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大鼠非侵入性ACL损伤后膝关节退化的可视化
 
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大鼠非侵入性ACL损伤后膝关节退化的可视化

Overview

资料来源:林赛·莱普利1,2, 史蒂文 M. 达维1,蒂莫西 A. 巴特菲尔德3,4和西娜沙赫巴兹莫哈马迪5,

1康涅狄格大学运动学系,斯托尔斯,CT;2康涅狄格大学健康中心骨科外科系,法明顿,CT;3肯塔基大学康复科学系,列克星敦,肯塔基州;4肯塔基大学生理学系肌肉生物学中心,列克星敦,肯塔基州;5康涅狄格大学生物医学工程系,斯托尔斯,CT

膝关节前十字韧带 (ACL) 损伤大大增加了创伤后骨关节炎 (PTOA) 的风险,因为大约三分之一的人将在 ACL 受伤后的第一个十年内展示放射学 PTOA。虽然 ACL 重建 (ACLR) 成功地恢复了膝关节稳定性,但 ACLR 和当前的恢复技术并不妨碍 PTOA 的发病。因此,ACL损伤是研究创伤性关节损伤后PTOA发展的理想模型。

鼠模型被广泛用于研究ACL损伤对PTOA的发病和影响。ACL损伤应用最广泛的模型是ACL分型,这是一种在手术上破坏关节稳定的急性模型。虽然实用,该模型并不忠实地模仿人类ACL伤害,由于侵入性和非生理伤害程序,掩盖了原生生物对伤害的反应。为了改进结果的临床翻译,我们最近开发了一种新的非侵入性ACL损伤模型,其中ACL通过单负荷的tibial压缩破裂。这种损伤与人类相关的损伤情况密切相关,并且具有很高的可重复性。

通过微计算机断层扫描 (μCT) 实现关节退化的可视化,与传统 OA 染色技术相比,提供了几大进步,包括整个关节退化的快速、高分辨率、非破坏性的 3D 成像。本演示的目的是在啮齿动物模型中引入最先进的非侵入性 ACL 损伤,并使用 _CT 量化膝关节退化。

Principles

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ACL 是一种带状的密集结缔组织结构,产生于头骨的前通间空间,并横向和横向延伸到股骨侧侧。在结构上,ACL 既是膝盖的被动稳定器,与其他韧带以及大腿肌肉协同工作,有助于在动态运动期间控制关节。ACL 是前膝位移的主要约束,在保持膝关节稳定性方面起着至关重要的作用。除了结构支持,ACL还充当膝关节和中枢神经系统之间的神经信息途径。ACL 上的最大压力发生在膝盖接近伸展时,而此时 ACL 处于受伤风险最高。

ACL 是运动和工作相关活动中最常见的膝盖韧带受伤。非接触式 ACL 伤害占所有 ACL 伤害的近 70%,当一个人在膝盖上产生足够的力和/或瞬间,导致 ACL 负载过载时,就会发生这种伤害。虽然非接触ACL损伤的机制已经研究使用各种研究模型(前瞻性,回顾性,观察,体内体外),一个直接确定如何伤害发生仍然难以捉摸。ACL 重建通常通过手术将部分个人腿筋或跟腱插入 ACL 区域来执行。手术重建的目的是最大化受伤后失去的膝盖稳定性和功能能力。手术重建有助于安全恢复运动,促进膝关节长期健康。然而,尽管临床医生和研究人员尽了最大努力,近三分之二的重建ACL患者在重建后12个月没有恢复活动,超过50%的ACL重建膝盖在受伤后5-14年有PTOA的放射线征。

动物模型为研究治疗的自然历史和对联合健康的反应提供了一种实用和临床相关的方法。重要的是,大鼠的膝盖在人类中具有相似的解剖结构,其功能与膝盖相似,这使得大鼠膝盖成为ACL损伤后研究PTOA的有用模型。为了改进结果的临床翻译,我们最近开发了一种新的 ACL 损伤非侵入性模型,其中 ACL 通过单次骨质压缩的负载破裂。这种损伤与人类相关的损伤情况密切相关,并且具有很高的可重复性。

负载装置由两个定制的加载平台组成(图1);顶部膝部阶段刚性地安装在线性执行器(直流线性执行器 L16-63-12-P,皮德吉,艾伯塔省,加利福尼亚州),将右后肢定位在 30°1-3的多西柔性和 100°1的膝关节弯曲中,同时提供空间,使 tibia 相对于股体进行前次压;底部级可容纳弯曲的膝盖,并直接安装在称重传感器上方(HDM Inc.、PW6D、南场、MI)。在损伤期间,大鼠被麻醉,然后右后肢以8毫米/s的速度受到单负荷的Tibial压缩。1 ACL伤害通过通过定制程序(LabVIEW,国家仪器,奥斯汀,TX)监测的损伤过程中的压缩力释放来记录。受伤后,ACL破裂由Lachman的试验临床证实,其中股骨被固定,而前力应用于头骨。过多的前叶转换表示 ACL 缺乏。然后,ACL 受伤的后肢可以在自定义的 3D 打印设备中扩展和固定,以可视化膝关节退化。采集图像是为了描述与PTOA开发相关的眼结构变化。4

Figure 1
图1:提比塔尔压缩载荷导致孤立的非侵入性ACL损伤。

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Procedure

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非侵入性 ACL 伤害

  1. 穿戴适当的个人防护设备。您可以使用呼吸面罩,但此协议不是强制性的。
  2. 使用具有 5% 无氧和 1 L/min 氧气的感应室对大鼠进行麻醉。使用鼻锥维持麻醉的流量,鼻锥体为 1 - 3% 的异常胶和 500 mL/min 的氧气。如果未在背拔或下拔表上设置设备,请确保使用桌面系统和木炭过滤器清除废气。
  3. 进行脚趾捏,以确保已经达到足够的麻醉深度。请注意,无需使用眼润滑剂,协议执行迅速(< 3 分钟),角膜干燥的风险最小。
  4. 将右后肢置于30°的多西弯曲和100°的膝关节弯曲处,同时为骨质骨相对于股骨的前次压度提供空间。
  5. 将顶部膝部级牢固地安装到线性执行器上。
  6. 将弯曲的膝盖放在底部,该膝盖直接安装在称重传感器的正上方。
  7. 以 8 mm/s 的速度使用单负载的 tibial 压缩来诱导 ACL 损伤。
  8. ACL 损伤通过释放压缩力来表示。这通过自定义程序进行监视。
  9. 受伤后,当动物仍在麻醉平面下时,执行拉赫曼的测试,以临床上确认ACL破裂已经发生。Lachman 的测试是一种临床测试,用于通过评估下垂计划稳定性来评估 ACL 的完整性。稳定股骨时,向前拉股骨(在前部方向)以评估运动量。完整的ACL将产生一个"牢固的最终感觉",研究人员将无法向前翻译tibia。受伤的 ACL 会产生"软或模糊末端感觉",指示 ACL 撕裂。
  10. 拍打股骨和头骨,以检测任何严重的骨损伤。如果没有发现禁忌症,将动物转移到笼子里,让它恢复。在此期间,监测动物,以确保它不显示任何疼痛的迹象,如不愿移动,发声,或异常姿态。

关节退化的CT成像

二维图像是使用70kV的扫描仪设置,电流85.5μA(图2B)获得的。每 0.6° 旋转步骤以 11.5 μm 的分辨率通过完整的 180° 收集数据。横截面图像使用平滑的反向投影算法和重建图像堆栈(图2C)进行重建。然后在软件中通过分割分析镜面结构,其中 1.53 mm 球体位于中侧表层和侧叶和股骨的表层中,以确定镜面厚度 (μm)、眼膜分离 (μm) 和镜面数 (1/mm)。56

  1. 在ACL受伤后4周,在诱导室中长时间接触CO2对大鼠实施安乐死。
  2. 在自定义 3D 打印设备中扩展和保护 ACL 受伤的后肢 (图 2A)。
  3. 使用 _CT 获取图像。
  4. 获取正面平面放射成像仪以确定关节空间。缩小(在股骨结节和骨质高原之间[以毫米测量])相比,非受伤的肢体。
  5. 使用以下扫描仪设置获取二维图像:70 kV 和电流 85.5 μA。
  6. 以 11.5 μm 的像素大小每 0.6° 旋转步骤收集数据,通过完整的 180°。
  7. 使用平滑的背投影算法在重建图像堆栈上重建横截面图像。
  8. 为确保测量一致的兴趣区域,在中叶和侧叶高原和股骨的表层板中放置一个1.53 mm球体,以确定眼皮厚度(μm)、眼膜分离(μm)和眼数(1/mm)。

Figure 2
图 2:A) 定制打印设备,用于在 +CT、B) 二维图像和 C) 三维 _CT 期间保存后肢。

最常见的膝关节损伤之一是前十字韧带(也称为 ACL)的断裂或撕裂,近三分之一的 ACL 损伤在十年内导致创伤后骨关节炎(PTOA)。

由于大鼠膝关节是人体膝关节的接近模型,因此大鼠模型已被广泛用于研究ACL损伤对PTOA的影响。ACL 损伤最广泛使用的模型是 ACL 分型,其中关节在手术中不稳定。但是,此模型不能准确地复制人类 ACL 损伤条件。

在本视频中,我们将讨论一种新颖的、非侵入性的大鼠ACL损伤模型,演示损伤损伤和损伤关节成像,最后回顾生物医学工程领域对韧带修复的研究。

膝盖由三块骨头组成,即股骨、骨骼和头骨。前十字韧带,或ACL,是一个带状结构的密集结缔组织,从前侧关节空间上升,并显着和横向延伸到股骨的侧侧。

膝关节的其他韧带包括后十字韧带、侧侧附属韧带和内侧附属韧带。在结构上,所有的韧带,特别是ACL,作为膝盖的被动稳定剂和大腿肌肉,以帮助控制关节在动态运动。

ACL 上的最大压力发生在膝盖接近伸展时,而此时 ACL 处于受伤风险最高。动物模型为研究关节损伤和治疗提供了实用和临床相关的方法。大鼠膝关节模型尤其被广泛用于研究膝关节损伤,因为大鼠膝盖与人膝非常相似。为了模拟人类临床相关的ACL损伤,应用单负荷的tibial压缩。如果正确操作,则会导致 ACL 完全破裂。

ACL 受伤的后肢随后可以使用微计算机断层扫描(Micro CT)成像,以可视化关节损伤和退化。微CT是一种成像技术,它使用X射线创建物体的图像,如关节。这些横截面在对象上进行测量,并组合以创建三维重建。有关微型 CT 的更多信息,请观看此集合中的视频。

现在,我们已经讨论了新颖的、非侵入性大鼠 ACL 损伤模型,让我们来看看损伤是如何发生的,然后是关节的微 CT 可视化。

ACL 损伤将使用自定义设备进行,这将在麻醉大鼠的 tibia 上引起单个负载的压缩。首先,将一只老鼠放入感应室,其中5%为无氧,每分钟有1升氧气。麻醉后,使用鼻锥将大鼠移到设备中,以保持1%至3%的异常气流。将右后肢置于 30 度的屈肌和 100 度的膝盖弯曲处。

以每秒一毫米的速度移动安装在线性执行器上的顶部膝部级。相对于股骨,请确保为头骨的前次豪华提供空间。然后,将弯曲的膝盖放在底部阶段,该膝盖安装在称重传感器上方。正确定位大鼠后,打开自定义设备,打开实验室视图,并输入每秒 8 毫米的压缩速度。然后,运行测试,以诱导ACL破裂使用一个单一的负载的tibial压缩。运行测试时,监视该过程。ACL 伤害通过释放压缩力来表示。

受伤后,将大鼠从设备中取出,并将其放在平坦的表面上。然后执行拉赫曼测试以评估 ACL 的完整性。稳定股骨的同时,向前拉骨。完整的 ACL 会产生稳固的端点,而受伤的 ACL 会产生柔软的端点感觉。一旦Lachman的测试已经执行,返回其外壳,让它从麻醉中醒来。

现在,让我们对损坏的关节进行图像成像。为了准备微CT成像,根据AVMA指南,以人道的方式对大鼠实施安乐死。然后,使用几个塑料拉链延长并固定 ACL 受伤的后肢,并小心地将它们操纵到自定义设备中。后肢应在锥形管内完全伸展。

将大鼠身体的其余部分固定在与微型 CT 级兼容的适当容器中。然后将固定接头置于微型CT仪器中,使用70千伏的扫描仪设置,在电流为85.5微电位,分辨率为11.5微米180度时,获取关节骨骼的二维图像。在 0.6 度旋转时使用 5 秒的曝光时间。收集二维图像,在整个 180 度中每 0.6 度旋转一次。然后使用算法重建图像,以创建关节的三维图像。要确定骨骼特征,请先使用软件插件来获取关节的体积渲染。

然后查看正交投影并穿过切片,以选择中叶和侧骨质高原的表皮板与股骨的中侧和侧节之间的所需位置。接下来,将膝盖裁剪到所需位置,用 1.53 毫米的球体遮盖膝盖。使用交互式阈值标记骨骼并对图像进行双元化。现在,计算骨骼厚度,这是骨关节炎的发病的测量。

对不同位置重复上述步骤,并量化其他骨骼特征。成像后,您可能需要通过目视检查和打开膝盖来确认 ACL 破裂。为此,首先去除皮肤。您应该看到血型,这意味着胶囊中有血液,是 ACL 损伤的特征。

现在,继续打开关节,以暴露前远股骨、骨质和 ACL。执行 Lochman 测试以进一步打开接头,并观察 ACL 的关节和孤立的近端撕裂中的血迹。

现在,让我们比较一下大鼠膝关节退化和骨骼结构与急性ACL损伤和大鼠膝盖在ACL受伤后四周。在这里,我们看到重建的三维图像的老鼠膝盖与急性ACL损伤,并在ACL受伤后四个星期。在表层中心四个不同位置计算并比较骨骼厚度、数量和间距。

与患有急性 ACL 损伤的大鼠膝盖相比,非侵入性 ACL 撕裂后四周,骨眼数较小、眼角厚度减少、间隔更大。所有这些都是创伤后骨关节炎发病的特征。

各种动物模型不仅对ACL损伤的研究很重要,而且对评估新的治疗方法也很重要。目前治疗ACL损伤的一种治疗方法是使用组织移植进行韧带重建。在这项研究中,研究人员使用聚碳酸酯创建了纤维组织移植物。然后,将细胞移植物植入大鼠体内,取代自然韧带。

移植物通过在股骨和头骨高原上钻孔,然后通过孔的移植物,用缝合线固定到膝关节上。16周后,组织学分析表明,脚手架基质被成纤维细胞渗透,聚合物基本上被重新吸附,几乎没有剩余的证据。工程韧带也可以在体外研究。

在这项研究中,人类细胞从ACL残留物中分离出来,并在培养中扩大。然后,这些细胞被培养在涂有锚的涂层板上,形成工程韧带结构。在加入纤维蛋白原以鼓励纤维蛋白形成后,在培养箱中培养板。

28天后,纤维蛋白在两个锚之间形成线性组织。这种类型的研究使研究人员能够了解不同类型的生长因子和激素的作用,合成ACL替代组织,并确定在体内鼓励ACL修复的方法。

您刚刚观看了 Jove 关于使用大鼠模型来诱导和可视化 ACL 损伤的介绍。现在,您应该了解大鼠模型是如何用于研究和图像韧带损伤以及该领域的几个应用。

感谢您的收看!

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Results

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较小的眼膜数量、减少的眼角厚度和更大的眼间距,PTOA 发病的所有特征在非侵入性 ACL 撕裂后 4 周明显(表 1图 3)。图5显示了健康肢体与急性受伤肢体的解剖ACL的图像。ACL 损伤的新型非侵入性模型,其中 ACL 通过单次重点压缩破裂,能够产生 ACL 的孤立近端撕裂。

Figure 4
图3:大鼠急性ACL损伤(左)和ACL损伤后4周的3-D重建ΜCT图像(右)。

1:PTOA发病的特征测量。

动物 Tb.N
(1/毫米)
Tb.Th
(μm)
TB.Sp
(μm)
急性 ACL 受伤 3.11 168.5 217
ACL 后 4 wks 伤害 2.63 166.7 213

Figure 5
图4:急性损伤ACL-limb的图像(左)和完整、健康的ACL的图像(右)。

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Applications and Summary

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本视频演示如何使用线性执行器在大鼠中产生孤立的非侵入性 ACL 破裂。这种损伤与人类相关的损伤情况密切相关,并且具有很高的可重复性。为了克服传统OA染色技术的几个主要局限性,该方法使用_CT来量化整个关节退化和眼膜结构。

以证据为基础的干预措施,以改善肌肉骨骼康复结果,是一个非常重要的领域,在过去二十年中变化不大,尽管基础生物学的重大进展表明,对康复的改变协议早就应该了。问题是,典型的康复专家已经使用传闻报告来塑造临床实践,而不是基础科学,提供知情的假设,在翻译到诊所之前在模型生物体中进行测试。此处描述的程序为科学家提供了一种密切复制与人类相关的创伤性关节损伤的方法,并使用 _CT 跟踪关节健康的进展。

材料列表:

设备 公司 目录号 评论
线性执行器 皮德起 L16-63-12-P
称重传感器 HDM公司 PW6D
·Ct 蔡司 XRM Xradia 520

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References

  1. Maerz T, Kurdziel MD, Davidson AA, Baker KC, Anderson K, Matthew HW. Biomechanical Characterization of a Model of Noninvasive, Traumatic Anterior Cruciate Ligament Injury in the Rat. Ann Biomed Eng. 2015;43(10):2467-2476.
  2. Christiansen BA, Anderson MJ, Lee CA, Williams JC, Yik JH, Haudenschild DR. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(7):773-782.
  3. Lockwood KA, Chu BT, Anderson MJ, Haudenschild DR, Christiansen BA. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. J Orthop Res. 2014;32(1):79-88.
  4. Blair-Levy JM, Watts CE, Fiorentino NM, Dimitriadis EK, Marini JC, Lipsky PE. A type I collagen defect leads to rapidly progressive osteoarthritis in a mouse model. Arthritis Rheum. 2008;58(4):1096-1106.
  5. Mohan G, Perilli E, Kuliwaba JS, Humphries JM, Parkinson IH, Fazzalari NL. Application of in vivo micro-computed tomography in the temporal characterisation of subchondral bone architecture in a rat model of low-dose monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2011;13(6):R210.
  6. Jones MD, Tran CW, Li G, Maksymowych WP, Zernicke RF, Doschak MR. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2726-2735.

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