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Spettroscopia a risonanza paramagnetica elettronica (EPR)
 
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Spettroscopia a risonanza paramagnetica elettronica (EPR)

Overview

Fonte: David C. Powers, Tamara M. Powers, Texas A & M

In questo video, impareremo i principi di base alla base della risonanza paramagnetica elettronica (EPR). Useremo la spettroscopia EPR per studiare come il dibutilidrossi toluene (BHT) si comporta come antiossidante nell'autossedazione delle aldeidi alifatiche.

Principles

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Fondamenti di EPR:

L'EPR è una tecnica spettroscopica che si basa su fenomeni fisici simili alla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Mentre la NMR misura le transizioni di spin nucleare, l'EPR misura le transizioni di spin degli elettroni. L'EPR è principalmente utilizzato per studiare le molecole paramagnetiche, che sono molecole con elettroni spaiati. Ricordiamo che un elettrone ha un numero quantico di spin, s = 1/2, che ha componenti magnetiche ms = 1/2 e ms = -1/2. In assenza di un campo magnetico, l'energia dei due stati ms è equivalente. Tuttavia, in presenza di un campo magnetico applicato (B0), il momento magnetico dell'elettrone si allinea con il campo magnetico applicato e, di conseguenza, gli stati ms diventano non degenerati (Figura 1). La differenza di energia tra lo stato ms dipende dalla forza del campo magnetico (Equazione 1). Questo è chiamato effetto Zeeman.

E = m2geμBB0     (Equazione 1)

dove ge è il fattore g,che è 2,0023 per un elettrone libero e μB è il magnetone di Bohr.

Ad un dato campo magnetico, B0, la differenza di energia tra i due stati ms è data dall'equazione 2.

ΔE = E1/2 — E-1/2 = geμBB0 = hυ (Equazione 2)

Un elettrone si muove tra i due stati msall'emissione o all'assorbimento di un fotone con energia ΔE =hυ. L'equazione 2 si applica a un singolo elettrone libero. Tuttavia, simile al modo in cui lo spostamento chimico in 1H NMR dipende dall'ambiente chimico dell'atomo H, gli elettroni all'interno delle molecole non si comportano allo stesso modo di un elettrone isolato. Il gradiente del campo elettrico della molecola influenzerà il campo magnetico effettivo, dato dall'equazione 3.

Beff = B0(1   — σ) (Equazione 3)

dove σ è l'effetto dei campi locali, che può essere un valore positivo o negativo.

Collegando l'equazione 3 all'equazione 2, possiamo definire il fattore gper un elettrone spaiato in una data molecola come g = ge(1 - σ), che semplifica l'equazione complessiva a:

hυ = gμBB0(Equazione 4)

Durante l'esperimento EPR, la frequenza viene spazzata, più comunemente nella regione a microonde che va da 9.000-10.000 MHz, e il campo viene mantenuto costante a circa 0,35 T, consentendo il calcolo di g. La determinazione sperimentale di g mediante EPR fornisce informazioni sulla struttura elettronica di una molecola paramagnetica.

Figure 1
Figura 1. Scissione degli stati del momento magnetico, ms, in presenza di un campo magnetico.

Applicazione dell'EPR:

In questo esperimento, useremo la spettroscopia EPR per studiare la chimica degli antiossidanti. O2, che comprende ~ 21% dell'atmosfera terrestre, è un forte ossidante. Nonostante il suo potenziale di agire come ossidante, O2 è una tripletta dello stato base e quindi reagisce solo abbastanza lentamente con la maggior parte delle molecole organiche. Una reazione importante, anche se spesso indesiderata, mediata da O2 è l'autossidiazione. Nella chimica dell'autossidiazione, O2 avvia processi a catena radicale, che possono consumare rapidamente molecole organiche. La Figura 2 illustra un'autossidiazione comune, in cui le aldeidi sono ossidate in acidi carbossilici.

Prevenire la chimica dell'autossidiazione è importante per prevenire la decomposizione di molti materiali organici comuni, come la plastica, e si è sviluppato un ampio campo intorno all'identificazione di antiossidanti efficaci per inibire l'autossidimento. Un meccanismo con cui gli antiossidanti possono funzionare è reagire con gli intermedi radicali per inibire i processi a catena radicale. Poiché le specie radicali hanno spin spaiati, l'EPR è uno strumento prezioso per comprendere la chimica degli antiossidanti. In questo esperimento, useremo la spettroscopia EPR per esplorare il ruolo del BHT come antiossidante nell'autoxidazione delle aldeidi alifatiche.

Figure 2
Figura 2. L'autossedazione dell'aldeide procede attraverso un meccanismo a catena radicale.

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Procedure

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1. Autoxidazione della butiraldeide

  1. Preparare una soluzione di butiraldeide (100 mg) e CoCl2·6H2O (1 mg) in 1,2-dicloroetano (DCE) (4 mL) in un flaconcino da 20 mL di scintillazione. Aggiungere una barra magnetica e montare il flaconcino con un setto di gomma.
  2. Attaccare la canna di una siringa di plastica da 1 mL a un breve pezzo di tubo di gomma. Inserire il tubo di gomma in un palloncino di lattice e fissare il palloncino al tubo con un elastico e un nastro elettrico. Gonfiare un palloncino di lattice con O2.
  3. Inserisca l'ago del palloncino O2 nel flaconcino di reazione. Inserire un secondo ago nel setto ed eliminare lo spazio di testa del vaso di reazione con O2.
  4. Utilizzando una piastra di agitazione, mescolare la reazione a temperatura ambiente per 4 ore sotto un'atmosfera di O2.
  5. Concentrare la miscela di reazione utilizzando un evaporatore rotante e prendere uno spettro NMR di 1ora del residuo oleoso risultante in CDCl3.

2. Utilizzo di BHT come antiossidante per l'autossicazione della butiraldeide

Impostare due flaconcini come descritto di seguito. Uno verrà utilizzato per analizzare la distribuzione del prodotto e uno verrà utilizzato nella fase 3 per la spettroscopia EPR.

  1. Preparare una soluzione di butiraldeide (100 mg) e CoCl2·6H2O (1 mg) in DCE (4 mL) in un flaconcino di scintillazione da 20 mL. Aggiungere BHT (10 mg) alla soluzione. Aggiungere una barra magnetica e montare il flaconcino con un setto di gomma.
  2. Attaccare la canna di una siringa di plastica da 1 mL a un breve pezzo di tubo di gomma. Inserire il tubo di gomma in un palloncino di lattice e fissare il palloncino al tubo con un elastico e un nastro elettrico. Gonfiare un palloncino di lattice con O2.
  3. Inserisca l'ago del palloncino O2 nel flaconcino di reazione. Inserire un secondo ago nel setto ed eliminare lo spazio di testa del vaso di reazione con O2.
  4. Utilizzando una piastra di agitazione, mescolare la reazione a temperatura ambiente per 4 ore sotto un'atmosfera di O2.
  5. Concentrare la miscela di reazione utilizzando un evaporatore rotante e prendere uno spettro NMR di 1ora del residuo oleoso risultante in CDCl3.

3. Misurazione degli spettri EPR

  1. Accendere lo spettrometro EPR e lasciare riscaldare lo strumento per 30 minuti. Impostare un'acquisizione EPR con i seguenti parametri: campo centrale 3.345 G, larghezza di sweep 100 G, tempo di sweep 55 s, costante di tempo 10 ms, potenza MW 5 mW, modulazione 100 kHz e ampiezza di modulazione 1 G.
  2. Misurare uno spettro EPR di un tubo EPR vuoto per garantire che non vi siano segnali di fondo né dal tubo EPR né dal risonatore dello strumento.
  3. Preparare una soluzione di BHT in DCE in un vano portaoggetti riempito di N2. Trasferire 0,5 mL della soluzione a un tubo EPR e misurare lo spettro EPR di BHT utilizzando i parametri di acquisizione impostati nel passaggio 3.1.
  4. Trasferire 0,5 mL della soluzione di reazione aggiunta con BHT dalla fase 2 a un tubo EPR e acquisire e spettro EPR utilizzando i parametri di acquisizione impostati nella fase 3.1.

La spettroscopia paramagnetica elettronica, o EPR, è una tecnica importante per la caratterizzazione di composti paramagnetici, come i composti con elettroni spaiati.

L'EPR ha molte applicazioni importanti nello studio dei radicali organici, dei complessi inorganici paramagnetici e della chimica bioinorganica.

Questo video illustrerà i principi di base alla base della risonanza paramagnetica elettronica, l'uso dell'EPR per studiare il dibutilidrossi toluene e il suo comportamento antiossidante nell'autossedazione delle aldeidi alifatiche e discuterà alcune applicazioni.

L'EPR è una tecnica spettroscopica che viene utilizzata per studiare molecole con elettroni spaiati misurando le transizioni di spin degli elettroni.

Un elettrone ha un numero quantico di spin di 1/2, che ha componenti magnetiche di +1/2 o -1/2.

In assenza di un campo magnetico, l'energia dei due stati di spin è equivalente. Tuttavia, in presenza di un campo magnetico applicato, il momento magnetico dell'elettrone si allinea con il campo magnetico applicato e, gli stati di spin diventano non degenerati.

La differenza di energia tra lo stato di spin dipende dalla forza del campo magnetico. Questo è chiamato effetto Zeeman.

Ad un dato campo magnetico, la differenza di energia tra i due stati di spin è data da ΔE.

Un elettrone si muove tra i due stati di spin all'emissione o all'assorbimento di un fotone con energia ΔE. Tuttavia, questa equazione si applica a un singolo elettrone libero e non tiene conto del fatto che gli elettroni all'interno delle molecole non si comportano allo stesso modo di un elettrone isolato.

Il gradiente del campo elettrico della molecola influenzerà il campo magnetico effettivo, che, se collegato a questa equazione, definisce il fattore gper un elettrone spaiato in una data molecola in questa equazione complessiva semplificata.

Durante un esperimento EPR, la frequenza viene spazzata, mentre il campo viene mantenuto costante, consentendo il calcolo del fattore g che fornisce informazioni sulla struttura elettronica di una molecola paramagnetica.

In questo esperimento, la spettroscopia EPR viene utilizzata per studiare gli antiossidanti. L'ossigeno, che è un forte ossidante, è una tripletta allo stato base e quindi reagisce abbastanza lentamente con la maggior parte delle molecole organiche. Una reazione importante, anche se spesso indesiderata, mediata dall'ossigeno è l'autossidiazione, in cui O2 avvia i processi a catena radicale.

Ciò può portare a un rapido consumo di molecole organiche e alla decomposizione di molti materiali organici, come la plastica. Pertanto, l'identificazione di antiossidanti efficaci per inibire l'autossidicazione è diventata un importante campo di ricerca.

Un meccanismo con cui gli antiossidanti possono funzionare è reagire con gli intermedi radicali per inibire i processi a catena radicale. Poiché le specie radicali hanno spin spaiati, l'EPR è uno strumento prezioso per comprendere la chimica degli antiossidanti.

Ora diamo un'occhiata a come la spettroscopia EPR viene utilizzata per esplorare il ruolo del dibutilidrossi toluene, come antiossidante nell'autossedazione delle aldeidi alifatiche.

Iniziamo con l'autossidiazione della butiraldeide in assenza di un antiossidante. Utilizzando un flaconcino di scintillazione da 20 mL, sciogliere 125 mL di butiraldeide e 1 mg di CoCl2·6H2O in 4 mL di 1,2-dicloroetano. Aggiungere una barra magnetica e sigillare il flaconcino con un setto di gomma.

Attaccare la canna di una siringa di plastica da 1 mL a un breve pezzo di tubo di gomma. Inserire il tubo di gomma in un palloncino di lattice e fissare con un elastico e nastro adesivo. Quindi gonfiare il palloncino con gas ossigeno.

Inserisca l'ago del palloncino pieno di ossigeno nel flaconcino. Inserire un secondo ago attraverso il setto e spurgare la soluzione con ossigeno gassoso per cinque minuti. Una volta spurgato, prelevare il secondo ago e posizionare il flaconcino su una piastra di agitazione, mescolando la reazione per 4 ore a temperatura ambiente.

Al termine della reazione, concentrare la miscela utilizzando un evaporatore rotante. Quindi, asciugare il residuo su una linea ad alto vuoto per 1ora e acquisire un 1H-NMR in cloroformio deuterato.

Ora confrontiamo la reazione se effettuata in presenza dell'antiossidante dibutilidrossi toluene, o BHT. Preparare due campioni identici, sciogliendo CoCl2·6H2O e butiraldeide in 1,2-dicloroetano utilizzando un flaconcino di scintillazione da 20 mL. Aggiungere l'antiossidante a ciascuna soluzione, seguito da una barra di agitazione, e montare ogni fiala con un setto di gomma.

Simile alla reazione precedente, utilizzare un palloncino per spurgare la soluzione nelle fiale con ossigeno, quindi mescolare le reazioni sotto atmosfera di ossigeno per 4 ore a temperatura ambiente. Dopo 4 ore, concentrare una delle miscele utilizzando un evaporatore rotante per un 1H-NMR. Asciugare il campione ad alto vuoto e utilizzare questo campione per ottenere un 1H-NMR. L'altra reazione sarà utilizzata per l'EPR.

Accendere lo spettrometro EPR e lasciare riscaldare lo strumento per 30 minuti. Sul computer, sintonizzare la cavità vuota dello strumento EPR per assicurarsi che non ci siano contaminanti nello strumento.

Impostare un'acquisizione EPR con i parametri indicati nel testo. Misurare uno spettro EPR di un tubo EPR vuoto per garantire che non vi siano segnali di fondo né dal tubo EPR né dal risonatore dello strumento.

Quindi, utilizzare BHT e preparare una soluzione in 1,2-dicloroetano in un vano portaoggetti riempito di N2. Trasferire 0,5 mL della soluzione in un tubo EPR da 2 mm, tappandolo con un tappo in plastica per tubi EPR. Misurare lo spettro EPR di BHT utilizzando i parametri di acquisizione impostati in precedenza.

Ora, utilizzare la reazione contenente BHT e preparare una soluzione EPR seguendo la stessa procedura del campione BHT. Acquisire uno spettro EPR utilizzando i parametri di acquisizione impostati in precedenza.

Ora, confrontiamo le reazioni con e senza l'antiossidante BHT usando i dati NMR ed EPR.

L'autossidiazione della butirraldeide offre acido butirrico. Lo spettro 1H-NMR ottenuto dalla reazione mostra la mancanza di una risonanza aldeidica C-H e la presenza delle risonanze attese dall'acido butirrico.

Al contrario, la NMR ottenuta dalla miscela di reazione con l'aggiunta di BHT mostra segnali coerenti con la butiraldeide, senza acido butirrico presente. Da questi dati, è dimostrato che il BHT è servito come antiossidante nell'autossossidazione dell'aldeide.

Il ruolo del BHT nell'inibire l'autossedazione dell'aldeide è illuminato dagli spettri EPR ottenuti di BHT e di BHT aggiunti alla reazione di autossedazione dell'aldeide.

BHT è una molecola organica diamagnetica, il che significa che non ci sono elettroni spaiati. Di conseguenza, lo spettro EPR di BHT non visualizza segnali. Al contrario, lo spettro EPR della reazione di autossidio in cui è stato aggiunto BHT mostra un forte modello a quattro linee, coerente con un radicale organico.

Questo spettro sorge perché il legame O-H di BHT è debole. In presenza di radicali generati durante l'autossidiazione, il trasferimento di idrogeno dal BHT spegne il meccanismo della catena radicale e genera un radicale stabile centrato sull'ossigeno.

La spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica è un metodo analitico, che viene spesso utilizzato in chimica organica e inorganica per ottenere ulteriori informazioni, oltre ai metodi comuni come la RISONANZA NMR o la spettroscopia IR.

Ad esempio, l'EPR può essere utilizzato per studiare sistemi biologici come il metabolismo dei cianobatteri. I cianobatteri sono sospesi in una soluzione contenente radicale tritile e posti in una sonda di imaging. Il campione viene irradiato con la luce e la concentrazione radicale misurata rispetto al tempo.

Questo studio ha dimostrato che la concentrazione di triptile è diminuita sotto la luce, ma è rimasta costante nell'oscurità, dimostrando che l'attività metabolica dipende dalla luce.

Le molecole con elettroni spaiati possono essere difficili da caratterizzare solo con NMR, quindi la spettroscopia EPR viene spesso utilizzata per analizzare i radicali organici in modo più dettagliato. Gli spettri sperimentali EPR delineano il fattore gdell'elettrone spaiato, fornendo informazioni sulla struttura elettronica del centro paramagnetico.

Inoltre, gli spin nucleari dei nuclei con l'elettrone spaiato, così come i nuclei vicini, influenzano il momento magnetico di un elettrone, dando origine a un'ulteriore scissione degli stati di spin e di più linee nello spettro EPR. L'accoppiamento iperfine e super-iperfine risultante fornisce ulteriori informazioni sulla struttura elettronica della molecola

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica. Ora dovresti avere familiarità con i principi di EPR, autossidiazione, una reazione di autoxidazione e varie applicazioni della spettroscopia EPR. Come sempre, grazie per aver guardato!

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Results

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L'autossidiazione della butirraldeide offre acido butirrico. Lo spettro NMR 1H ottenuto dalla reazione effettuata nella Fase 1 mostra la mancanza di una risonanza C-H aldeidica e la presenza delle risonanze attese dall'acido butirrico. Al contrario, la NMR ottenuta dalla miscela di reazione dalla fase 2 (con BHT aggiunto) mostra segnali coerenti con la butirraldeide, senza acido butirrico presente. Da questi dati, osserviamo che la butiraldeide è servita come antiossidante nell'autossicazione dell'aldeide.

Il ruolo del BHT nell'inibire l'autossedazione dell'aldeide è illuminato dagli spettri EPR ottenuti di BHT e di BHT aggiunti alla reazione di autossedazione dell'aldeide. BHT è una molecola organica diamagnetica, il che significa che non ci sono elettroni spaiati. Di conseguenza, lo spettro EPR di BHT non visualizza segnali. Al contrario, lo spettro EPR della reazione di autossidio in cui è stato aggiunto BHT mostra un forte modello a quattro linee, coerente con un radicale organico. Questo spettro nasce perché il legame O-H di BHT è debole e in presenza di radicali generati durante l'autossidiazione, il trasferimento di atomi di H da BHT spegne il meccanismo della catena radicale e genera un radicale stabile centrato su O.

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Applications and Summary

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In questo esperimento, abbiamo esplorato il ruolo degli antiossidanti nell'inibire la chimica dell'autossidio. Abbiamo sondato il meccanismo di inibizione utilizzando la spettroscopia EPR, che ha rivelato che il BHT funge da antiossidante spegnendo gli intermedi radicali reattivi tramite il trasferimento dell'atomo H.

Le molecole con elettroni spaiati possono essere difficili da caratterizzare con NMR e quindi la spettroscopia EPR fornisce spesso informazioni utili e complementari su queste specie. La spettroscopia EPR è una tecnica sperimentale che viene frequentemente utilizzata per rilevare e caratterizzare i radicali organici. Inoltre, i complessi inorganici paramagnetici mostrano spesso spettri EPR che possono essere istruttivi per la caratterizzazione. Gli spettri sperimentali EPR delineano il fattore gdell'elettrone spaiato, che fornisce informazioni sulla struttura elettronica del centro paramagnetico. Inoltre, gli spin nucleari dei nuclei con un elettrone spaiato e i nuclei vicini influenzano anche il momento magnetico di un elettrone, dando origine a un'ulteriore scissione degli stati ms e di più linee nello spettro EPR. L'accoppiamento iperfine e super-iperfine risultante fornisce ulteriori informazioni sulla struttura elettronica della molecola.

Oltre a caratterizzare le specie organiche e inorganiche a guscio aperto, la squisita sensibilità della spettroscopia EPR è fondamentale per l'applicazione a sistemi bioinorganici, dove la concentrazione di cofattori metallici è bassa. Gli spettri EPR sono abitualmente utilizzati in chimica bioinorganica per fornire informazioni dirette sulle strutture e gli stati di ossidazione degli ioni metallici nel cuore degli enzimi.

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