파장을 갖는다. 방출된 광은 그 때 형광 화상 진찰 시스템을 사용하여 붙잡고 기록됩니다.
플루오로포레에 대한 흡수 및 방출 스펙트럼의 그래프는 형광호가 각각 흡수하고 방출할 수 있는 파장의 범위를 나타낸다. 피크 흡수와 피크 방출 파장 사이의 나노미터의 차이인 이 근본적인 변화는 스토크스 시프트라고 합니다. 각 불소는 방출 광이 흥미 진진한 빛과 구별 될 수 있도록 하고 NIRF와 같은 이미징 기술을 가능하게하는 뚜렷한 스토크스 시프트를 가지고 있습니다.
근적외선 형광 화상 진찰의 주요 원리를 검토한 결과, 동물을 준비하고 이미지화하기 위한 단계별 절차를 살펴보겠습니다.
첫째, 광섬유 광원 가이드를 사용하여 광섬유 광원을 형광 이미징 시스템에 연결합니다. 정확한 광파장이 전달되도록 시료에 도입될 형광스펙트럼과 일치하는 여기 필터를 선택한다.
다음으로, 자동 불발성에 기인할 수 있는 원치 않는 스펙트럼 성분을 차단하는 형광의 방출 스펙트럼에 맞게 적절한 배출 필터를 선택한다.
생체 내 이미징을 준비하기 시작하려면 이소플루란을 사용하여 녹다운 챔버에서 동물을 마취시합니다. 이미징 스테이지에 고정된 코 콘으로 동물을 이송합니다. 동물의 발을 고정하여 모션 아티팩트를 최소화합니다. 증조 크림을 바르면 관심 있는 부위에서 머리카락을 제거합니다. 그런 다음 각막이 건조되는 것을 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 연고를 적용하십시오.
그 후, 활성형 형광 분자 프로브를 동물에 주입한다. 이미지 수집을 시작하려면 분자 이미징 소프트웨어를 엽니다. 광섬유 광원과 형광 이미징 시스템을 모두 켭니다.
다음으로, 획득 창을 열고 연구에 적합한 노출 유형을 지정합니다. 사용 가능한 노출에는 단일 이미지를 캡처하는 표준 노출, 고정 된 시간 간격에 걸쳐 일련의 이미지를 캡처하는 시간 경과 노출, 다양한 노출 시간에 연속 노출 시퀀스를 캡처하는 점진적 노출이 포함됩니다.
그런 다음 UV Transillumination을 조명 소스로 선택합니다. 미리 보기 이미지를 참조로 사용하여 캡처 시스템 챔버의 초점, 시야 및 F-stop을 조정하여 샘플링된 이미지 품질을 최적화합니다. 필요에 따라 샘플의 노출 시간과 위치를 조정합니다. 이 후 미리 보기 창을 닫습니다. 획득 창의 모든 매개 변수가 카메라 및 필터 설정과 일치하는지 확인합니다. 이미지를 획득하고 저장하려면 "노출"을 클릭합니다.
전 생체 내 이미징을 준비하기 위해 형광 프로브를 주입 한 후 인간적인 방식으로 동물을 안락사시킵니다. 집게를 사용하여 과도한 페리오라틱 지방을 조심스럽게 제거하십시오. 다음으로, 외과적으로 조직의 또는 관심있는 기관을 추출합니다. 잔류 혈액을 제거하기 위해 인산염 완충식 식염수에 있는 조직을 헹지. 그런 다음, 이미징 단계에 직접 샘플을 배치합니다.
생체 내 이미징에 대해 설명된 것과 동일한 프로토콜을 따르는 전 생체 조직 이미지를 이미지합니다. 완료되면 스테이지에서 샘플을 제거합니다. 시스템을 끄고 이미징 단계를 청소합니다.
이제 근적외선 필드 이미지를 얻기 위한 프로토콜을 완료되었으므로 해당 검사 결과를 살펴보겠습니다.
이러한 대표적인 이미지에서, 활성형 형광 프로브는 매트릭스 메탈로프로테나아제 또는 MMP2를 시각화하기 위해 꼬리 정맥을 통해 체계적으로 주입된다. 여기서 우리는 안지오텐신 II의 주입 다음 복부 대동맥류를 개발한 아폴리포단백질-E 결핍 마우스의 생체 내 NIRF 이미지를 봅닙시합니다. 작은 높은 신호 반점의 대부분은 피부 자동 형광에서, 혈관은 높은 형광 신호와 관 구조로 시각적으로 제시한다.
두 번째 대표적인 이미지는 두 가지 다른 동물 모델에서 복부 대동맥류의 NIRF 이미지를 비교합니다. 하나는, angiotensin II 주입 apolipoprotein-E 결핍 마우스에 있는 수레날 복부 대동맥류. 그리고 두, 돼지 췌장 엘라스타아제주입쥐의 부프레날 복부 대동맥류.
각각에서, 우리는 복부 대동맥류 지구에 있는 MMP2 활동의 증가를 봅습니다. 과도한 형광 프로브는 신장에 여과되고 축적되어 그곳에서 관찰된 밝은 형광 신호를 설명합니다.
이제 근적외선 필드 이미징의 다른 응용 분야를 살펴보겠습니다. 첫째, NIRF 화상 진찰은 뮤린 모형에 있는 심장 혈관 질병을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 연구에서, 녹아웃 마우스는 두 개의 다른 근적외선 형광 프로브주입. 대자는 24 시간 후에 수확되고 NIRF 화상 진찰을 통해 평가됩니다. 결과는 중요한 NIRF 반응을 보여 주며, 대식세포 축적과 함께 찾는 광범위한 석회화의 존재를 나타냅니다.
NIRF 화상 진찰은 또한 생체 내종양을 찾아 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이 연구에서는, 형광 종양을 포함하는 유방 팬텀을 시뮬레이션하는 조직이 생성됩니다. 유방 보존 수술 도중 NIRF 화상 진찰의 응용은 그 때 시뮬레이션됩니다.
결과는 종양 같이 포함이 대략 2 센티미터의 깊이까지 NIRF에 의해 검출된다는 것을 보여줍니다. 절개 후 이것보다 더 깊은 포함은 과잉 학살 팬텀 조직으로 만들어집니다. 포함을 제거 한 후, 외과 의사는 NIRF 이미지를 평가합니다. 종양의 존재를 나타내는 남아있는 형광은 불완전한 제거를 나타내고 그 후 절제됩니다.
당신은 근적외선 이미징에 대한 JoVE의 소개를 방금 지켜보았습니다. 당신은 지금 불소 환원 흥분과 방출의 원리, 생체 내 및 ex vivo NIRF 화상 진찰, 및 몇몇 생물 의학 응용에 대한 동물을 준비하는 방법, 그리고 몇몇 생의학 응용의 원리를 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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Results
복부 대동맥류(AAA)를 가진 설치류에서 촬영한 생체 내 및 전 생체 내 NIRF 이미지는 그림 1-2에 도시되어 있다. 활성형 형광 프로브는 매트릭스 메탈로프로틴아제-2(MMP2) 활성을 시각화하기 위해 꼬리 정맥을 통해 체계적으로 주입되었다. MMP2는 AAA의 개시 및 진행에 중요한 역할을 하는 세포외 매트릭스의 분해에 관여하는 탄성 효소이다. 모든 이미지는 625 nm 난초 필터, 700 nm 방출 필터 및 60 초 노출 시간을 사용하여 획득되었습니다.
도 1: 혈관신생-II의 주입에 따라 AAA를 개발한 아폴리포단백질 E-결핍 마우스의 생체 내 NIRF 이미지의 대표적인. 높은 신호를 보여주는 작은 반점의 대부분은 피부 자동 형광 (노란색 화살표)에서 입니다. 혈관은 높은 형광 신호 (적색 화살표)를 가진 관 구조로 시각화 될 수있다. 스케일바: 1cm.
도 2는 복부 대동맥의 동맥류 영역에서 MMP2 활성의 증가를 나타내며, 복부 대동맥의 건강한 영역에 비해 신호 강도의 관찰된 증가에 의해 관찰된 바와 같이. 이 결과는 AA 내에서 높은 MMP2 수준을 보여주는 문헌의 결과와 일치합니다. 과도한 형광 프로브는 신장에 여과되고 축적되어 밝은 형광 신호로 이어졌습니다.
그림 2: 두 가지 동물 모델에서 AAA의 NIRF 이미지 : (A) 안지오텐신 II 주입 아폴리포프로틴 -E 결핍 마우스와 (B) 돼지 췌장 질과 주입 쥐에 내무성 AAA에서 suprarenal AAA. 노란색 화살표는 AA를 가리킵니다. 스케일 바: 3mm.
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Applications and Summary
NIRF 이미징은 형광 프로브에 의존하여 조직에서 생체 분자 어셈블리를 정량화하고 시각화합니다. 근적외선으로부터 흡수된 광자 에너지는 형광 분자를 더 높은 에너지 상태로 흥분시키고, 더 긴 특성파장을 가진 방출된 빛은 형광 이미징 시스템에 의해 포착된다. 여기서, 복부 대동맥류에서 MMP2 활성을 연구하기 위한 NIRF 이미징의 적용은 생체 내 및 전 생체 내에서 입증되었다. 비침습적으로 바디에 있는 신진 대사 과정을 공부에 있는 금 표준으로 여겨지는 SPECT 또는 PET와는 달리, NIRF 화상 진찰은 이온화 방사선을 관련시키지 않는 급속하고 높은 처리량 화상 진찰 기술입니다. 이 양식의 한계 중 하나는 상대적으로 작은 침투 깊이입니다. 이 한계는 깊은 조직의 임상 화상 진찰을 도전하게 하더라도, NIRF 화상 진찰은 작은 동물에 있는 종양과 심장 혈관 질병을 공부하는 중요한 역할을 합니다.
적절한 형광 프로브를 감안할 때, 많은 분자 구조는 작은 동물 모델에서 질병 개시 및 진행을 모두 연구하기 위해 제시 된 NIRF 이미징 절차를 사용하여 시각화 될 수 있습니다. 특정 전 생체 및 생체 내 응용 분야에는 설치류 혈관에서의 MMP 활성 의 1) 평가, 2) 다양한 유형의 암에서조기 종양 검출, 3) 치료 용 나노 입자 약동제 및 생체 분포의 평가가 포함됩니다. AAA 내의 MMP2 활성이 증가함에 더하여, 다른 MMP 형광 프로브는 죽상 경화증 진행을 연구하고 심근 경색 에 따른 심장 세포 외 매트릭스 조성을 특성화하기 위해 활용되었습니다. 더욱이, 불소공포증 indocyanine 녹색은 뒤다리 허혈의 뮤린 모형에 있는 조직 관류를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 초기 암 검출에 NIRF 화상 진찰의 응용에 더 정교하게 하기 위하여는, 종양 표적화 NIRF 염료는 종양 마진을 평가하고 절제술 절차를 지원하기 위하여 이용될 수 있습니다. 약물 전달을 위해 개발된 나노 입자에 근적외선 형광을 통합하면 과학자들은 다양한 질병에 대해 보다 효과적인 나노입자 기반 치료법을 개발할 수 있습니다. 마지막으로, 전체 동물 또는 그대로 조직에서 형광 신호를 공간적으로 국소화하는 능력은 동물을 희생하고 조직을 균질화해야 하는 다른 기존의 효소 분석(gel zymography) 및 단백질 분석(western blot)에 비해 명확한 이점이 있다.
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