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Biodistribution von Nano-Drogenträgern: Anwendungen von SEM

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Metallische und magnetische Nanopartikel werden häufig als Nanoträger für die Arzneimittelabgabe verwendet. Und ihre Bioverteilung in Geweben ist wichtig, um ihre therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit zu bewerten. Nanoträger sind Submikronpartikel, die in der Regel auf weniger als 200 Nanometer begrenzt sind und mit therapeutischen Mitteln beladen werden können. Aufgrund ihrer Größe sind sie in der Lage, viele Standorte und Organe im Körper zugreifen. Wo die Partikel im Körper landen, ihre Bioverteilung genannt, ist ein wichtiger Parameter verwendet, um die Sicherheit zu bewerten, die Dosing zu optimieren und die Drogen-Targeting zu verbessern.

In diesem Video werden die Grundprinzipien der gezielten Medikamentenabgabe beschrieben und eine Methode zur Bewertung der Bioverteilung mit hochauflösenden Bildgebungstechniken demonstriert. Weitere Anwendungen von Nanopartikel-basierten Trägern werden ebenfalls diskutiert.

Lassen Sie uns zunächst über die Grundlagen von Nanopartikeln diskutieren und verstehen, warum sie als Arzneimittelträger entwickelt werden.

Erstens sind nanoskalige Partikel, die entweder polymer, liposomal oder metallisch sein können, in der Regel biokompatibel, was bedeutet, dass sie nicht schädlich oder reaktiv gegenüber lebendem Gewebe sind und keine Immunantwort hervorrufen. Es müssen jedoch nanotoxikologische Studien durchgeführt werden, um zu verstehen, wie sich die Materialien und die Partikelgröße auf die Bioverteilung im Körper auswirken.

Zweitens, ihre geringe Größe ermöglicht ihre Extravasation durch das Endothel an entzündlichen Stellen, wie bei Tumoren, und führt zu einer effizienten zellulären Aufnahme. Da sich Krebszellen teilen, wird eine Gefäßversorgung benötigt, um Nährstoffe und Sauerstoff zu liefern und das Tumorwachstum zu unterstützen. Diese Blutgefäße bilden sich schnell und sind daher in der Regel abnormal und wirksam, enthalten große Lücken in ihrer Endothel-Futter, was zu einer undichten Vaskulatur und einer Erhöhung der Durchlässigkeit. Die Nanopartikel können dann aus dem Blutkreislauf entweichen und sich in der Tumormikroumgebung ansammeln. Dies wird als passives Targeting bezeichnet, bei dem der Nanoträger das Zielorgan durch ein Phänomen erreicht, das als EPR-Effekt oder die verbesserte Permeabilität und Retention stagniert.

Schließlich haben diese Nanopartikel eine große Oberfläche, die mit spezifischen Liganden wie Antikörpern oder Proteinen funktionalisiert werden kann. Bei aktiver Ausrichtung können diese Liganden dann Rezeptoren erkennen und binden, die von Zellen in der Tumorstelle überexprimiert werden. Spezifische Wechselwirkungen zwischen den Liganden auf der Nanoträgeroberfläche und den Zellrezeptoren lösen rezeptorvermittelte Endozytose aus und erleichtern die zelluläre Aufnahme.

Nun, da wir die Grundlagen der Verabreichung von Nanopartikelmedikamenten verstehen, sehen wir uns eine Demonstration an, die hochauflösende Bildgebung verwendet, um die Bioverteilung von metallischen Nanopartikeln in einem Mausmodell zu bestimmen.

Bereiten Sie zunächst die Nanopartikel vor, die in die Maus injiziert werden. Hier kamen 30 Nanometer Barium- und Titanpartikel zum Einsatz. Nachdem die Maus anästhesisiert wurde, injizieren Sie die Nanopartikel intravenös über die Schwanzvene. Lassen Sie die Maus erholen, während sie passiv die Organe über ein, vier und acht Wochen anvisieren.

Am entsprechenden Zeitpunkt nach der Injektion die Mäuse nach einer AVMA-Richtlinien human einschläfern. Öffnen Sie dann die Körperhöhle und entfernen Sie operativ die Organe von Interesse wie die Milz, Niere, Leber, und Lunge. Und speichern Sie die Organe in 10% Phosphat-gepuffertes Formalin bis zur Analyse.

Verwenden Sie nun Zangen, um das Mausgewebe vom Fixativ in phosphatgepufferte Saline zu übertragen. Schaukeln Sie die Probe für 30 Minuten ersetzen die PBS alle 10 Minuten, um überschüssige Fixierung zu entfernen. Entfernen Sie dann das Gewebe aus dem Shaker. Fügen Sie eine optimale Schnitttemperaturverbindung, die wasserlösliche Glykole und Harze enthält, zu einer beschrifteten Kunststoffform hinzu.

Trocknen Sie das Gewebe mit einem Kimwipe und legen Sie es dann in die Kunststoffform. Füllen Sie die Form mit OCT-Verbindung, die das Gewebe bedeckt und legen Sie sie in eine Plastiktüte. Legen Sie den Beutel in einen Eimer mit Trockeneis und bewegen Sie sich über Nacht in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius.

Am nächsten Tag die Probe aus dem Gefrierschrank nehmen und beim Transport zum Kryostat auf Trockeneis legen. Stellen Sie die Kammertemperatur auf minus 23 Grad ein und übertragen Sie die Probe dann in den Kryostat. Etikettieren Sie Dias mit dem Organtyp und der Nanopartikelgröße der Probe, die Sie abschnitten werden. Aktivieren Sie dann den Kryostat. Als nächstes bedecken Sie das Kryostatfutter mit OCT. Entfernen Sie dann die Probe aus der Form und legen Sie sie auf das Futter. Montieren Sie das Futter auf den Probenhalter und richten Sie es so aus, dass die Klinge direkt über die gefrorene Probe schneidet. Bringen Sie nun die Probe näher an die Klinge und stellen Sie die Dicke auf 30 Mikrometer für grobe Verkleidung. Drehen Sie das Handrad, um 30 Mikrometer dicke Abschnitte zu schneiden und weiter zu schneiden, bis eine gleichmäßige Gewebescheibe geschnitten wird. Für feine Verkleidung die Schnittdicke auf sieben bis acht Mikrometer einstellen und die Probe in Scheiben schneiden.

Sammeln Sie die Abschnitte, indem Sie eine beschriftete Glasrutsche auf die Scheibe drücken. Dann fügen Sie die Dias auf das Rack und Luft trocken bei Raumtemperatur. Nach dem Trocknen das Schiebegeregal wiederholt in 50% Ethanol für drei Minuten tauchen, um das OCT zu entfernen. Übertragen Sie das Rack auf 80% Ethanol und tauchen Sie für drei Minuten. Dann das Rack auf ein 1:1-Verhältnis von kaltem Methanol zu Aceton bewegen und bei minus 20 Grad Celsius in einen Gefrierschrank stellen. Nach 10 Minuten den Schiebeträger aus dem Gefrierschrank nehmen und auf einem Papiertuch abtropfen lassen. Wenn sie trocken sind, legen Sie die Dias in eine Schiebebox und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie verwendet werden.

Lassen Sie uns nun ein Bild Maus Lungengewebe, das eine Woche nach der Injektion mit 30-Nanometer Barium und Titanpartikel gesammelt wurde, um ihre Bioverteilung zu bestimmen. Um zu beginnen, montieren Sie zuerst eine vorbereitete Rutsche auf die SEM-Bühne. Um zu erfahren, wie man Mantel und bereiten Sie Ihre Probe, sehen Sie sich bitte das vorherige Video in dieser Sammlung. Dann die Bühne in die SEM-Kammer laden. Sobald sich die Probe im Sichtfeld befindet, verschieben Sie die Probe vertikal auf einen Arbeitsabstand von etwa fünf Millimetern. Schalten Sie den Elektronenstrahl ein und wählen Sie den Detektor für Sekundärelektronen aus. Stellen Sie dann die Strahlbeschleunigungsspannung auf 25 Kiloelektronenvolt ein. Um mit der Bildgebung zu beginnen, zoomen Sie die Probe auf eine Vergrößerung von etwa 1.000 bis 2.000 X. Bei dieser Vergrößerung sollte die Struktur, die die Nanopartikel enthält, sichtbar sein, auch wenn die Nanopartikel es nicht sind. Dies wird als sekundäres Bild bezeichnet.

Verwenden Sie nun den Rückstreuelektronendetektionsmodus im SEM-Modul, um die Nanopartikel zu visualisieren. Bewegen Sie die Bühne in Z-Richtung, um den oben verwendeten Arbeitsabstand von fünf Millimetern zu erreichen. Passen Sie die Konfiguration des Rückstreudetektors an und verwenden Sie unterschiedliche Spannungsverzerrungen für die Detektionspanels, bis das Bild gestochen scharf ist. Regionen mit hohem Kontrast, die Nanopartikel, sollten nun sichtbar sein. Dies ist das zurückgestreute Bild. Erfassen und speichern Sie das Bild.

Als nächstes erreichen Sie energiedispersive Röntgenspektroskopie oder EDS-Daten der Probe. Zoomen Sie auf den kontrastreichen Bereich eines Klumpens von Nanopartikeln. Öffnen Sie dann die zweite Kamera in der Kammer und senken Sie das EDS in das System. Schauen Sie sich den Kamerabildschirm an, um sicherzustellen, dass sich das EDS nähert, berührt jedoch nicht den BSD oder die Elektronenkanone. Öffnen Sie dann die Mikroanalysesoftware und erfassen Sie ein Bild. Verwenden Sie die Maus, um einen Interessenbereich für die weitere Analyse auszuwählen. Anschließend wird ein Röntgenspektrum für diesen Bereich angezeigt. Hier stellen die Peaks Barium und Titan dar, die das Vorhandensein von metallischen Nanopartikeln in der Probe bestätigen. Öffnen Sie nun eine qualitative Datenanalysesoftware und kartieren Sie die Grenzen des Organs auf der Folie. Wählen Sie dann das entsprechende Protokoll aus dem Menü aus, und führen Sie es aus, um ein Mosaikbild der Orgel zu erstellen. Dies kann mehrere Stunden dauern.

Exportieren Sie sie nach Abschluss als TIF-Datei, und öffnen Sie die Datei in ImageJ. Passen Sie die Kontrastschwellenwerte an, um Bereiche mit sehr hohem Kontrast, die Nanopartikel, hervorzuheben. Wählen Sie dann Partikel analysieren aus, um die durchschnittliche Anzahl der Nanopartikel im Organ und den Flächenprozentsatz des Organs, das Nanopartikel enthält, zu erhalten.

Wiederholen Sie alle Schritte in diesem Verfahren für verbleibende Gewebeproben aus anderen Zeitpunkten und Organen. Sobald alle Daten gesammelt sind, kompilieren Sie sie in einem Bioverteilungsdiagramm.

Analysieren wir nun die Bilder, um die Bioverteilung zu bestimmen und zu erfahren, wie der Körper die Nanopartikel verarbeitet hat. Zeichnen Sie zunächst die gemessene Partikelverteilung als Funktion der Zeit für alle analysierten Proben. Dies ist die Verteilung von Nanopartikeln mit einer Größe von 30 Nanometern in verschiedenen Mausorganen im Laufe der Zeit. Nach acht Wochen gibt es eine Allgemeine Abnahme der Nanopartikel, was auf die Clearance des Nanopartikels aus dem Körper hindeutet.

Jedoch, Es gibt eine Erhöhung der Nanopartikelkonzentration in der Leber nach vier Wochen. Dies deutet darauf hin, dass der Körper die 30-Nanometer-Barium- und Titan-Nanopartikel, die in dieser Studie als Toxin verwendet werden, verarbeiten könnte. Diese Analyse kann auch durchgeführt werden, um zu bewerten, wie sich die Größe des Nanopartikels auf seine Bioverteilung im Körper auswirkt. Die Änderung der Größe der Nanopartikel wirkte sich auf die Gesamtaufnahme der Zellunde und die Clearancerate aus.

Nanopartikel und Nanoträger sind in der biomedizinischen Forschung weit verbreitet und haben Anwendungen als bildgebende, diagnostische und therapeutische Wirkstoffe. Nanopartikel werden für den Einsatz in der Impfstoffabgabe gegen eine Vielzahl von Infektionskrankheiten entwickelt, da sie Impfstoffkomponenten vor Degradation schützen und die Immunstimulation maximieren. Interbilayer-kreuzbandende multilamellare Vesikel oder ICMVs werden für die Induktion antigenspezifischer CD8-positiver T-Zellreaktionen entwickelt.

Diese ICMVs lokalisieren speziell in den Lymphknoten von Mäusen für eine effiziente Impfstoffabgabe und haben robuste Immunreaktionen gegen malariale Antigene und Tumorzellen ausgelöst. Metallische Nanopartikel werden häufig als Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie eingesetzt, um die Gewebestruktur und -funktion zur frühen Krankheitserkennung zu visualisieren. Eisenoxid-Nanopartikel sind nützliche diagnostische Sonden. Bei der Synthese mit einem Bisphosphonat-Moiety akkumulieren sich diese Nanopartikel schnell und selektiv in atherosklerotischen Plaques und ermöglichen ihre Visualisierung innerhalb einer Stunde für eine schnelle Diagnose.

Kürzlich wurden geladene Nanoträger als Strategie entwickelt, um Krebs im Frühstadium gleichzeitig zu erkennen und Chemotherapeutika zu liefern. Diese Nanoträger werden Theranostik genannt, weil sie diagnostische und therapeutische Fähigkeiten integrieren.

Sie haben gerade JoVeVes Video über die Bestimmung der Bioverteilung von Nanopharma-Trägern angesehen. Sie sollten nun die Grundprinzipien von Nanopharma-Trägern kennen, wie Nanoträger in Gewebeproben mit hochauflösendem SEM erkannt und ihre Bioverteilung bestimmt werden können, sowie einige Anwendungen von Nanopartikeln in der biomedizinischen Technik.

Danke fürs Zuschauen.

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