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光学・共焦点顕微鏡による生体試料のイメージング
 

光学・共焦点顕微鏡による生体試料のイメージング

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顕微鏡検査は、試料の詳細な構造を画像化するために広く用いられている方法である。一連のレンズを通して光を集めて試料を拡大する光学顕微鏡は、17世紀に初めて現れた化合物顕微鏡で何世紀にもわたって使用されてきました。その間、アントニー・ファン・レーウェンフックは、毛細血管内の細菌、酵母、赤血球、循環を初めて観察し、科学的に大きな貢献をし、顕微鏡的進歩への道を開きました。

光学顕微鏡は、医療診断のための研究や臨床現場で現在でも広く使用されています。しかし、過去60年間で、光分解能とコントラストを高めるためにピンホールを通してサンプルを照らす共焦点顕微鏡が出現しました。

このビデオでは、光学顕微鏡と共焦点顕微鏡の動作原理を示し、高解像度画像の解析方法を実証し、生物医学工学の分野における顕微鏡工学のいくつかの応用について議論します。

共焦点顕微鏡の基礎について話し合うから始めましょう。光学顕微鏡は、試料に光を集束してその詳細な構造を画像化するという原理に基づいています。顕微鏡は2つの拡大成分で形成される。物体の実像に焦点を当てた対物レンズと、目で受け取る前に拡大された仮想画像に焦点を当てた接眼レンズ。総倍率は、これら2つのレンズの倍率を乗じて達成されます。

光の焦点は、拡大とランプライトがすべて同じポイントで交う特定の焦点面を与え、画像内で最高の解像度を与えます。焦点面の外側では、照明の領域が大きくなり、光線がサンプルの他の部分から干渉し、画像がぼやけてしまいます。光顕微鏡がサンプル全体を照らして画像化する場合、共焦点顕微鏡はサンプルステージと検出器の間のピン穴を利用して、一度に1つの狭い深さに小さな光線しか集結するようにします。

したがって、サンプルの唯一の可視領域は、適切に解決された画像を提供する、焦点内のポイントです。ただし、解像度が高いほど、このサンプルのごく一部のみが一度にイメージされます。X-Y平面でサンプルを移動することで、そのサーフェスのラスタースキャンを実行できます。スキャンの各ポイントに対して、異なる焦点面にアクセスするように Z 高さを調整することで、フォーカスが最適化されます。これにより、画像サンプルのポイントによって最大解像度が確保されます。

次に、これらの顕微鏡法と画像解像度の原理を用いて、共焦点顕微鏡と光学顕微鏡の両方を用いてマウス脳を画像化してみましょう。

顕微鏡の主な原理を見直し、共焦点顕微鏡を用いて測定を行いましょう。まず、コンピュータワークステーションで顕微鏡をオンにします。次に、サンプルをステージにロードし、レンズの下の中央に配置します。次に、イメージング ソフトウェアを開き、[新しいジョブの作成] を選択します。地形の列に移動し、アシスタントボタンを選択します。この顕微鏡の最も低い倍率は2.5倍である選択してください。次に、3D顕微鏡マニピュレータを使用してサンプルのZ位置を調整し、サンプルに焦点を合わせます。ボタンを押して、エッジの周りに青いライトが表示されるようにします。これはより細かいZの動きおよび焦点を可能にする。次に、概要イメージをキャプチャします。

ゆっくりとレンズの倍率を上げ、光の強度と焦点を調整して、所望の倍率を得ます。X 方向と Y 方向の 3D マニピュレータを使用して、サンプルの対象領域を異なる場所に選択します。低倍率で画像を撮影したら、次を押して基準点を取ります。既定の参照点を使用するか、サンプルの隅に新しい参照点を指定してから、[次へ] を押します。次に、目標をサンプルの目的の解像度に徐々に変更します。このサンプルでは、マウスの脳組織の細胞を可視化するために20倍の目的を使用します。作業距離を短くする余地があることを確認します。

スライスを収集する距離を定義するには、まず測定範囲定義ページに移動し、3D マニピュレータを使用して最終的に Z 方向にサンプルを調整します。サンプルの上部にフォーカスがあるときは最後に設定をクリックし、サンプルの下部にフォーカスがあるときに最初に [設定] をクリックします。計算されたスライスの数が 1,000 を超えていないこと、またはプログラムが失敗することを確認します。光の強度が過飽和であることを示す赤いピクセルがないことを確認します。

最後に、断層撮影画像を撮るために押す。断層撮影ソフトウェアが開いたら、[スタディ]タブを選択してデータを 3D で表示し、2D および 3D 計測を行います。

デジタル光学顕微鏡を使って画像を撮ることができます。まず、顕微鏡の電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。次に、サンプルをステージにロードし、レンズの下の中央に配置します。イメージングソフトウェアが開いている場合は、テンプレートのリストからジョブを選択するか、無料の検査を選択します。次に、ステージ全体を示す概要画像を取得します。コントローラを使用して、フォーカスと画像の位置を変更します。

取得が完了したら、イメージに座標系を配置します。既定の座標系はステージの中央にあります。柔軟性を高めるために、座標を手動で変更できます。

次に、サンプルに名前を付け、カメラ ボタンを選択します。サンプルをナビゲートしながらライブボタンを押し、サンプルが明確にフォーカスされるまでフォーカスを下に移動します。必要に応じて、照明と絞りタブを使用して照明を調整します。次に、サンプルの画像を取得します。

レンズの傾き、サンプルの照明レベル、画像の明るさとコントラストなど、画像最適化パネルの下のツールを使用して、画像を目的の鮮明さに最適化します。次に、鉛筆ツールをタップして測定を実行します。距離ツールと面積ツールを使用して、サンプル上のセルのサイズを測定します。

最後に、[結果ワークフロー] タブに移動し、レポートのレイアウトを構成します。保存ボタンをタップしてジョブを保存し、さらに分析します。

共焦点顕微鏡とデジタル光学顕微鏡で撮影したマウス脳の画像を解析します。50倍の倍率の共焦点画像は高解像度で、さまざまな深さの情報レベルで深い焦点を提供します。

地形図では、このサンプルの高値は1ミクロンから9ミクロンの範囲です。振幅、粗さプロファイル、カーブ パラメータなどの特性をさらに解析できます。しかしながら、切除された脳組織のスライド全体は、デジタル光学顕微鏡を用いて画像化することができる。

セクションを拡大すると、サンプルの詳細が表示されますが、共焦点顕微鏡で得られるよりもはるかに低い解像度で表示されます。この試料は300倍倍の倍率で得た。専用ソフトウェアは、直径などの断面寸法を測定したり、断面の内部面積を計算したりするためのツールを提供しています。

デジタル、光学、共焦点顕微鏡は、様々なバイオメディカルアプリケーションで使用される標準ツールです。走査レーザー眼鏡検査またはSLOは、網膜疾患の発症を診断および監視するために臨床眼科で広く使用されている非侵襲的なイメージング技術である。

SLOはミクログリアを視覚化する高コントラスト立体画像を生成する。網膜の常駐マクロファージは、いくつかの網膜疾患に関与している。共焦点顕微鏡は、顕微鏡的な生物学的細胞機能をリアルタイムで可視化できる生細胞イメージングにも用いられている。

この技術は、細胞の移動と増殖およびタンパク質ダイナミクスを研究するために使用されます。ここで、膜貫通型受容体およびリソソームを蛍光色素で標識し、その共振化をタイムラプスイメージングを用いて分析し、受容体内在化を調べた。

JoVEのデジタル、光学、共焦点顕微鏡の紹介を見たばかりです。顕微鏡法と画像解像度の原理、光学顕微鏡と共焦点顕微鏡の両方を画像化した生体試料の操作方法、生物医学工学分野での使用のいくつかの応用を理解する必要があります。

見てくれてありがとう。

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