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フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞選別(FACS)
 

フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞選別(FACS):脾臓Bリンパ球の単離

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免疫系は、白血球とも呼ばれる白血球を生成することにより、病原体の侵入から体を保護します。病原体が正常に生物に感染すると、多種多様な白血病が活性化され、この協調反応は免疫応答と呼ばれる。

多くの場合、研究者は病原体に応答して活性化された免疫細胞の特定の種類と数を識別することができることが有用である。フローサイトメトリーは、研究者が表面に発現する特定のエピトープに基づいて細胞を分離することを可能にする技術です。これは、既知の免疫細胞特異的エピトープに結合するフルオロクロムタグ付きモノクローナル抗体を使用して達成され、励起時に、これらの結合フルオロクロムは、フローサイトメーターによって検出され、得点することができる光の波長を放出します。

フローサイトメーターは、3つのシステムで構成されています。流体系は、レーザーの前を1つずつ通過できるように、流れの中で細胞を輸送します。光学系は、蛍光色素の有無を認識するレーザーと検出器で構成されています。最後に、電子システムは、収集した光学データを分析用の電子ファイルに変換します。

フローサイトメトリーの拡張は、蛍光活性化細胞選別器(FACS)であり、特定の細胞集団を濃縮し、独立して研究することができます。細胞の選別は、マイクロ液滴を形成する流体流中の振動ノズルを使用して行われ、それぞれが単一の細胞を含む。次に、検出器は、各液滴から蛍光灯が放出されているかどうかを判断し、その情報に基づいて、電磁石は各細胞に負または正の電荷を与えます。次に、強い電界は、異なる帯電液滴を別々の容器にソートします。最終的に、容器の1つは、特定の細胞表面分子の発現に基づいて細胞の均質な集団を含む。

このビデオでは、フローサイトメトリーを使用してマウス脾臓組織とFACSから白血病を単離し、Bリンパ球を選択する方法を学びます。

まず、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。次に、解剖はさみと鉗子を洗剤で洗い、次に70%のエタノールで洗い、次にきれいなペーパータオルで乾かします。

次に、ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を50ミリリットルのチューブに49ミリリットルを追加します。胎児ふくらはぎ血清(FCS)の1ミリリットルを追加し、HBSS 2%FCS溶液を作成し、約10回上下にゆっくりとパイプで混合します。

次に、解剖プレート上のスプーリン位置に安楽死マウスを置きます。はさみと鉗子で、腹腔にアクセスするために縦腹腔切り目を行う。鉗子を使用して腹部の右側の腸を片側に移動させ、胃と脾臓を露出させる。脾臓は胃に付着している。次に、ピペットを使って、HBSS 2%FCSの5ミリリットルをペトリ皿に入れます。鉗子を使用して、慎重に胃から脾臓を取り外し、ペトリ皿に脾臓を置きます。

免疫細胞を単離するには、まず脾臓を40ミクロンの細胞ストレーナーにペトリ皿に置きます。脾臓をプランジャーでつぶし、皿に切り離します。次に、ペトリ皿から解離した脾臓と流体を15ミリリットルの遠心管にピペットする。10°Cで7分間370回gでチューブを遠心分離し、ペレットを邪魔しないように慎重にチューブを取り出します。

次に、上清を取り出し、ペレットを避け、適切な廃棄物容器に液体を捨てます。次に、遠心管にACKライシングバッファーの2ミリリットルを追加し、赤血球を再中断し、lyseseします。2 分間待ってから、HBSS 2% FCS を追加して、合計体積が 15 ミリリットルになります。遠心分離を繰り返します。慎重にチューブを取得し、上清を廃棄します。HBSS 2% FCSの5ミリリットルで再びペレットを再中断します。

再懸濁した細胞を数えるために、トリパンブルーの5マイクロリットルで細胞懸濁液の5マイクロリットルを希釈する。次に、カバーガラスとマラセススライドの間にこの希釈された細胞懸濁液の5マイクロリットル滴を静かに堆積させます。さて、40倍の倍率で顕微鏡下で、存在する細胞の数を数える。次いで、HBSS 2%FCSの適切な体積を加えて1ミリリットル当たり7番目の細胞に細胞濃度を10に調整する。

免疫細胞を染色するには、まず6本のFACSチューブを1本から6本のラベルを貼ります。次に、200マイクロリットルの細胞溶液を6本のチューブのそれぞれに移す。これらのチューブを摂氏10度で7分間370回gで遠心し、上清を取り除きます。

次に、6 つの新しい FACS チューブを 1 ~ 6 個、ピペット 200 マイクロリットルの HBSS 2% FCS にそれぞれラベルを付けます。表1に従って各チューブに適切な量の抗体を添加して6種類の新規抗体混合を調出す。混合1は、抗体を添加しない無染色細胞用である。2~5個を混合し、それぞれ補償設定用に異なる単一抗体を含む。混合6は、ソートに使用される多染色細胞のための4つの抗体をすべて含む。

次に、これらの抗体混合物を対応する番号付きFACSチューブに移す。これらの溶液を摂氏4度または暗闇の氷の上で20分間インキュベートします。次に、各チューブにHBSS 2%FCSの1ミリリットルを追加し、再び遠心分離機を追加します。上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。最後に、再懸濁ペレットを新しいラベル付きFACSチューブに移します。

FACS を実行するには、まずソーターをオンにします。次に、サイトメーターメニューを選択し、流体起動をクリックします。画面の指示に従います。

[ストリーム] タブで赤い十字をクリックしてストリームをオンにし、ストリームが安定するまで 15 分間待ちます。ストリーム タブに明確なデタッチされたドロップが表示されるまで、ストリームの振幅を調整します。次に、甘いスポットをクリックして振幅調整を完了します。レーザーの前に中性密度(ND)フィルタ1.0を挿入します。

画面上部のサイトメーターメニューを開き、サイトメーターの設定とトラッキングを表すCSTを選択します。毎日の品質管理を行うには、まず製造元の指示に従ってFACSチューブにFACS媒体を使用してCSTビーズを希釈します。次に、チューブをマシンにロードし、[CST] タブで [実行] をクリックして CST コントロールを実行します。

CST コントロールが完了したら、ND 1.0 フィルタをサイトメーターの ND 2.0 フィルターに置き換えます。次に、製造元の指示に従ってFACS媒体で落下遅延ビーズを希釈し、チューブをFACSにロードします。適切な並べ替えを行うには、まず電圧をクリックしてから光学フィルタをクリックしてドロップ遅延を実行します。光学フィルタの右象限は100%に等しく、ドロップの100%がマシンによって登録されていることを示します。必要に応じて、サイトメーターの左右の赤いレーザーネジを調整して、右象限で100%を得る。ストリームが収集チューブに入るようにすることが重要です。これを行うには、廃棄物の引き出しをクリックしてテストソートを実行し、並べ替えをテストします。サイドストリームが収集チューブに入っていることを確認します。そうでない場合は、並べ替えタブの下の電圧を調整します。

ブラウザタブを選択し、共有ビューをクリックして、実験用テンプレートに移動します。次に、Accudrop_DROP DELAY 実験を開き、並べ替えレイアウト ボタンをクリックします。次に、1 秒あたり 3,000 イベントに達するまで流量レートを操作して、取得ダッシュボードのしきい値レートを変更します。電圧をクリックし、光学フィルタをクリックします。左側の象限は 0 に、右の象限は 100 に等しい必要があります。

最後に、並べ替えレイアウト ウィンドウで、[並べ替え] をクリックし、[キャンセル] をクリックします。左側の象限は 100 に、右の象限は 0 に等しくする必要があります。左側の象限が 95 未満の場合は、[自動遅延] をクリックして、ソフトウェアに電圧を自動的に増加し、左側の象限のドロップの 100% を取得するように指示します。

フローサイトメトリーを開始するには、まず、無染色細胞を使用して、細胞形態とフルオロクロムの負のピークを定義します。これを行うには、マシン内の未染色セルを含むチューブ1を配置し、取得ダッシュボードタブの下に負荷をクリックします。[サイトメーター] タブで、セルの人口が画面上のドットの密度が高いように表示されるまで、前方と側面の散乱電圧を調整します。リンパ球は小さな細胞なので、前方散乱が低く、側の散乱が少ない。

次に、細胞メータータブのフルオロクロムの電圧を調整して、負のレベルの細胞集団がグローバルワークシートタブの最初の10年になるまで、背景蛍光を除去します。サイトメーターメニューで、ビュー構成をクリックし、すべてのフルオロクロムが存在することを確認します。次に、チューブ2をサイトメーターに入れ、負荷をクリックします。[サイトメーター] タブのスペクトルの重なりを調整し、負の母集団中央値と正の母集団中央値がグローバル ワークシート タブに揃えるまで調整します。[取得] タブで、イベントを [10,000 に記録する] パラメーターに設定し、レコードをクリックします。チューブ 3、4、および 5 でこれらの手順を繰り返します。

次に、多染色細胞を含むチューブ6をロードする。Bリンパ球を単離するには、まず、その形態に基づいて細胞をソートするパラメータを設定します。最初のウィンドウでは、Y 軸に FSC-A 前方散布領域をプロットし、X 軸上に SSC-A 側散布領域をプロットします。散布図では、各ドットはセルを表します。グローバル ワークシート上のポリゴン ゲートをクリックし、前方散布が低く、中間側散布を持つ母集団を選択します。新しいドット プロット ウィンドウで、ウィンドウを右クリックし、メニューから人口を表示し、[P1] をクリックします。

次に、新しいウィンドウで、X 軸上の Y 軸と CD45 の生存率をプロットして、生存可能な CD45 正のセルをゲートします。ポリゴン ゲートを使用して、生存率が低く CD45 信号の高いセルを円で囲み、P2 を選択して選択したセルを新しいウィンドウに表示します。次のウィンドウでは、CD45陽性白血病のゲートは、Tリンパ球を除く。X 軸に CD45 を、Y 軸に CD3 を使用して、高い CD45 信号と低い負の CD3 信号で母集団を丸め、P3 を選択します。最後に、Bリンパ球を同定するCD19陽性細胞のゲート。Y 軸に CD19 を、X 軸に CD3 を使用して、高い CD19 信号と低い負の CD3 信号で母集団を丸め、P4 を選択します。

すべての並べ替えパラメータが設定されました。次に、並べ替えレイアウト ウィンドウで、ゲートされた 4 番目の母集団である関心のある P4 の細胞母集団を選択し、B リンパ球のみをソートするようにマシンに指示します。ターゲット イベントを 10,000 セルに設定し、精度を純度に設定します。私たちは1つの人口だけを並べ替えています。ただし、最大 4 つの異なる母集団を同時に並べ替えることができます。準備ができたら、[並べ替え] と [OK] をクリックします。次に、セルの並べ替えを待ちます。

細胞の選別が完了したら、HBSS 2%FCSの90マイクロリットルの新しいFACSチューブに選別された細胞の10マイクロリットルをピペッティングすることにより、純度制御を実行します。チューブをサイトメーターに入れ、負荷をクリックしてからレコードをクリックしてセルの表現型を分析し、ゲーティング戦略が意図したとおりに機能したことを確認します。

次に、選別された細胞を分析し、マウス脾臓から単離した白血病の中のBリンパ球の割合を決定する。開始するには、FlowJo アイコンをダブルクリックし、各チューブのファイルをすべてのサンプル ウィンドウにドラッグします。

ポリゴンをクリックし、前のセクションで使用したゲーティング戦略を再作成します。次に、レイアウトエディタをクリックし、チューブ6から関心のあるBリンパ球母集団をドラッグし、純度コントロールをレイアウトエディタタブにドラッグします。この例では、右上のプロットは全脾細胞懸濁液からソートされたBリンパ球を表し、右下のプロットは純度コントロールです。細胞は、純度コントロールに関心のある集団にのみ現れるべきです。

ソートされた細胞内のBリンパ球の純度を確認するには、テーブルエディタをクリックします。Bリンパ球母集団をチューブ6からドラッグし、テーブル内の純度コントロールを行います。統計メニューで、この細胞集団の純度をテストするためにCD45陽性細胞の頻度を選択します。次に、[テーブルの作成] をクリックします。パラメータ値は新しいテーブルに表示されます。純度制御ウィンドウで、CD45陽性細胞内のBリンパ球の頻度を確認し、98%より高くする必要があります。

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