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Amostras biológicas de imagem com Microscopia Óptica e Confocal
 
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Amostras biológicas de imagem com Microscopia Óptica e Confocal

Overview

Fonte: Peiman Shahbeigi-Roodposhti e Sina Shahbazmohamadi, Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Connecticut, Storrs, Connecticut

Os microscópios ópticos existem há séculos e, embora tenham atingido sua limitação teórica de resolução décadas atrás, novos equipamentos e técnicas, como o processamento de imagens confocal e digital, criaram novos nichos no campo da imagem óptica. Os melhores microscópios ópticos normalmente terão uma resolução de até 200 nm em condições ideais. No entanto, os microscópios ópticos são limitados pela difração das ondas, uma função do comprimento de onda, que é em torno de 500 nm para luz visível. Embora a resolução de microscópios ópticos não atinja a dos microscópios eletrônicos, eles são as ferramentas mais valiosas na imagem das macroestruturas biológicas e são um grampo em qualquer laboratório biológico.

Nos microscópios de luz convencionais, o sinal produzido a partir do objeto imaged é da espessura total do espécime, o que não permite que a maioria dele esteja em foco para o observador. Isso faz com que a imagem tenha "desfocado fora de foco". O microscópio confocal, por outro lado, ilumina a amostra através de um orifício de pinos e, portanto, é capaz de filtrar a luz fora de foco de cima e abaixo do ponto de foco no objeto.

Esta demonstração fornece uma introdução à aquisição de imagens usando métodos de microscopia óptica e confocal. Aqui, um pedaço seccionado do cérebro do rato será estudado.  A aquisição e análise de imagens, incluindo as ferramentas para gerar mapas topográficos e imagens compostas, serão abordadas. As vantagens e desvantagens de diferentes métodos de imagem no que se referem à resolução, profundidade de foco e tipo de amostra também serão discutidas. O objetivo desta demonstração é fornecer mais informações sobre microscópios ópticos e confocal para determinar se esses módulos de microscopia são os mais adequados para um tipo de amostra biológica.

Principles

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Microscópios ópticos funcionam usando pelo menos dois elementos de ampliação. A lente primária, chamada de objetivo, determina a ampliação total, e a lente secundária, chamada de ocular, concentra a imagem virtual para visualização. A ampliação total é determinada multiplicando as ampliações das duas lentes. O foco da luz através dessas fontes, juntamente com o foco da luz da lâmpada para a amostra, dão um plano de foco especificado onde a ampliação e a luz da lâmpada se encontram no mesmo ponto, o que dá a melhor resolução na imagem. A figura abaixo demonstra como o plano focal do espécime é criado através das diferentes lentes. Objetos fora do plano focal terão feixes de luz interferindo de outras partes da amostra devido à maior área de iluminação. Isso causa desfoque na imagem. Portanto, para focar em diferentes posições z de uma amostra com alturas amplamente variadas, as fatias de direção z devem ser movidas para o plano focal.

Figure 1
Figura 1. Lentes de microscopia óptica e planos focais.

Microscópios digitais trabalham no mesmo princípio que microscópios ópticos, exceto que não depende de uma ocular. É um microscópio óptico equipado com uma câmera digital. A câmera digital funciona como um detector, e as imagens são exibidas em um monitor de computador. Esses microscópios são ideais para a análise e documentação de amostras durante pesquisa e desenvolvimento (P&D), fabricação e inspeção, controle e garantia de qualidade (QC/QA), bem como análise de falhas (FA). Eles geralmente oferecem software que permite que os usuários analisem a imagem da amostra. A Figura 2 mostra uma configuração típica do microscópio digital.

Figure 2
Figura 2. Principais componentes do microscópio digital.

Os principais componentes do sistema são:

  1. Motor óptico: Contém o sensor de aquisição de imagens e lentes para ampliar a imagem.
  2. Objetivo: Adquire e concentra a luz da amostra. Três objetivos diferentes estão disponíveis para várias tarefas de aquisição de imagens.
  3. Estágio de digitalização: Local onde a amostra deve ser colocada.
  4. Suporte de microscópio: Fornece o suporte para o motor óptico e o estágio de digitalização. Também controla a comunicação entre os componentes conectados e o computador.
  5. Computador: Suporta o software do usuário e permite que as imagens sejam visualizadas no monitor.
  6. Controlador: Controla o microscópio e o fluxo de trabalho usando gestos multi-toque e ícones específicos do contexto sensíveis ao toque. Os botões de controle controlam a posição de imagem de zoom, foco e microscópio.

Um microscópio confocal, ou microscopia de varredura a laser confocal (CLSM), é um microscópio com maior resolução óptica e contraste. Confocal significa "ter o mesmo foco". O objeto e sua imagem são "confocal".

Figure 3
Figura 3. Borrar e seu efeito em uma imagem. A imagem esquerda mostra uma imagem fora de foco com bordas borradas. A imagem certa demonstra o caminho da luz através da lente ao fotografar uma amostra que está em foco.

Ao contrário dos microscópios de luz gerais que iluminam e visualizam toda a amostra à vista, os microscópios confocal utilizam um orifício entre o estágio da amostra e o detector para que apenas um feixe menor de luz seja focado em um nível de profundidade estreito de cada vez. Assim, a única área visível da amostra é o ponto em foco. O microscópio confocal então escaneia a superfície da amostra com este feixe de luz muito mais focado (ou um laser). Os dados são então montados em uma imagem 2D que tem melhor resolução do que a microscopia óptica clássica. Além disso, como a luz é focada em uma faixa muito estreita de alturas, o usuário pode colocar diferentes planos em foco à medida que a direção Z é movida. Através de técnicas de processamento de imagem e microscópios confocal de software de automação auxiliam na reconstrução 3D de imagens compostas focadas em vários aviões.

Microscópios confocal têm a capacidade através do processamento de imagens para dar dados de direção Z sobre uma amostra que anteriormente não estava disponível em microcopia óptica. Por exemplo, na demonstração descrita abaixo, o usuário pode definir as faixas superiores e inferiores de foco para uma amostra, e, em seguida, não apenas desenvolver um mapa de calor mostrando medidas da direção z, mas também criar uma imagem composta que mostra todas as partes da imagem em foco. Esses recursos são especialmente úteis na obtenção de dados 3D sobre uma amostra.

Figure 4
Figura 4. Principais componentes de um microscópio confocal.

Os principais componentes do microscópio confocal incluem:

  1. Escaneie a cabeça com unidade Z fina e câmera de 4 megapixels, fique com unidade Z grosseira
  2. Objetivos: 2.5x/ 5x/ 10x/ 20x/ 50x/ 100x
  3. Etapas: Estágio de digitalização e estágio fixo
  4. Sistema de Computador: Software de imagem do sistema pc
  5. Controlador: x, y, z movimento

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Procedure

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1. Imagem confocal

  1. Coloque a amostra no palco. Centralizar-o sob as lentes. Não deve exceder a limitação de peso do estágio, que neste caso é de 5 kg. A amostra não deve ter mais de 100 mm de espessura.
  2. Abra o software de imagem e selecione "Criar trabalho".
  3. Na Coluna Topografias,escolha o botão assistente.
  4. Crie uma imagem de visão geral na menor ampliação, 2,5X. Antes de mudar as ampliações, certifique-se de que a amostra está em foco alterando a posição Z até ver uma imagem clara. Isso pode ser feito empurrando para baixo ou puxando para cima no manipulador de microscópio 3D. O movimento Z mais fino é atingido por engajar o botão na lateral, o que causa uma luz azul ao redor das bordas.
  5. Aumente lentamente a ampliação da lente, jogando continuamente com a intensidade da luz e o foco até que você esteja na ampliação desejada. Se desejar, escolha uma área diferente de interesse movendo o palco nas instruções x e y usando o manipulador.
  6. Uma vez que uma imagem de visão geral seja tirada na baixa ampliação, aperte o botão seguinte para prosseguir para a etapa do Ponto de Referência. Se desejar, especifique um determinado ponto de referência por causa da medição (ou seja, o canto da amostra), embora para isso o ponto de referência padrão esteja bem.
  7. Acerte a próxima seta para seguir para a próxima parte do mago.
  8. Altere o objetivo conforme desejado para ver uma resolução apropriada para sua amostra. Neste caso, a lente objetiva 50X é usada para visualizar as células da amostra. O 50X é a lente mais próxima da amostra, então suba gradualmente até o objetivo de 50X garantindo que ainda haja espaço para diminuir a distância de trabalho após a lente 20X.
  9. Na página "Definição de intervalo de medição", mova ligeiramente a posição Z (clicando no botão lateral no manipulador para ajustes finos) de modo que apenas a parte superior da amostra esteja em foco e clique em "Definir por último". Em seguida, mova o palco na direção Z (para baixo) até que apenas a parte inferior da amostra esteja em foco e pressione "Definir Primeiro". Certifique-se de que o número de fatias calculadas não exceda 1000 ou que o programa falhe.
  10. Certifique-se de que a intensidade da luz não se sobressatura (causa pixels vermelhos) na imagem em qualquer um dos níveis e, em seguida, bata feito. Isso vai tirar a imagem da tomografia e abrir o software de tomografia.
  11. No software de tomografia, abra guias como a guia Estudos para visualizar os dados em 3D e fazer medições em espaço 2D ou 3D.

2. Imagem de microscópio óptico digital

  1. Coloque a amostra no palco. Centralizar a amostra sob a lente. O peso amostral não deve exceder a limitação de peso do estágio, que neste caso é de 4 kg. A amostra não deve ser superior a 12 cm.
  2. Abra o software de imagem.
  3. Selecione um Trabalho na lista de modelos fornecidos. Também é possível trabalhar fora de um trabalho pressionando o Exame Livre, que permite estudar uma amostra fora de um trabalho.
  4. Adquira uma imagem geral que mostra todo o palco. Isso servirá como um mapa mais tarde para exibir a parte da amostra que está sendo vista. Ao adquirir a imagem, use o controlador para alterar o foco e a posição da imagem.
  5. Coloque um sistema de coordenadas. O sistema de coordenadas padrão é do canto traseiro esquerdo da etapa e está bem para esta aplicação. Se a amostra estiver torta, você pode ajustar as coordenadas aqui.
  6. Nomeie a amostra e o trabalho, isso adiciona-a à lista de trabalhos para que outros usuários possam retornar a ela.
  7. Selecione o botão da câmera em Acquire. Pegue uma imagem inicial e pressione o botão ao vivo enquanto navega pela amostra.
  8. Mova o foco para baixo até que a amostra esteja claramente em foco. Pode ser necessário também ajustar a iluminação sob a aba Iluminação e Abertura".
  9. Otimize a imagem com as ferramentas sob o painel de Otimização de Imagens. Você pode jogar com diferentes parâmetros sob a guia Aprimoramentos de imagem, como a inclinação da lente, os níveis de iluminação na amostra e brilho e contraste, até que a imagem tenha a crocância desejada.
  10. Execute medições tocando na ferramenta Lápis no software. A partir daí, você tem acesso a várias ferramentas de medição, incluindo distâncias, ângulos e área. Use as ferramentas de distância e área para medir o tamanho da amostra.
  11. Vá para a guia Fluxo de trabalho de resultados e verifique o layout do fluxo de trabalho para configurar o layout do relatório
  12. Toque no botão salvar para salvar seu trabalho para que outros possam usar o mesmo fluxo de trabalho.

Microscopia é um método amplamente utilizado para a imagem da estrutura detalhada das amostras. Microscópios ópticos, que concentram a luz através de uma série de lentes para ampliar amostras, estão em uso há séculos com o primeiro microscópio composto aparecendo no século XVII. Durante esse tempo, Antonie van Leeuwenhoek foi a primeira a observar bactérias, leveduras, glóbulos vermelhos e circulação em vasos capilares, fazendo contribuições científicas significativas e abrindo caminho para avanços microscópicos.

Microscópios ópticos ainda são amplamente utilizados hoje em pesquisas e ambientes clínicos para diagnóstico médico. No entanto, nos últimos 60 anos, surgiu a microscopia confocal que ilumina a amostra através de um pinhole para aumentar a resolução óptica e o contraste.

Este vídeo ilustrará os princípios operacionais da microscopia óptica e confocal, demonstrará como imagens de alta resolução são analisadas e discutirá diversas aplicações de microscopia no campo da engenharia biomédica.

Vamos começar discutindo os fundamentos da microscopia confocal. A microscopia óptica baseia-se no princípio de focar a luz em uma amostra para imagem de sua estrutura detalhada. Um microscópio é formado por dois componentes de ampliação; a lente objetiva, que foca uma imagem real de um objeto, e a ocular, que foca uma imagem virtual ampliada antes de ser recebida pelo olho. A ampliação total é alcançada multiplicando as ampliações dessas duas lentes.

O foco da luz dá um plano de foco especificado onde a ampliação e a luz da lâmpada se encontram no mesmo ponto, o que dá a melhor resolução na imagem. Quando fora do plano focal, a área de iluminação é maior e os feixes de luz interferem de outras partes da amostra, fazendo com que a imagem fique embaçada. Onde os microscópios de luz iluminam e visualizam toda a amostra à vista, um microscópio confocal utiliza um orifício entre o estágio da amostra e o detector para que apenas um pequeno feixe de luz seja focado em uma profundidade estreita de cada vez.

Consequentemente, a única área visível da amostra é o ponto em foco, proporcionando uma imagem bem resolvida. No entanto, com maior resolução, apenas uma pequena parte desta amostra é imageda de cada vez. Ao mover a amostra no plano X-Y, uma varredura rasteral de sua superfície pode ser realizada. Para cada ponto da varredura, o foco é otimizado ajustando a altura Z para acessar diferentes planos focais. Isso garante uma resolução máxima ponto a ponto da amostra de imagem.

Agora vamos usar esses princípios de microscopia e resolução de imagem para imaginar um cérebro de rato usando um microscópio confocal e óptico.

Tendo revisto os principais princípios da microscopia, vamos agora realizar uma medição usando um microscópio confocal. Primeiro, ligue o microscópio na estação de trabalho do computador. Em seguida, carregue a amostra no palco e centrale-a sob a lente. Agora abra o software de imagem e selecione criar um novo trabalho. Vá até a coluna da topografia e escolha o botão assistente. Selecione a menor ampliação, que para este microscópio, é de 2,5x. Em seguida, use o manipulador de microscópio 3D para ajustar a posição Z da amostra e colocar a amostra em foco. Pressione o botão na lateral para que uma luz azul apareça ao redor das bordas. Isso permite um movimento e foco Z mais finos. Agora capture uma imagem de visão geral.

Aumente lentamente a ampliação da lente e ajuste a intensidade da luz e o foco para obter a ampliação desejada. Use o manipulador 3D nas instruções X e Y para selecionar diferentes áreas de interesse na amostra. Uma vez que uma imagem é tirada em baixa ampliação, pressione ao lado para tomar um ponto de referência. Use o ponto de referência padrão ou especifique um novo no canto da amostra e pressione em seguida. Agora, mude gradualmente o objetivo para a resolução desejada para a amostra. Para esta amostra, um objetivo de 20x é usado para visualizar as células no tecido cerebral do camundongo. Certifique-se de que há espaço para diminuir a distância de trabalho.

Para definir a distância para coletar fatias, primeiro vá para a página de definição de intervalo de medição e use o manipulador 3D para finalmente ajustar a amostra na direção Z. Clique em definir por último quando a parte superior da amostra estiver em foco e clique em conjunto primeiro quando a parte inferior da amostra estiver em foco. Certifique-se de que o número de fatias calculadas não exceda 1.000 ou que o programa falhe. Verifique se não há pixels vermelhos, o que indica que a intensidade da luz está supersaturada.

Finalmente, a imprensa fez para tirar a imagem da tomografia. Quando o software de tomografia abrir, selecione a guia de estudos para visualizar os dados em 3D e faça medições 2D e 3D.

Agora vamos tirar uma imagem usando um microscópio óptico digital. Primeiro, ligue o microscópio e abra o software de imagem. Em seguida, carregue a amostra no palco e centrale-a sob a lente. Quando o software de imagem estiver aberto, selecione um trabalho na lista de modelos ou escolha o exame gratuito. Em seguida, adquira uma imagem geral que mostra todo o palco. Use o controlador para alterar o foco e a posição da imagem.

Uma vez concluída a aquisição, coloque um sistema de coordenadas na imagem. O sistema de coordenadas padrão está no meio do estágio. Para maior flexibilidade, as coordenadas podem ser alteradas manualmente.

Em seguida, nomeie a amostra e selecione o botão da câmera. Pressione o botão ao vivo enquanto navega pela amostra e mova o foco para baixo até que a amostra esteja claramente em foco. Se necessário, use a aba de iluminação e abertura para ajustar a iluminação. Em seguida, adquira uma imagem da amostra.

Use as ferramentas sob o painel de otimização de imagem, como a inclinação da lente, os níveis de iluminação na amostra e o brilho e contraste na imagem para otimizar a imagem à crocância desejada. Agora toque na ferramenta de lápis para executar as medidas. Use as ferramentas de distância e área para medir o tamanho das células da amostra.

Por fim, vá para a guia de fluxo de trabalho de resultados e configure o layout do relatório. Toque no botão salvar para salvar o trabalho para mais análises.

Agora vamos analisar as imagens de um cérebro de rato que foram tiradas com microscópios ópticos confocal e digitais. A imagem confocal em 50x de ampliação é de alta resolução e fornece foco profundo com diferentes níveis de profundidade de informação.

No mapa tomográfico, a parte alta desta amostra varia de um a nove mícrons. Características como amplitude, perfil de rugosidade e parâmetros de curva podem ser analisadas. No entanto, todo o slide do tecido cerebral seccionado pode ser imagens usando um microscópio óptico digital.

O zoom em uma seção mostra mais detalhes da amostra, mas em uma resolução muito menor do que o obtido com microscópio confocal. Esta amostra foi obtida em ampliação de 300x. O software dedicado oferece ferramentas para medir dimensões transversais, como o diâmetro, bem como para calcular a área interna da seção.

Microscopia digital, óptica e confocal são ferramentas padrão usadas em várias aplicações biomédicas. A oftalmoscopia a laser de varredura ou SLO é uma técnica de imagem não invasiva que é amplamente utilizada na oftalmologia clínica para diagnosticar e monitorar o desenvolvimento de doenças da retina.

A SLO produz imagens estereoscópicas de alto contraste que visualizam a microglia. Os macrófagos residentes da retina, que estão envolvidos em várias doenças da retina. A microscopia confocal também é usada em imagens de células vivas que permite aos pesquisadores visualizar a função celular biológica microscópica em tempo real.

Esta técnica é utilizada para estudar migração celular e proliferação e dinâmica proteica, entre outros. Aqui, receptores transmembranos e lysosomos foram rotulados com corantes fluorescentes e sua colocalização foi analisada utilizando imagens de timelapse para investigar a internalização do receptor.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à microscopia digital, óptica e confocal. Agora você deve entender os princípios da microscopia e resolução de imagens, como operar microscópios ópticos e confocal para amostras biológicas de imagem, e várias aplicações de seu uso no campo da engenharia biomédica.

Obrigado por assistir.

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Results

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As imagens a seguir dão uma visão geral dos resultados que podem ser obtidos de um cérebro de rato usando um microscópio confocal. Eles mostram como diferentes níveis de informação podem ser obtidos e como um mapa topográfico dos resultados revela a altura da amostra.

Figure 5
Figura 5: Imagens confocal na ampliação de 50X mostrando um cérebro de rato seccionado. A imagem à esquerda é uma imagem composta que tira todos os planos em foco durante a tomografia e cria uma imagem de alta resolução e profundamente focada. A imagem à direita mostra o mapa topográfico da amostra.

Figure 6
Figura 6: Como um exemplo melhor representativo das aplicações 3D do microscópio confocal, um buraco no plástico foi imageado e analisado. O mapa topográfico original está à esquerda e a reconstrução 3D está à direita.

Figure 7
Figura 7: Mostra a extensão da análise do software ConfoMap para observar um perfil a partir de uma reconstrução 3D. Os parâmetros de amplitude, o perfil de rugosidade, a caracterização da curva são mostrados.

As imagens a seguir dão uma visão geral dos resultados que podem ser obtidos a partir do uso de um microscópio óptico digital na mesma fatia cerebral do mouse. O microscópio digital oferece um campo de visão maior, mas imagens de menor resolução do microscópio confocal, ideal para olhar para componentes maiores ou estruturas biológicas. O software possui ferramentas de análise úteis para medir a amostra.

Figure 8
Figura 8: Imagem de visão geral mostrando fatia de órgão inteiro.

Figure 9
Figura 9: Ampliado na imagem de um cérebro de rato seccionado. Aqui está um campo de visão de 300 mícrons obtido com iluminação coaxial e anel mista, bem como estabilização eletrônica de imagem.

Figure 10
Figura 10: Demonstração das capacidades de medição do microscópio óptico digital. O diâmetro da amostra é medido à esquerda, e um contorno definido pelo usuário que é usado para calcular a área interna do cérebro do rato seccionado é mostrado à direita. Essas ferramentas são úteis na análise de amostras biológicas, que podem não ter bordas que são as mesmas que formas pré-definidas.

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Applications and Summary

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Nesta demonstração, a profundidade de foco, campo de visão e resolução máxima e ampliação de microscópios ópticos e confocal foram otimizados para visualizar amostras biológicas. Esta demonstração foi projetada para ajudar o participante a decidir qual módulo de microscopia é o melhor para uma determinada aplicação. Ambos os modos de microscopia têm vantagens na análise de amostras biológicas para sua facilidade de preparação e imagens compostas de alta resolução.

As aplicações para microscopia óptica e confocal são de longo alcance. Devido à preparação limitada da amostra e à capacidade de integrar planos de movimento e usar técnicas de luz acima da amostra, essas ferramentas são capazes de obter informações da maioria dos conjuntos de dados. A microscopia tem sido uma opção muito popular quando se imagem de células vivas, como aquelas tratadas com fluorescência, mas as aplicações podem variar desde superfícies de imagem de dispositivos biomédicos até detectar defeitos e rugosidade antes de implantá-las no corpo. A microscopia confocal e óptica são o padrão atual para amostras biológicas de imagem.

Finalmente, a microscopia confocal oferece imagens melhoradas com técnicas de fluorescência. Fluoroforos em uma amostra têm uma vida limitada e podem foto-branquear quando expostos a altas quantidades de luz. Na microscopia de luz tradicional, toda a amostra é iluminada durante a imagem, o que resulta em rápida foto-branqueamento. No entanto, uma vez que apenas uma pequena porção da amostra é iluminada ao mesmo tempo com microscopia confocal, a vida útil do fluoróforo é maior e há menos desafios associados ao branqueamento fotográfico.

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Transcript

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