Spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR)

Fondamenti di EPR:

L'EPR è una tecnica spettroscopica che si basa su fenomeni fisici simili alla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Mentre la NMR misura le transizioni di spin nucleare, l'EPR misura le transizioni di spin degli elettroni. L'EPR è principalmente utilizzato per studiare le molecole paramagnetiche, che sono molecole con elettroni spaiati. Ricordiamo che un elettrone ha un numero quantico di spin, s = 1/2, che ha componenti magnetiche m_s = 1/2 e m_s = -1/2. In assenza di un campo magnetico, l'energia dei due stati m_{s è} equivalente. Tuttavia, in presenza di un campo magnetico applicato (B₀), il momento magnetico dell'elettrone si allinea con il campo magnetico applicato e, di conseguenza, gli stati m_s diventano non degenerati (Figura 1). La differenza di energia tra lo stato m_s dipende dalla forza del campo magnetico (Equazione 1). Questo è chiamato effetto Zeeman.

E = m₂g_eμ_BB₀     (Equazione 1)

dove g_e è il fattore g,che è 2,0023 per un elettrone libero e μ_B è il magnetone di Bohr.

Ad un dato campo magnetico, B₀, la differenza di energia tra i due stati m_s è data dall'equazione 2.

ΔE = E_1/2 — E_-1/2 = g_eμ_BB₀ = hυ (Equazione 2)

Un elettrone si muove tra i due stati m_sall'emissione o all'assorbimento di un fotone con energia ΔE =hυ. L'equazione 2 si applica a un singolo elettrone libero. Tuttavia, simile al modo in cui lo spostamento chimico in ¹H NMR dipende dall'ambiente chimico dell'atomo H, gli elettroni all'interno delle molecole non si comportano allo stesso modo di un elettrone isolato. Il gradiente del campo elettrico della molecola influenzerà il campo magnetico effettivo, dato dall'equazione 3.

B_eff = B₀(1   — σ) (Equazione 3)

dove σ è l'effetto dei campi locali, che può essere un valore positivo o negativo.

Collegando l'equazione 3 all'equazione 2, possiamo definire il fattore gper un elettrone spaiato in una data molecola come g = g_e(1 - σ), che semplifica l'equazione complessiva a:

hυ = gμ_BB₀(Equazione 4)

Durante l'esperimento EPR, la frequenza viene spazzata, più comunemente nella regione a microonde che va da 9.000-10.000 MHz, e il campo viene mantenuto costante a circa 0,35 T, consentendo il calcolo di g. La determinazione sperimentale di g mediante EPR fornisce informazioni sulla struttura elettronica di una molecola paramagnetica.

Figura 1. Scissione degli stati del momento magnetico, m_s, in presenza di un campo magnetico.

Applicazione dell'EPR:

In questo esperimento, useremo la spettroscopia EPR per studiare la chimica degli antiossidanti. O₂, che comprende ~ 21% dell'atmosfera terrestre, è un forte ossidante. Nonostante il suo potenziale di agire come ossidante, O₂ è una tripletta dello stato base e quindi reagisce solo abbastanza lentamente con la maggior parte delle molecole organiche. Una reazione importante, anche se spesso indesiderata, mediata da O₂ è l'autossidiazione. Nella chimica dell'autossidiazione, O₂ avvia processi a catena radicale, che possono consumare rapidamente molecole organiche. La Figura 2 illustra un'autossidiazione comune, in cui le aldeidi sono ossidate in acidi carbossilici.

Prevenire la chimica dell'autossidiazione è importante per prevenire la decomposizione di molti materiali organici comuni, come la plastica, e si è sviluppato un ampio campo intorno all'identificazione di antiossidanti efficaci per inibire l'autossidimento. Un meccanismo con cui gli antiossidanti possono funzionare è reagire con gli intermedi radicali per inibire i processi a catena radicale. Poiché le specie radicali hanno spin spaiati, l'EPR è uno strumento prezioso per comprendere la chimica degli antiossidanti. In questo esperimento, useremo la spettroscopia EPR per esplorare il ruolo del BHT come antiossidante nell'autoxidazione delle aldeidi alifatiche.

Figura 2. L'autossedazione dell'aldeide procede attraverso un meccanismo a catena radicale.

1. Autoxidazione della butiraldeide

1. Preparare una soluzione di butiraldeide (100 mg) e CoCl₂·6H₂O (1 mg) in 1,2-dicloroetano (DCE) (4 mL) in un flaconcino da 20 mL di scintillazione. Aggiungere una barra magnetica e montare il flaconcino con un setto di gomma.
2. Attaccare la canna di una siringa di plastica da 1 mL a un breve pezzo di tubo di gomma. Inserire il tubo di gomma in un palloncino di lattice e fissare il palloncino al tubo con un elastico e un nastro elettrico. Gonfiare un palloncino di lattice con O₂.
3. Inserisca l'ago del palloncino O₂ nel flaconcino di reazione. Inserire un secondo ago nel setto ed eliminare lo spazio di testa del vaso di reazione con O₂.
4. Utilizzando una piastra di agitazione, mescolare la reazione a temperatura ambiente per 4 ore sotto un'atmosfera di O_2.
5. Concentrare la miscela di reazione utilizzando un evaporatore rotante e prendere uno spettro NMR ^{di 1}ora del residuo oleoso risultante in CDCl₃.

2. Utilizzo di BHT come antiossidante per l'autossicazione della butiraldeide

Impostare due flaconcini come descritto di seguito. Uno verrà utilizzato per analizzare la distribuzione del prodotto e uno verrà utilizzato nella fase 3 per la spettroscopia EPR.

1. Preparare una soluzione di butiraldeide (100 mg) e CoCl₂·6H₂O (1 mg) in DCE (4 mL) in un flaconcino di scintillazione da 20 mL. Aggiungere BHT (10 mg) alla soluzione. Aggiungere una barra magnetica e montare il flaconcino con un setto di gomma.
2. Attaccare la canna di una siringa di plastica da 1 mL a un breve pezzo di tubo di gomma. Inserire il tubo di gomma in un palloncino di lattice e fissare il palloncino al tubo con un elastico e un nastro elettrico. Gonfiare un palloncino di lattice con O₂.
3. Inserisca l'ago del palloncino O₂ nel flaconcino di reazione. Inserire un secondo ago nel setto ed eliminare lo spazio di testa del vaso di reazione con O₂.
4. Utilizzando una piastra di agitazione, mescolare la reazione a temperatura ambiente per 4 ore sotto un'atmosfera di O_2.
5. Concentrare la miscela di reazione utilizzando un evaporatore rotante e prendere uno spettro NMR ^{di 1}ora del residuo oleoso risultante in CDCl₃.

3. Misurazione degli spettri EPR

1. Accendere lo spettrometro EPR e lasciare riscaldare lo strumento per 30 minuti. Impostare un'acquisizione EPR con i seguenti parametri: campo centrale 3.345 G, larghezza di sweep 100 G, tempo di sweep 55 s, costante di tempo 10 ms, potenza MW 5 mW, modulazione 100 kHz e ampiezza di modulazione 1 G.
2. Misurare uno spettro EPR di un tubo EPR vuoto per garantire che non vi siano segnali di fondo né dal tubo EPR né dal risonatore dello strumento.
3. Preparare una soluzione di BHT in DCE in un vano portaoggetti riempito di N_2. Trasferire 0,5 mL della soluzione a un tubo EPR e misurare lo spettro EPR di BHT utilizzando i parametri di acquisizione impostati nel passaggio 3.1.
4. Trasferire 0,5 mL della soluzione di reazione aggiunta con BHT dalla fase 2 a un tubo EPR e acquisire e spettro EPR utilizzando i parametri di acquisizione impostati nella fase 3.1.

L'autossidiazione della butirraldeide offre acido butirrico. Lo spettro NMR ¹H ottenuto dalla reazione effettuata nella Fase 1 mostra la mancanza di una risonanza C-H aldeidica e la presenza delle risonanze attese dall'acido butirrico. Al contrario, la NMR ottenuta dalla miscela di reazione dalla fase 2 (con BHT aggiunto) mostra segnali coerenti con la butirraldeide, senza acido butirrico presente. Da questi dati, osserviamo che la butiraldeide è servita come antiossidante nell'autossicazione dell'aldeide.

Il ruolo del BHT nell'inibire l'autossedazione dell'aldeide è illuminato dagli spettri EPR ottenuti di BHT e di BHT aggiunti alla reazione di autossedazione dell'aldeide. BHT è una molecola organica diamagnetica, il che significa che non ci sono elettroni spaiati. Di conseguenza, lo spettro EPR di BHT non visualizza segnali. Al contrario, lo spettro EPR della reazione di autossidio in cui è stato aggiunto BHT mostra un forte modello a quattro linee, coerente con un radicale organico. Questo spettro nasce perché il legame O-H di BHT è debole e in presenza di radicali generati durante l'autossidiazione, il trasferimento di atomi di H da BHT spegne il meccanismo della catena radicale e genera un radicale stabile centrato su O.

In questo esperimento, abbiamo esplorato il ruolo degli antiossidanti nell'inibire la chimica dell'autossidio. Abbiamo sondato il meccanismo di inibizione utilizzando la spettroscopia EPR, che ha rivelato che il BHT funge da antiossidante spegnendo gli intermedi radicali reattivi tramite il trasferimento dell'atomo H.

Le molecole con elettroni spaiati possono essere difficili da caratterizzare con NMR e quindi la spettroscopia EPR fornisce spesso informazioni utili e complementari su queste specie. La spettroscopia EPR è una tecnica sperimentale che viene frequentemente utilizzata per rilevare e caratterizzare i radicali organici. Inoltre, i complessi inorganici paramagnetici mostrano spesso spettri EPR che possono essere istruttivi per la caratterizzazione. Gli spettri sperimentali EPR delineano il fattore gdell'elettrone spaiato, che fornisce informazioni sulla struttura elettronica del centro paramagnetico. Inoltre, gli spin nucleari dei nuclei con un elettrone spaiato e i nuclei vicini influenzano anche il momento magnetico di un elettrone, dando origine a un'ulteriore scissione degli stati m_s e di più linee nello spettro EPR. L'accoppiamento iperfine e super-iperfine risultante fornisce ulteriori informazioni sulla struttura elettronica della molecola.

Oltre a caratterizzare le specie organiche e inorganiche a guscio aperto, la squisita sensibilità della spettroscopia EPR è fondamentale per l'applicazione a sistemi bioinorganici, dove la concentrazione di cofattori metallici è bassa. Gli spettri EPR sono abitualmente utilizzati in chimica bioinorganica per fornire informazioni dirette sulle strutture e gli stati di ossidazione degli ioni metallici nel cuore degli enzimi.