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小鼠脊髓的微CT成像

Article

Overview

资料来源:佩曼·沙贝吉-鲁德波什蒂和西娜·沙赫巴兹莫哈马迪,康涅狄格大学生物医学工程系,康涅狄格州斯托尔斯

一个鲜为人知的事实是,X射线的发现和(无意)使用获得了有史以来第一个诺贝尔物理学奖。1895年,伦特根博士妻子手的著名X射线图像在科学界掀起了冲击波,看起来就像大多数现代的2D医学X射线图像。虽然它不是最新的技术,X射线吸收成像是一个不可或缺的工具,可以发现在世界顶级的研发和大学实验室,医院,机场,其他地方。可以说,X射线吸收成像的最高级用途包括获得像2D医学X射线中那样的信息,但通过计算机断层扫描(CT或微CT)在3D中实现。通过采用一系列 2D X 射线投影,高级软件能够重建数据以形成 3D 体积。3D 信息可以,并且很可能包括来自探测对象内部的信息,而无需被剪切打开。在这里,将获取微CT扫描,并讨论影响图像质量的主要因素。

Principles

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X射线可视为能量范围为0.1-100 keV的光子或波长范围为0.01-10nm的电磁波。X射线可以通过几种不同的方式创建,但这里的讨论仅限于连续光谱锥束X射线成像。这些X射线是由一种称为"Bremsstrahlung"的现象产生的,在德国,这意味着"制动辐射"。当带电粒子经历加速度 [1] 时,就会发生这种情况。在X射线源中,带负电荷的电子在真空管中发射,撞击目标材料(通常是钨、氧化钨、铜或其他金属),并通过其减速,以X射线的比例发射光子。产生X射线连续光谱的原因是,减速不是均匀的,也不是瞬时的,尽管分布中出现了以目标材料特性能量为中心的尖峰,如[2]所示。不同的能量和目标材料有不同的曲线。在执行微CT扫描时,这是一件非常重要的事情,将在后面的章节中讨论。

典型的微型CT系统具有三个主要组件,如[3]所示。该系统的基本组件包括:a) X射线源,b) 用于样品安装的旋转级,以及 c) 使用 CCD 探测器的平板或光学目标。X 射线离开源,在到达探测器之前被样品吸收、传输或散射。吸收是微CT测量的主要相互作用,因为体内不同的材料吸收X射线的方式不同。例如,骨头含有大量的原子钙,能很好地吸收X射线。因此,骨骼会阻止 X 射线到达探测器,最终以阴影身份显示在图像中。然后,样品以增量方式旋转,并重复该过程,直到对样品进行 360° 或在某些情况下 180° 的成像。断层扫描的输出是一系列不同方向的 2D 投影,可重建为 3D 体积。

微型CT是显微镜的一种形式,它因其能够解析尺度特征而得名。这一特定类别的微CT的分辨率限制取决于源点大小和能量分布,以及探测器的类型和功效;不是X射线的波长对于此类微型CT,最佳分辨率约为500-700nm(三维)。虽然,可以检测特征的十分之一或百分之一的这种大小。

在大多数 CT 系统中,使用几何放大率进行放大。[3] 中的图像说明了几何放大率的概念。它很容易想象成阴影效果。光源离对象越近;对象的阴影在墙壁或屏幕上显示的越大。同样,如果墙或屏幕远离静止光源和样品,物体的阴影会增大,但会变暗。当需要足够的信号、高分辨率和较短的扫描时间时,优化 X 射线源和探测器工作距离是一项极具挑战性和精神刺激性的任务。与任何事物一样,几何放大率也有局限性,即点源的理想化被破坏,畸变变得霸道。

在微CT中,许多挑战之一是,在扫描完成和重建之前,3D体积的视觉质量对研究者是未知的。不过,如果有足够的经验,仔细研究一些 2D 投影可以提供足够的信息,以便对 CT 扫描充满信心。在以下各节中,一组练习将揭示不同成像参数对数据集的影响,并让科学家了解获得干净的 3D 卷所需的情况。为了进行本调查,将探测生物样本,尽管该过程不限于样品类型。

安装示例听起来像是一个微不足道的步骤,但它是最重要和被忽视的步骤之一。无论应用如何,样品都应以尽可能紧凑的方式安装。考虑到 [3] 中的图像,假设源和探测器位置的范围有限,因为样品停留在一个方向上,以及这将如何影响几何放大。除了工作距离外,安装也会极大地影响吞吐量。如果样本是来自大鼠的完整膝关节,那么安装样品,使头骨和股骨直立是有意义的。这样,X 射线就会通过一小段距离,探测器上有足够的信号。安装样品时,最后要考虑的就是稳定性。微型CT的最大敌人是运动。如果样本移动的幅度接近扫描的分辨率,它可能是无用的数据。运动应受安装安全附着力和控制样本成分变化的限制。对于生物样品,这意味着确保在扫描长度上不会通过蒸发而改变形态。在阿甘蔗凝胶中悬浮或包裹在一层薄薄的石蜡薄膜中是避免脱水和运动的可能方法。

X 射线能量也会对最终 3D 体积的质量产生很大影响。目标是在检测器上获得足够的信号,同时从样品中获得足够的衰减。X射线衰减遵循方程(1),其中I是最终计数数(强度),I0是计数的初始数数,α是给定材料和X射线能量(广泛发布)所特有的质量吸收系数,=是材料的密度,x是X射线路径长度。

Equation 1 (1)

理想情况下,I/I0(即传输值)在样品的所有方向时应介于 5 - 95% 之间,最佳结果在中间范围内。要检查此值,请拍摄样本的图像,然后将图像的像素值除以空气图像(即与视野外的示例)。此规范化常见于系统软件工作流中。生物样品往往要求在源头使用X射线滤波,因此这里不会涉及。除了具有理想的传输值外,样品任何部分的理想计数数为 5000 计数。为了确保这一点,可能需要增加每个投影的曝光时间。这将增加整体扫描时间。图 1 显示了干净的 2D 投影。

Figure 1
图1:小鼠脊髓的2D图像在0°(左)和90°(右)对空气进行正常化。

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Procedure

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1. 安装样品(骨)

  1. 为了检查骨骼网络,如脊柱,将结构悬浮在胶合糖凝胶中,并允许在非常薄壁的塑料管中固化(图2)。管的薄度非常重要,极大地影响了信号吞吐量和整体图像质量。这反过来又会影响您解析功能的能力。管的传输值应尽可能接近 100%。
  2. 用胶带或定制支架将管子安装在样品台上,最终确保样品在舞台旋转时保持静止和稳定。

Figure 2
图2:小鼠脊柱悬浮在薄壁塑料管内的胶质凝胶中,位于微CT系统的样品阶段。

2. 图像采集

  1. 打开 X 射线源,使能量范围在 90 keV (90 kV 和 10 W) 左右。
  2. 在源预热并稳定在能量上后,通过系统软件获取图像。
  3. 通过根据空气图像对图像进行规范化来检查传输值。对于自动引用采集和应用,确保样品可以向给定方向移动而不崩溃。
  4. 如果图像的传输过高,则逐渐降低能量,直到传输值足够。请务必相应地增加曝光时间,使图像不会出现嘈杂和颗粒状。如果图像的传输过低,则逐渐增加能量,直到传输值足够。
  5. 开始将 X 射线源移近到样本的位置,同时非常小心,不要将其碰撞。使源尽可能靠近示例是朝着最大化吞吐量和确保最佳分辨率的方向迈出的一步。
  6. 完成此操作后,通过使用线性执行器移动样本级来优化样本的视场。
  7. 该软件将显示一个参数称为像素大小,处理类似于当前分辨率(尽管它确实不同)。
    1. 如果数字仍然太大,并且源非常接近,探测器可以开始远离样品。
    2. 如果数量太小,应小心地将探测器移近样品。
    3. 尝试不同的光学目标和探测器位置,但请注意在尝试优化扫描参数时引入的并发症。
  8. 检查样品的每个方向,确保没有崩溃,以找到最佳曝光时间。由于工作距离、像素大小和样本位置的变化,因此可以执行此操作。
  9. 缓慢旋转样品 2 度,同时通过机柜内摄像头监控其相对于源和探测器的位置。如果可能发生碰撞,请确保将源和探测器移开。
  10. 查找最长的 X 射线路径长度,从而生成最少的计数/传输值,并查找在各地确保大约 5000 个计数所需的曝光时间。

3. 断层扫描提交和重建

从用户的角度来看,重建过程并不比前面步骤中所做的任何其他参数选择更复杂。但是,此过程的编程和计算费用实际上相当可观。用户必须力求最好地了解流畅的软件 UI 下发生的情况,以及决策如何影响最终产品。许多 CT 系统采用迭代代数重建算法,其中 2D 投影转换为一系列描述像素值的线性方程。其他一些系统利用过滤的反向投影算法,其中 Radon 转换将投影转换为中光图,然后通过一系列线集成操作传递。当然,有些使用其他方法,甚至混合方法。在参与这些算法的最低程度下,众所周知,预测数和总旋转位移对最终重建体积有影响。

  1. 首先,根据样品的纵横比,决定是扫描超过 180° 还是 360°。如果样本的纵横比较高,则 X 射线路径长度在 90° 方向处比 0° 方向长约 4 倍或更多,而不是 180°扫描,这是一个明智的选择。(论点是,在短 X 射线路径长度上收集的信息在一侧对另一侧没有差别。如果可以专用于长 X 射线路径长度方向的投影数超过数据集将受益。投影之间的角位移将较低,并且从这些棘手的方向输入到重建算法中的信息会更多。如果纵横比不高,请使用 360° 扫描。
  2. 接下来,选择投影数和总角度位移,这将决定投影之间的角度。此角度越小,进行的插值越少,细要素信息也会被截断。(必须建立平衡,因为更多的投影意味着较长的扫描时间,这与样本可以移动的较大窗口相关,扫描其他事物的时间更少,源寿命更短。经验法则是在 360° 以上至少有 800 个投影,并且不超过 3200 个投影。
  3. 提交扫描。
  4. 在断层扫描完成后(通常在 4 - 16 小时之间),将 2D 系列图像引入系统的(或某些开源)重建软件。
  5. 选择最佳中心移位校正。中心移位是使项目对齐的参数(想想需要收集并对齐的大致随机洗牌的卡片组,以便像整齐的堆栈一样坐起来)。此值通常在 -10 到 10 像素之间。
  6. 选择最佳光束硬化校正系数。光束硬化校正是人工去除样品滤波产生的对比度。如果样品足够厚或含有一系列轻重材料,则根据低能(软)X 射线的衰减,其对比度会错误。这应该保守地应用。平均值介于 0 - 0.5 之间。
  7. 提交重建。

微CT扫描是从不同方向的一系列X射线图像中创建的三维图像。1901年,第一个诺贝尔物理学奖授予了朗特根博士,因为他发现了X射线,并通过成像他妻子的手来证明其用途。

X射线吸收成像仍然是不可或缺的工具,特别是在大学实验室和医院。其中最先进的用途是采用一系列二维 X 射线投影来重建三维体积。这称为计算机断层扫描或CT。 Micro-CT使用相同的基本方法,但会产生更小体积的更高分辨率的图像。

本视频将演示如何获取 X 射线图像并使用它们生成微 CT 扫描,说明该技术的原理,最后讨论其一些应用。

现在,让我们来看看X射线图像是如何形成的,并检查将它们组装到微CT扫描中背后的原理。

典型的微型CT系统具有三个主要组件,一个X射线源,一个样品的旋转阶段和一个探测器。在X射线源中,带负电荷的电子在真空中被射出,它们击中目标并与目标相互作用。电子通过目标材料减速并发出X射线。这种X射线生成现象被称为"布雷姆斯特拉隆"或"制动辐射"。然后,X 射线离开源,在到达探测器之前被样品吸收、分散或传输。吸收是微CT测量的主要相互作用,这是因为样品中不同材料在X射线吸收方面差异很大。

骨骼含有大量的原子钙,比软组织吸收X射线更多。被吸收的X射线不会到达探测器,骨头在X射线中显示为白色。断层扫描的输出是一系列不同方向的 2D 投影,可重建为 3D 体积。X 射线能量需要平衡,以便样品和探测器的信号有足够的衰减。

测量的强度或X射线数,I,取决于衰减前的强度,I-无,材料的质量吸收系数,mu,材料的密度,rho,和X射线路径长度,X。I-无,对于样品的所有方向,应介于 5 到 95% 之间,最佳结果在中间范围内。通过拍摄样本图像,然后将图像的像素值除以空气图像中的像素值来检查此值。

现在,您已经了解了微型 CT 扫描背后的原理,现在让我们演示如何生成一个扫描。

在本演示中,将获取小鼠脊柱的微CT扫描。

首先,获得悬浮在甘蔗凝胶中的样品。样品应在薄壁塑料管中固化,以防止样品移动和脱水。管壁应尽可能薄,以减少信号吞吐量并提高整体图像质量。

然后,使用胶带或定制支架将管子安装在样品台上。确保样品在舞台旋转时静止且稳定。现在,打开 X 射线源,将其设置为 90 千电子伏特或 90 千伏电压,并将功率设置为 8 瓦。一旦源预热,通过系统软件获取映像。对于自动采集和应用,确保样品可以向给定方向移动而不发生碰撞。通过根据空气图像对图像进行规范化来检查传输值。

如果图像的传输过高,则逐渐降低能量,直到传输值足够。如果图像的传输过低,则逐渐增加能量,直到传输值足够。如果样品出现噪音或颗粒状,根据需要增加曝光时间。

接下来,将 X 射线源尽可能靠近样品,以最大限度地提高吞吐量并获得最佳分辨率。小心不要把它们撞在一起。通过使用线性执行器移动样品级,优化样品的视场。然后,找到图像的像素大小。如果 CT 系统通过将 X 射线信号转换为可见光信号支持光学放大,请尝试不同的光学目标和探测器位置。但是,请注意,这将影响扫描参数。

进行必要的调整后,找到最佳曝光时间。缓慢旋转样品以两度为增量,同时通过机柜摄像机监控其相对于源和探测器的位置。如果可能发生碰撞,则进一步将源和探测器分开。

最后,找到最长的 X 射线路径长度,从而生成最少的计数数,并确定所有位置大约 5,000 个计数所需的曝光时间。

现在,让我们看看如何获取一系列图像。首先,根据样品的纵横比选择 180 度或 360 度的扫描。对于高纵横比,请选择 180 度扫描,对于低纵横比,请选择 360 度扫描。如果 X 射线路径长度在一个方向上比另一个方向大四倍或更多,请选择 180 度扫描。

接下来,选择将指示投影之间的角度的投影数和总角度位移。较小的角度可减小精细要素信息的插值量,但会增加扫描时间。经验法则是至少有 800 个投影,但在 360 度扫描中通常不超过 3,200 个投影。

现在,提交扫描。完整的X射线图像系列需要几个小时到几十个小时才能获取。扫描完成后,将 2D 图像系列加载到重建软件中。现在,选择最佳的中心移位校正,以便图像围绕共享轴排列。此值通常在负 10 到 10 像素之间。

接下来,选择最佳光束硬化校正系数。这消除了低能量 X 射线衰减产生的假对比度。平均值介于 zeri 和 0.5 之间。然后提交重建。重建微CT扫描后,即可对结果进行分析。

下面是使用此过程获得的具有代表性的微 CT 扫描。在这里,我们看到鼠标脊髓的3D体积。进一步的图像处理两个数字横截面切片允许定量数据,如材料孔隙度,并使用软件工具获得特征大小。椎骨通道和椎间通道各段之间的间距被测量为数百微米。

这是另一个微CT扫描,是从老鼠的膝盖获得的。我们可以看到皮质骨的孔隙度,并可以测量大鼠膝盖皮质骨内的间距和关节软骨的厚度。

您刚刚看到矿化生物样品的微CT扫描,但3D X射线断层扫描的应用扩展到微电子学、地质学、增材制造、燃料电池等领域。我们将检查其他几个实例。

尽管动物软组织的自然低吸收率较低,但可以获得高分辨率的X射线图像。这是通过使用简单的对比染色来实现的。在此示例中,小鼠后脑在成像前使用 Lugol 的碘溶液进行染色。然后准备、加载样本并拍摄 X 射线图像。最后,微CT扫描被创建清楚显示后脑的病变。

微CT可用于表征电子设备的微观结构。在此示例中,将扫描 LED。微型 CT 扫描使工程师能够分析设备故障或对设备进行反向工程。

三维结构可以从微CT数据创建。在此示例中,对大鼠进行麻醉和扫描。然后可以分析数据,以区分骨骼结构和周围组织。最后,可以使用 3D 打印机创建结果的物理模型。

您刚刚观看了 JoVE 关于从 2D X 射线图像创建 3D 微 CT 扫描的介绍。现在,您应该了解 X 射线成像背后的原理、X 射线图像和 CT 扫描之间的关系、如何生成样本的微 CT 扫描以及一些应用。感谢您的收看!

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Results

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下图概述了使用上述步骤使用微型 CT 可以获得的结果。根据这些图像,可以直接记录不同吸收的定性测量。定量数据(如材料孔隙度、特征大小和分布等)需要额外的图像处理在不同的软件中。

Figure 2
图3:小鼠脊髓(左)和两个数字横截面切片(右)的三维体积

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Applications and Summary

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该实验研究了使用微CT时应考虑的许多因素,特别是生物样品。该项目旨在帮助调查人员了解他们的决策将如何影响微CT可以提供的数据。如所示,有许多依赖和敏感的参数应考虑包括:安装、X 射线能量、曝光时间、源和探测器定位、投影数和总扫描角度位移。本练习旨在作为介绍,仅对 CT 数据集的控制面进行划痕。

该实验侧重于介绍微CT与生物样品成像,但三维X射线断层扫描的应用扩展到微电子学、地质学、增材制造、涂料、燃料电池等领域。.这些显微镜用于检测、故障分析、表征、质量控制,甚至无损测试。由于现在可以无损地访问真实 3D 信息,因此可以从 CT 中提取的几何图形导入到模拟中,以便虚拟地测试对象。

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References

  1. http://www.spectroscopyonline.com/tutorial-attenuation-X-rays-matter [cited 1 November 2017]
  2. http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/quantum/xrayc.html [cited 1 November 2017]
  3. A.G. Rao, V.P. Deshmukh, L. L. Lavery, H. Bale, "3D investigation of the microstructural modification in hypereutetic aluminum silicon (Al-30Si) alloy." Microscopy and Analysis 2017 [cited 1 November 2017].

Transcript

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