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Biodistribución de los portadores de nanofármacos
 

Biodistribución de los portadores de nanofármacos: Aplicaciones de SEM

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Las nanopartículas metálicas y magnéticas se utilizan ampliamente como nanoportadoras para la administración de fármacos. Y su biodistribución en los tejidos es esencial para evaluar su eficacia terapéutica y seguridad. Los nanoportadores son partículas submicrónicas, generalmente limitadas a menos de 200 nanómetros, que pueden ser cargadas con agentes terapéuticos. Debido a su tamaño son capaces de acceder a muchos sitios y órganos en el cuerpo. Donde las partículas terminan en el cuerpo, llamada su biodistribución, es un parámetro importante utilizado para evaluar la seguridad, optimizar la dosificación y mejorar la segmentación de fármacos.

En este video se describirán los principios básicos de la administración de medicamentos dirigidos y se demostrará un método para evaluar la biodistribución utilizando técnicas de imagen de alta resolución. También se discutirán otras aplicaciones de portadores basados en nanopartículas.

Comencemos discutiendo los fundamentos de las nanopartículas y entendiendo por qué se están desarrollando como portadores de drogas.

En primer lugar, las partículas a nanoescala, que pueden ser poliméricas, liposómicas o metálicas, suelen ser biocompatibles, lo que significa que no son dañinas ni reactivas para el tejido vivo y no generan una respuesta inmunitaria. Sin embargo, se deben realizar estudios de nanotoxicología para comprender cómo los materiales y el tamaño de las partículas afectan a la biodistribución en el cuerpo.

En segundo lugar, su pequeño tamaño permite su extravasación a través del endotelio en sitios inflamatorios, como en tumores, y resulta en una aceptación celular eficiente. A medida que las células cancerosas se dividen, se necesita un suministro vascular para suministrar nutrientes y oxígeno y apoyar el crecimiento tumoral. Estos vasos sanguíneos se forman rápidamente y por lo tanto son generalmente anormales y eficaces, que contienen grandes brechas en su revestimiento endotelial, lo que resulta en una vasculatura con fugas y un aumento en la permeabilidad. Las nanopartículas son entonces capaces de escapar del torrente sanguíneo y acumularse dentro del microambiente tumoral. Esto se denomina orientación pasiva donde el nanoportador llega al órgano objetivo a través de un fenómeno conocido como el efecto EPR o el efecto de permeabilidad y retención mejorada.

Por último, estas nanopartículas tienen una gran superficie que se puede funcionalizar con ligandos específicos como anticuerpos o proteínas. En la segmentación activa, estos ligandos pueden reconocer y unirse a los receptores que están sobreexpresados por las células en el sitio del tumor. Las interacciones específicas entre los ligandos en la superficie nanoportadora y los receptores celulares desencadenan la endoocitosis mediada por receptores y facilitan la aceptación celular.

Ahora que entendemos los conceptos básicos de la administración de fármacos de nanopartículas, veamos una demostración que utiliza imágenes de alta resolución para determinar la biodistribución de nanopartículas metálicas en un modelo de ratón.

Primero, prepare las nanopartículas que se inyectarán en el ratón. Aquí se utilizaron partículas de bario y titanio de 30 nanómetros. Después de que el ratón ha sido anestesiado inyectar las nanopartículas por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Permita que el ratón se recupere mientras apuntan pasivamente a los órganos durante una, cuatro y ocho semanas.

En el momento adecuado después de la inyección, eutanasia humanamente a los ratones de acuerdo con las directrices de AVMA. Luego abra la cavidad del cuerpo y retire quirúrgicamente los órganos de interés como el bazo, el riñón, el hígado y los pulmones. Y almacenar los órganos en 10% de formalina tamponada en fosfato hasta el análisis.

Ahora use fórceps para transferir el tejido del ratón del fijador a una solución salina con búfer de fosfato. Mece la muestra durante 30 minutos reemplazando el PBS cada 10 minutos para eliminar el exceso de fijación. A continuación, retire el tejido de la coctelera. Agregue un compuesto de temperatura de corte óptimo que contenga glicoles y resinas solubles en agua a un molde de plástico etiquetado.

Seque el tejido con un Kimwipe y luego colóquelo en el molde de plástico. Llene el molde con compuesto OCT que cubra el tejido y colóquelo en una bolsa de plástico. Coloque la bolsa en un cubo que contenga hielo seco y muévase a un congelador Celsius de menos 80 grados durante la noche.

Al día siguiente retire la muestra del congelador y colóquela en hielo seco mientras se transporta al criostato. Ajuste la temperatura de la cámara a menos 23 grados y luego transfiera la muestra al criostato. Etiquete las diapositivas con el tipo de órgano y el tamaño de las nanopartículas de la muestra que va a seccionar. A continuación, active el criostato. A continuación, cubra el mandril de criostato con PTU. A continuación, retire la muestra del molde y colóquela encima del mandril. Monte el mandril en el soporte de la muestra y oriente y ajuste para que la hoja se corte directamente a través de la muestra congelada. Ahora acerque la muestra a la hoja y ajuste el espesor a 30 micrómetros para la orientación rugosa. Gire la rueda de mano para cortar secciones de 30 micrómetros de espesor y continúe seccionando hasta que se corte una rebanada de tejido uniforme. Para una cara fina, ajuste el espesor de la sección en siete a ocho micrómetros y corte la muestra.

Recoja las secciones presionando una diapositiva de vidrio etiquetada en la rebanada. A continuación, agregue los portaobjetos al bastidor y seque al aire a temperatura ambiente. Una vez seco, sumerja repetidamente la portaobjetos en 50% de etanol durante tres minutos para retirar el OCT. Transfiera el bastidor al 80% de etanol y sumerja durante tres minutos. A continuación, mueva el bastidor a una proporción uno a uno de metanol frío a acetona y colóquelo en un congelador a menos 20 grados centígrados. Después de 10 minutos, retire la portaobjetos del congelador y escúrrela en una toalla de papel. Cuando esté seco, coloque las diapositivas en una caja de diapositivas y guárdelas a menos 20 grados Celsius hasta su uso.

Ahora vamos a imaginar el tejido pulmonar del ratón que fue recogido una semana después de la inyección con 30 nanómetros de bario y partículas de titanio para determinar su biodistribución. Para empezar, primero monte una diapositiva preparada en el escenario SEM. Para aprender a sputter abrigo y preparar su muestra, por favor vea el video anterior en esta colección. A continuación, cargue el escenario en la cámara SEM. Una vez que la muestra esté en el campo de visión, mueva la muestra verticalmente a una distancia de trabajo de aproximadamente cinco milímetros. Encienda el haz de electrones y seleccione el detector para electrones secundarios. A continuación, ajuste el voltaje de aceleración del haz a 25 kiloelectrones voltios. Para comenzar la toma de imágenes, acerque la muestra a un aumento de aproximadamente 1.000 a 2.000X. En este aumento, la estructura que contiene las nanopartículas debe ser visible aunque las nanopartículas no lo sean. Esto se denomina imagen secundaria.

Ahora enganche el modo de detección de electrones de retrodispersión en el módulo SEM para visualizar las nanopartículas. Mueva la etapa en la dirección Z para alcanzar la misma distancia de trabajo de cinco milímetros utilizada anteriormente. Ajuste la configuración del detector de retrodispersión y utilice diferentes sesgos de voltaje para los paneles de detección hasta que la imagen esté nítida. Las regiones de alto contraste, las nanopartículas, ahora deben ser visibles. Esta es la imagen retrodispersa. Capturar y guardar la imagen.

A continuación, obtenga espectroscopía de rayos X de dispersión de energía o datos EDS de la muestra. Amplíe el área de alto contraste de un grupo de nanopartículas. A continuación, abra la segunda cámara en la cámara y baje el EDS en el sistema. Observe la pantalla de la cámara para asegurarse de que el EDS se acerca, pero no toca el BSD ni la pistola de electrones. A continuación, abra el software de microanálisis y adquiera una imagen. Utilice el ratón para seleccionar una región de interés para su análisis posterior. A continuación, se muestra un espectro de rayos X para esa área. Aquí los picos representan el bario y el titanio que confirman la presencia de nanopartículas metálicas en la muestra. Ahora abra el software de análisis de datos cualitativos y mapee los bordes del órgano en la diapositiva. A continuación, seleccione y ejecute el protocolo adecuado desde el menú para crear una imagen de mosaico del órgano. Esto puede tardar varias horas.

Una vez completado, expórtelo como un archivo TIF y abra el archivo en ImageJ. Ajuste los valores del umbral de contraste para resaltar áreas de muy alto contraste, las nanopartículas. A continuación, seleccione Analizar partículas para obtener el número medio de nanopartículas en el órgano y el porcentaje de área del órgano que contiene nanopartículas.

Repita todos los pasos de este procedimiento para las muestras de tejido restantes de otros puntos de tiempo y órganos. Una vez recopilados todos los datos, compílelos en un gráfico de biodistribución.

Ahora vamos a analizar las imágenes para determinar la biodistribución y aprender cómo el cuerpo procesa las nanopartículas. Primero trazar la distribución de partículas medidas en función del tiempo para todas las muestras analizadas. Esta es la distribución de nanopartículas de tamaño de 30 nanómetros en varios órganos de ratón a lo largo del tiempo. Hay una disminución general de las nanopartículas después de ocho semanas que indica el aclaramiento de la nanopartícula del cuerpo.

Sin embargo, hay un aumento de la concentración de nanopartículas en el hígado después de cuatro semanas. Esto sugiere que el cuerpo puede estar procesando el bario de 30 nanómetros y nanopartículas de titanio utilizados en este estudio como una toxina. Este análisis también se puede realizar para evaluar cómo el tamaño de la nanopartícula afecta a su biodistribución en el cuerpo. Cambiar el tamaño de las nanopartículas afectó a la tasa de admisión celular general y la tasa de aclaramiento.

Las nanopartículas y nanoportadoras son ampliamente utilizadas en la investigación biomédica y tienen aplicaciones como imágenes, diagnósticos y agentes terapéuticos. Las nanopartículas se están desarrollando para su uso en la administración de vacunas contra una amplia variedad de enfermedades infecciosas porque protegen los componentes de la vacuna de la degradación y maximizan la estimulación inmune. Se están desarrollando vesículas multilamelares entre capas, o ICMV, para la inducción de respuestas de células T positivas CD8 específicas del antígeno.

Estos ICMVs se localizan específicamente en los ganglios linfáticos de los ratones para la administración eficiente de vacunas y han obtenido respuestas inmunitarias sólidas contra los antígenos de la malaria y las células tumorales. Las nanopartículas metálicas se utilizan a menudo como agentes de contraste en la resonancia magnética para visualizar la estructura y la función del tejido para la detección temprana de enfermedades. Las nanopartículas de óxido de hierro son sondas de diagnóstico útiles. Cuando se sintetizan con una mitad de bisfosfonato, estas nanopartículas se acumulan rápida y selectivamente en placas ateroscleróticas y permiten su visualización en una hora para un diagnóstico rápido.

Recientemente, los nanoportadores cargados se han desarrollado como una estrategia para detectar simultáneamente el cáncer en estadio temprano y administrar agentes quimioterápicos. Estos nanoportadores se llaman tenósticos porque integran habilidades diagnósticas y terapéuticas.

Acabas de ver el video de JoVE sobre la determinación de la biodistribución de los portadores de nanofármacos. Ahora debe conocer los principios básicos de los portadores de nanofármacos, cómo detectar nanoportadores en muestras de tejido utilizando SEM de alta resolución, y determinar su biodistribución, y algunas aplicaciones de nanopartículas en la ingeniería biomédica.

Gracias por mirar.

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