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Biodistribution des nanomédicaments : applications de seM

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Les nanoparticules métalliques et magnétiques sont largement utilisées comme nanoporteurs pour la livraison de médicaments. Et leur biodistribution dans les tissus est essentielle pour évaluer leur efficacité thérapeutique et leur innocuité. Les nanoporteurs sont des particules de sous-micron, généralement limitées à moins de 200 nanomètres, qui peuvent être chargées d'agents thérapeutiques. En raison de leur taille, ils sont en mesure d'accéder à de nombreux sites et organes dans le corps. Là où les particules se retrouvent dans le corps, appelée leur biodistribution, est un paramètre important utilisé pour évaluer l'innocuité, optimiser le dosage et améliorer le ciblage des médicaments.

Dans cette vidéo, les principes de base de l'administration ciblée de médicaments seront décrits et une méthode d'évaluation de la biodistribution à l'aide de techniques d'imagerie à haute résolution sera démontrée. D'autres applications des porteurs à base de nanoparticules seront également discutées.

Commençons par discuter des principes fondamentaux des nanoparticules et comprenons pourquoi elles sont développées en tant que porteurs de médicaments.

Tout d'abord, les particules à l'échelle nanométrique, qui peuvent être polymères, liposomiques ou métalliques, sont généralement biocompatibles, ce qui signifie qu'elles ne sont pas nocives ou réactives aux tissus vivants et ne suscitent pas de réponse immunitaire. Toutefois, des études de nanotoxicologie doivent être effectuées afin de comprendre comment les matériaux et la taille des particules affectent la biodistribution dans le corps.

Deuxièmement, leur petite taille permet leur extravasation par l'endothélium aux emplacements inflammatoires, tels que dans les tumeurs, et a comme conséquence l'utilisation cellulaire efficace. Pendant que les cellules cancéreuses se divisent, un approvisionnement vasculaire est nécessaire pour fournir des éléments nutritifs et de l'oxygène et soutenir la croissance de tumeur. Ces vaisseaux sanguins se forment rapidement et sont donc généralement anormaux et efficaces, contenant de grandes lacunes dans leur paroi endothéliale, ce qui entraîne une vascularisation qui fuit et une augmentation de la perméabilité. Les nanoparticules sont alors capables de s'échapper de la circulation sanguine et de s'accumuler dans le microenvironnement tumoral. C'est ce qu'on appelle le ciblage passif lorsque le nanoporteur atteint l'organe cible par un phénomène connu sous le nom d'effet EPR ou l'effet de perméabilité et de rétention amélioré.

Enfin, ces nanoparticules ont une grande surface qui peut être fonctionnalisée avec des ligands spécifiques tels que des anticorps ou des protéines. Dans le ciblage actif, ces ligands peuvent alors reconnaître et se lier aux récepteurs qui sont surexprimés par les cellules dans le site de tumeur. Les interactions spécifiques entre les ligands sur la surface du nanoporteur et les récepteurs cellulaires déclenchent l'endocytose médiée par les récepteurs et facilitent l'utilisation cellulaire.

Maintenant que nous comprenons les bases de l'administration de médicaments nanoparticules, voyons une démonstration qui utilise l'imagerie à haute résolution pour déterminer la biodistribution des nanoparticules métalliques dans un modèle de souris.

Tout d'abord, préparer les nanoparticules qui seront injectées dans la souris. Ici, des particules de baryum et de titane de 30 nanomètres ont été utilisées. Après que la souris a été anesthésié injecter les nanoparticules par voie intraveineuse par l'intermédiaire de la veine de la queue. Permettre à la souris de récupérer pendant qu'elle cible passivement les organes sur une, quatre et huit semaines.

Au moment approprié de post-injection, euthanasiez les souris avec humanité selon les directives de l'AVMA. Ouvrez ensuite la cavité du corps et retirez chirurgicalement les organes d'intérêt tels que la rate, le rein, le foie et les poumons. Et stocker les organes dans 10% de formaline tamponnée de phosphate jusqu'à l'analyse.

Maintenant, utilisez des forceps pour transférer le tissu de la souris du fixatif en saline tamponnée de phosphate. Basculer l'échantillon pendant 30 minutes en remplaçant le PBS toutes les 10 minutes pour enlever l'excès de fixatif. Retirez ensuite le tissu du shaker. Ajoutez un composé optimal de température de coupe qui contient des glycols solubles dans l'eau et des résines dans un moule en plastique étiqueté.

Séchez le tissu à l'air d'un Kimwipe, puis placez-le dans le moule en plastique. Remplissez le moule avec du composé OCT couvrant le tissu et placez-le dans un sac en plastique. Placez le sac dans un seau contenant de la glace sèche et passez à un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, retirer l'échantillon du congélateur et le placer sur de la glace sèche pendant le transport au cryostat. Placez la température de la chambre à moins 23 degrés, puis transférez l'échantillon au cryostat. Étiquetez les diapositives avec le type d'organe et la taille nanoparticule de l'échantillon que vous sectionnez. Activez ensuite le cryostat. Prochaine couverture du mandrin cryostat avec OCT. Ensuite, retirez l'échantillon du moule et placez-le sur le dessus du mandrin. Montez le mandrin sur le porte-échantillon et orientez et ajustez-le pour que la lame coupe directement sur l'échantillon congelé. Maintenant, rapprochez l'échantillon de la lame et fixez l'épaisseur à 30 micromètres pour un revêtement rugueux. Faites pivoter la roue à main pour trancher des sections de 30 micromètres d'épaisseur et continuez à sectionner jusqu'à ce qu'une tranche de tissu uniforme soit coupée. Pour une face fine, définir l'épaisseur de la section à sept à huit micromètres et trancher l'échantillon.

Recueillir les sections en appuyant sur une lame de verre étiquetée sur la tranche. Ajouter ensuite les lames à la grille et sécher à l'air à température ambiante. Une fois sec, tremper à plusieurs reprises le porte-glissière dans 50 % d'éthanol pendant trois minutes pour enlever l'OCT. Transférer le support à 80 % d'éthanol et tremper pendant trois minutes. Déplacez ensuite le support à un rapport d'un pour un de méthanol froid à l'acétone et placez-le dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. Après 10 minutes, retirer le porte-glissière du congélateur et le vider sur un essuie-tout. Lorsqu'ils sont secs, placez les glissières dans une boîte à glissières et entreposez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils soient utilisés.

Maintenant, nous allons l'image tissu pulmonaire de souris qui a été recueilli une semaine après l'injection avec 30 nanomètres de baryum et de particules de titane pour déterminer leur biodistribution. Pour commencer, montez d'abord une diapositive préparée sur la scène SEM. Pour apprendre à cracher le pelage et à préparer votre échantillon, veuillez regarder la vidéo précédente dans cette collection. Ensuite, chargez la scène dans la chambre SEM. Une fois que l'échantillon est dans le champ de vision, déplacez l'échantillon verticalement à une distance de travail d'environ cinq millimètres. Allumez le faisceau d'électrons et sélectionnez le détecteur pour les électrons secondaires. Ensuite, placez la tension d'accélération du faisceau à 25 kiloélectrons volts. Pour commencer l'imagerie, zoomez sur l'échantillon pour obtenir un grossissement d'environ 1 000 à 2 000 X. Lors de ce grossissement, la structure qui contient les nanoparticules doit être visible même si les nanoparticules ne le sont pas. C'est ce qu'on appelle l'image secondaire.

Maintenant, engagez le mode de détection des électrons de rétrodiffusion dans le module SEM pour visualiser les nanoparticules. Déplacez la scène dans la direction Z pour atteindre la même distance de travail de cinq millimètres utilisée ci-dessus. Ajuster la configuration du détecteur de rétrodiffusion et utiliser différents biais de tension pour les panneaux de détection jusqu'à ce que l'image soit nette. Les régions à fort contraste, les nanoparticules, devraient maintenant être visibles. C'est l'image rétrodiffusée. Capturez et enregistrez l'image.

Ensuite, atteindre la spectroscopie à rayons X dispersive de l'énergie ou les données EDS de l'échantillon. Zoom sur la zone de contraste élevé d'un amas de nanoparticules. Ouvrez ensuite la deuxième caméra dans la chambre et baissez l'EDS dans le système. Regardez l'écran de la caméra pour vous assurer que l'EDS s'approche, mais ne touche pas le BSD ou le pistolet à électrons. Ouvrez ensuite le logiciel de microanalyse et acquérez une image. Utilisez la souris pour sélectionner une région d'intérêt pour une analyse plus approfondie. Un spectre de rayons X pour cette zone est alors affiché. Ici, les pics représentent du baryum et du titane confirmant la présence de nanoparticules métalliques dans l'échantillon. Maintenant, ouvrez un logiciel d'analyse de données qualitatives et cartographiez les bordures de l'organe sur la diapositive. Sélectionnez et exécutez ensuite le protocole approprié à partir du menu pour créer une image en mosaïque de l'orgue. Cela peut prendre plusieurs heures.

Une fois terminé, exportez-le sous forme de fichier TIF et ouvrez le fichier dans ImageJ. Ajuster les valeurs seuils de contraste pour mettre en évidence les zones de contraste très élevé, les nanoparticules. Sélectionnez ensuite les particules d'analyse pour obtenir le nombre moyen de nanoparticules dans l'organe et le pourcentage de surface de l'organe contenant des nanoparticules.

Répétez toutes les étapes de cette procédure pour les échantillons de tissus restants provenant d'autres moments et organes. Une fois que toutes les données sont recueillies, compilez-les dans un graphique de biodistribution.

Maintenant, nous allons analyser les images pour déterminer la biodistribution et apprendre comment le corps a traité les nanoparticules. Il est d'abord question de la répartition mesurée des particules en fonction du temps pour tous les échantillons analysés. Il s'agit de la distribution de nanoparticules de taille 30 nanomètres dans divers organes de souris au fil du temps. Il y a une diminution globale des nanoparticules après huit semaines qui indique le dégagement de la nanoparticule du corps.

Cependant, il y a une concentration de nanoparticules dans le foie après quatre semaines. Ceci suggère que le corps peut traiter le baryum de 30 nanomètres et les nanoparticules de titane utilisées dans cette étude comme toxine. Cette analyse peut également être effectuée pour évaluer comment la taille de la nanoparticule affecte sa biodistribution dans le corps. La modification de la taille des nanoparticules a affecté le taux d'utilisation cellulaire globale et le taux de dégagement.

Les nanoparticules et les nanoporteurs sont largement utilisés dans la recherche biomédicale et ont des applications comme agents d'imagerie, de diagnostic et thérapeutiques. Des nanoparticules sont en cours de développement pour l'administration de vaccins contre une grande variété de maladies infectieuses, car elles protègent les composants du vaccin contre la dégradation et maximisent la stimulation immunitaire. Des vésicules multi-lamellar inter-bicouches, ou ICMV, sont en cours de développement pour l'induction de réponses de lymphocytes T positifs CD8 spécifiques à l'antigène.

Ces ICMV se localisent spécifiquement dans les ganglions lymphatiques des souris pour l'administration efficace de vaccins et ont obtenu des réponses immunitaires robustes contre les antigènes paillinaux et les cellules tumorales. Les nanoparticules métalliques sont souvent utilisées comme agents de contraste dans l'imagerie par résonance magnétique pour visualiser la structure et la fonction des tissus pour la détection précoce des maladies. Les nanoparticules d'oxyde de fer sont des sondes diagnostiques utiles. Lorsqu'elles sont synthétisées avec une moiétoy bisphosphonate, ces nanoparticules s'accumulent rapidement et sélectivement dans des plaques athérosclérotiques et permettent leur visualisation dans une heure pour un diagnostic rapide.

Récemment, les nanoporteurs chargés ont été développés comme stratégie pour détecter simultanément le cancer à un stade précoce et fournir des agents chimiothérapeutiques. Ces nanoporteurs sont appelés théranostiques parce qu'ils intègrent des capacités diagnostiques et thérapeutiques.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la détermination de la biodistribution des nanomédicaments. Vous devez maintenant connaître les principes de base des porteurs de nanomédicaments, comment détecter les nanoporteurs dans les échantillons de tissus à l'aide de SEM à haute résolution, et de déterminer leur biodistribution, et certaines applications de nanoparticules dans le génie biomédical.

Merci d'avoir regardé.

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