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Citometria de Fluxo e Fluorescência-Triagem celular Ativada (FACS)
 
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Citometria de Fluxo e Fluorescência-Triagem celular Ativada (FACS): Isolamento de Linfócitos B esplênicos

Overview

Fonte: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unidade de Linfopose, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
2 INSERM U1223, Paris, França
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França

A função geral do sistema imunológico é defender o corpo contra organismos infecciosos e outros invasores. Os glóbulos brancos, ou leucócitos, são os principais atores do sistema imunológico. Após a infecção, eles são ativados e iniciam uma resposta imune. Leucócitos podem ser divididos em várias submíopes (por exemplo, células mielóides, linfócitos, células dendríticas) com base em diferentes parâmetros que podem ser biológicos, físicos e/ou funcionais (por exemplo, tamanho, granularidade e secreção). Uma maneira de caracterizar leucócitos é através de suas proteínas superficiais, que são principalmente receptores. Cada população de leucócitos expressa uma combinação específica de receptores (por exemplo, citotóxicos, ativadores, receptores migratórios) que podem definir subconjuntos entre populações. Como o sistema imunológico abrange uma ampla gama de populações celulares, é essencial caracterizá-las para decifrar sua participação na resposta imune.

A citometria de fluxo (FC ou FCM) é um método amplamente utilizado para analisar a expressão da superfície celular e moléculas intracelulares, caracterizando e definindo diferentes tipos de células em uma mistura celular heterogrógena. Os citómetros de fluxo são compostos por três subsetores principais: fluidos, ópticos e eletrônicos. O sistema fluido transporta as células em um córrego de tal forma que elas passam na frente de um laser um por um. O sistema óptico consiste em fontes de luz (lasers) para iluminar as partículas, filtros ópticos para direcionar a luz resultante e sinais fluorescentes para detectores apropriados. Finalmente, o sistema eletrônico converte os sinais de luz detectados em sinais eletrônicos que podem ser processados pelo computador. À medida que uma célula individual passa na frente do raio laser, ela espalha luz. Um detector na frente do feixe mede a dispersão dianteira (FS) e vários detectores para a dispersão lateral da medida lateral (SC). O FS se correlaciona com o tamanho da célula e a SC é proporcional à granularidade das células. Dessa forma, as populações celulares podem muitas vezes ser distinguidas com base em diferenças em seu tamanho e granularidade apenas.

Além de analisar o tamanho, a forma e a complexidade de uma célula, a citometria de fluxo é amplamente utilizada para detectar a expressão dos receptores de superfície celular (1). Isso é feito usando anticorpos monoclonais com rótulo fluorocromático que se ligam a receptores específicos de células conhecidos. Após a excitação, esses fluorochromes ligados emitem uma luz de comprimento de onda específico, chamada comprimento de onda de emissão, que pode ser detectado e pontuado. As medidas de fluorescência fornecem dados quantitativos e qualitativos sobre receptores de superfície celular fluorocromático. Os hematologistas foram os primeiros a utilizar FC para o acompanhamento terapêutico das populações de células imunes (2). Agora, é usado para uma ampla gama de aplicações como imunofenofoteping, viabilidade celular, expressão genética, contagem de células e análise de GFP.

FACS (Fluorescente Activated Cell Sorter) é um tipo especializado de citometria de fluxo, que classifica uma população de células em subpopulação usando rotulagem fluorescente. Assim como a citometria de fluxo convencional, os primeiros dados FS, SC e fluorescentes são coletados. Em seguida, a máquina aplica uma carga (negativa ou positiva) e um sistema de deflexão eletrostática (eletroímãs) facilita a coleta de gotículas carregadas contendo células em tubos apropriados.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática de FACS. A amostra (1) é aspirada no FACS (2) e passada na frente do laser (3). A fluorescência celular é sentida por detectores de fluorescência (4). Finalmente, as células são incorporadas em gotículas e as células de interesse são desviadas por placas de deflexão (5) e coletadas em um tubo de coleta (6). As demais células vão para o lixo (7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O aspecto de classificação do FACS apresenta muitas vantagens. Muitos testes podem ajudar a entender o papel de células específicas no sistema imunológico, como análises da expressão genética como RT-qPCR, ciclo celular ou secreção de citocinas. No entanto, as células devem ser purificadas rio acima para obter resultados claros e específicos. Aqui, o FACS vem em útil e as células desejadas podem ser classificadas com grande pureza, produzindo resultados altamente confiáveis e reprodutíveis. Facs também pode ser usado para classificar células com base em colorações nucleares ou outras manchas intracelulares e de acordo com a presença, ausência e densidade de receptores superficiais. FACS é agora uma técnica padrão para a purificação de subpopulações de células e tem a capacidade de classificar até quatro populações simultaneamente.

Este exercício de laboratório demonstra como isolar leucócitos esplênicos e, em seguida, como classificar especificamente células linfoides B da mistura de células leucócitos esplênicas usando FACS.

Procedure

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1. Preparação

  1. Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
  2. Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque bem.
  3. Prepare 50mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

  1. Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
  2. Usando fórceps, mova os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
  3. Usando fórceps, retire cuidadosamente o baço do estômago e coloque-o na placa de Petri contendo 5mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

  1. Coloque o baço em um coador de células de 40μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo no mesmo prato.
  2. Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15mL.
  3. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante, evitando a pelota.
  4. Resuspenque a pelota em 2mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e, em seguida, compor o volume até 15mL usando HBSS 2% FCS.
  5. Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5mL de HBSS 2% FCS.
  6. Conte as células usando um ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração final da célula para 107 células/mL usando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Coloração celular

  1. Transfira 200μL da suspensão celular para seis tubos FACS, rotulados de 1 a 6.
  2. Centrifugar os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
  3. Em seguida, prepare seis novas misturas de anticorpos adicionando quantidade apropriada de anticorpo ao HBSS 2% FCS de acordo com a Tabela 1.
  4. Em seguida, transfira essas misturas de anticorpos para os tubos FACS numerados correspondentes.
  5. Incubar as suspensões celulares misturadas com os anticorpos por 20 minutos no gelo no escuro.
  6. Adicione 1mL de HBSS 2% FCS a cada tubo e, em seguida, centrífugue novamente a 370 x g por 3 min a 10°C.
  7. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 200μL de HBSS 2% FCS.
  8. Transfira as pelotas resuspendadas para novos tubos FACS.

Table 1
Tabela 1: Mistura de anticorpos. Seis misturas de 200μL de HBSS + anticorpos foram preparadas para o experimento. Mix 1 é para configuração PMT, mistura 2 a 5 são para configurações de compensação, e mix 6 é para classificação celular.

5. Calibração FACS

  1. Primeiro, ligue o classificador e execute "Fluidics Startup".
  2. Ligue o fluxo e espere 15 minutos para que o córrego se estabilize.
  3. Ajuste a amplitude do fluxo para obter a formação de gotas isoladas. Em seguida, clique no "Ponto Doce" para completar o ajuste de amplitude.
  4. Coloque o filtro de densidade neutra (N.D.) - 1.0 e abra a interface "CST" que significa configuração e rastreamento de citógrafos.
  5. Para realizar o controle diário de qualidade, primeiro dilua as contas CST com meio FACS seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, execute o controle CST.
  6. Uma vez que o controle CST esteja concluído, substitua o filtro N.D. 1.0 pelo filtro N.D. 2.0 no cítmetro.
  7. Em seguida, diluir as contas de atraso de queda no meio FACS seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, carregar no FACS.
  8. Para garantir a classificação adequada executar Drop Delay-
    1. Primeiro clique em "Tensão" e depois "Filtro Óptico". O quadrante direito deve ser igual a 100%. Se necessário, ajuste o parafuso laser vermelho no cítmetro esquerdo ou direito para obter 100% no quadrante direito.
    2. Em seguida, realize uma espécie de teste para garantir que o fluxo caia no tubo de coleta. Para isso, clique em "Gaveta de Resíduos" e inicie "Test Sort". Verifique se os fluxos laterais caem em tubos de coleta. Se não o fizerem, ajuste a tensão até que o façam.
    3. Navegue até o modelo experimental. Em seguida, abra o experimento "Accudrop Drop Delay" e clique no "Layout de classificação".
    4. Alterar a taxa de fluxo para obter 1000 a 3000 eventos por segundo.
    5. Clique em "Voltagem" e depois "Filtro Óptico". O quadrante esquerdo deve ser igual a 0 e quadrante direito a 100.
    6. No "Sort Layout" clique em "Sort" e clique em "Cancelar". O quadrante esquerdo deve ser igual a 100 e quadrante direito a 0. Se o quadrante esquerdo estiver a menos de 95 clique em "Atraso Automático" para ajustá-lo automaticamente.

6. Controle de Citometria de Fluxo e Pureza

  1. Comece a citometria de fluxo começando com o tubo 1 (células não manchadas) para definir a morfologia celular e os picos negativos dos fluorochromes. Configure a dispersão para frente e lateral e defina as tensões de cada parâmetro fluorescente. Coloque a população negativa na primeira década usando as grades em cada parcela de ponto.
  2. Em seguida, tubo de carga 2 (controle de cor única) no cítmetro. Ajuste a sobreposição espectral até que as medianas negativas e positivas da população estejam alinhadas ou use o software de cálculo automático. É importante manter o sinal em escala. Os controles de compensação devem coincidir com as configurações experimentais de fluorochromes e detectores. Recorde de 10.000 eventos.
  3. Repita estas etapas com tubo 3, 4 e 5 (outros controles de cor única).
  4. Em seguida, o tubo de carga 6 (células multi-manchadas) e definir populações celulares de interesse usando uma estratégia específica de gating.
  5. Na janela Classificação layout, selecione a população celular de interesse. Selecione o limiar de célula no "Eventos de Destino" e o nível de precisão na "Precisão". Aqui, apenas uma população está sendo classificada, no entanto, quatro populações diferentes podem ser classificadas ao mesmo tempo.
  6. Uma vez pronto clique em "Sort" e "OK", então espere pela classificação celular.
  7. Uma vez que a classificação celular esteja completa, execute um controle de pureza pela primeira tubulação de 10μL de células classificadas em um novo tubo FACS com 90 microliters de HBSS 2% FCS.
  8. Em seguida, carregue o tubo do cítmetro. Registo e analise os fenótipos das células para verificar se a estratégia de gating funcionou como pretendido.

7. Análise de dados

  1. Abra o software 'FlowJo' e arraste os arquivos para cada tubo na janela "All sample".
  2. Clique duas vezes em um arquivo para abri-lo em uma nova janela.
  3. Clique na estratégia "Polígono" e recrie a estratégia de gating usada anteriormente.
  4. Repita os passos com todos os outros arquivos.
  5. Para visualizar os gráficos de pontos, clique em "Editor de layout" e arraste as populações de interesse do tubo 6 e controle de pureza na guia do editor de layout. As células só devem aparecer na população de interesse no controle da pureza (ver Figura 2).
  6. Para verificar a pureza dos linfócitos B nas células classificadas, clique em "Editor de tabela". Arraste a população de linfócitos B do tubo 6 e controle de pureza na tabela.
  7. No menu "Estatística" selecione a frequência de células CD45+ para testar a pureza desta população celular e clique em "Criar tabela".
  8. Os valores dos parâmetros aparecem em uma nova tabela. Na janela de controle da pureza, verifique a frequência de linfócitos B dentro das células CD45+, que devem ser superiores a 98% (ver figura 2, painel inferior).

O sistema imunológico protege o corpo de entrar em patógenos invadindo a geração de leucócitos, também chamados de glóbulos brancos. Quando um patógeno infecta com sucesso um organismo, uma grande variedade de leucócitos são ativados e esta reação coordenada é chamada de resposta imune.

Frequentemente, é útil para os pesquisadores serem capazes de identificar o tipo específico e o número de células imunes que foram ativadas em resposta a um patógeno. A citometria de fluxo é uma técnica que permite aos pesquisadores separar células baseadas em epítopos específicos expressos em suas superfícies. Isso é realizado usando anticorpos monoclonais marcados por fluorocromo que se ligam a epítopos específicos de células imunes conhecidas, e após a excitação, esses fluorocromos ligados emitem um comprimento de onda de luz que pode ser detectado e pontuado por um citómetro de fluxo.

Os citómetros de fluxo são compostos por três sistemas. O sistema fluido transporta células em um córrego de tal forma que passam na frente de um laser um por um. O sistema óptico é composto por lasers e detectores que reconhecem a presença ou ausência dos fluoroforos. Finalmente, o sistema eletrônico converte os dados ópticos coletados em arquivos eletrônicos para análise.

Uma extensão da citometria de fluxo é o Fluorescence-Activated Cell Sorter, ou FACS, que permite o enriquecimento de populações celulares específicas para que possam ser estudadas de forma independente. A classificação celular é realizada usando um bocal vibratório dentro do fluxo fluido que forma micro gotículas, cada uma contendo uma única célula. Em seguida, um detector determina se a luz fluorescente está ou não sendo emitida a partir de cada gotícula, e com base nessas informações, um eletroímã dá a cada célula uma carga negativa ou positiva. Em seguida, um campo elétrico forte classifica as gotículas carregadas de forma diferente em recipientes separados. Em última análise, um dos recipientes conterá uma população homogênea de células com base na expressão de uma molécula de superfície celular específica.

Neste vídeo, você aprenderá como usar a citometria de fluxo para isolar leucócitos do tecido do baço do rato e FACS para selecionar para linfócitos B.

Para começar, coloque luvas de laboratório e roupas de proteção apropriadas. Em seguida, lave um par de tesouras dissecando e fórceps primeiro com detergente e depois com 70% de etanol e depois seque-as com uma toalha de papel limpa.

Em seguida, adicione 49 mililitros da Solução de Sal Balanceado da Hank, ou HBSS, a um tubo de 50 mililitros. Adicione um mililitro de Soro de Bezerro Fetal, ou FCS, para criar uma solução HBSS 2% FCS e misture suavemente pipetting para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes.

Em seguida, coloque um rato eutanizado na posição supina em uma placa de dissecção. Com a tesoura e fórceps, realize uma laparotomia longitudinal para acessar a cavidade abdominal. Use os fórceps para mover os intestinos do lado direito do abdômen para um lado para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago. Em seguida, com uma pipeta, coloque cinco mililitros do HBSS 2% FCS em uma placa de Petri. Usando fórceps, retire cuidadosamente o baço do estômago e coloque o baço na placa de Petri.

Para isolar as células imunes, primeiro coloque o baço em um coador de células de 40 mícrons em uma placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo no prato. Em seguida, pipeta o baço dissociado e fluido da placa de Petri em um tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e, em seguida, recuperar o tubo cuidadosamente para não perturbar a pelota.

Agora, remova o supernasce, evitando a pelota, e descarte o líquido em um recipiente de resíduos apropriado. Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de ack no tubo de centrífuga para resuspengar e lise os eritrócitos. Aguarde dois minutos e adicione HBSS 2% de FCS para obter um volume total de 15 mililitros. Repita a centrifugação. Recupere o tubo cuidadosamente e descarte o supernatante. Resuspense a pelota novamente em cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Para contar as células resuspended, diluir cinco microlitres da suspensão celular com cinco microliters de Trypan Blue. Em seguida, deposite suavemente uma gota de cinco microliter desta suspensão celular diluída entre o vidro de cobertura e o slide Malassez. Agora, sob um microscópio a 40X de ampliação, conte o número de células presentes. Em seguida, ajuste a concentração celular para 10 para a sétima célula por mililitro adicionando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.

Para manchar as células imunes, comece rotulando seis tubos FACS de um a seis. Em seguida, transfira 200 microliters da solução celular para cada um dos seis tubos. Centrifugar esses tubos a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e remover o supernante.

Em seguida, rotule seis novos tubos FACS como um a seis e pipetas 200 microliters de HBSS 2% FCS em cada. Prepare as seis novas misturas de anticorpos adicionando a quantidade apropriada de anticorpos a cada tubo de acordo com a tabela um. Mix um é para células não manchadas sem adição de anticorpos. Misturas de dois a cinco cada um contêm um anticorpo único diferente para configurações de compensação. A mistura seis contém todos os quatro anticorpos para células multi-manchadas para serem usadas para triagem.

Em seguida, transfira essas misturas de anticorpos para os tubos FACS numerados correspondentes. Incubar essas soluções por 20 minutos a quatro graus Celsius ou no gelo no escuro. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo e, em seguida, centrífuga novamente. Descarte o supernatante e, em seguida, resuspenja as pelotas em 200 microliters de HBSS 2% FCS. Por fim, transfira as pelotas resuspendadas para novos tubos FACS rotulados.

Para executar FACS, primeiro ligue o classificador. Em seguida, selecione o menu do cítmetro e clique na inicialização fluidics. Siga as instruções na tela.

Na guia de fluxo, clique na cruz vermelha para ligar o fluxo e, em seguida, espere 15 minutos para que o fluxo se estabilize. Ajuste a amplitude do fluxo até que você veja uma clara queda destacada aparecer na guia de fluxo. Em seguida, clique no ponto doce para completar o ajuste de amplitude. Insira a Densidade Neutra, ou ND, filtro 1.0 na frente do laser.

Abra o menu do cítmetro na parte superior da tela e selecione CST, que significa Configuração e Rastreamento de Cytometer. Para realizar o controle diário de qualidade, primeiro diluir as contas CST com meio FACS em um tubo FACS seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, carregue o tubo na máquina e execute o controle CST clicando em executar na guia CST.

Quando o controle CST estiver completo, substitua o filtro ND 1.0 pelo filtro ND 2.0 no cítmetro. Em seguida, diluir as contas de atraso de queda no meio FACS seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, carregar o tubo no FACS. Para garantir a classificação adequada, realize o atraso de queda clicando primeiro na tensão e, em seguida, no filtro óptico. O quadrante direito do filtro óptico deve ser igual a 100%, indicando que 100% das gotas são registradas pela máquina. Se necessário, ajuste o parafuso laser vermelho no cítmetro esquerdo ou direito para obter 100% no quadrante direito. É importante garantir que o córrego caia no tubo de coleta. Para isso, realize uma espécie de teste clicando na gaveta de resíduos e, em seguida, teste o tipo. Verifique se os fluxos laterais caem nos tubos de coleta. Se não o fizerem, ajuste a tensão sob a guia de classificação até que o façam.

Navegue até o modelo experimental selecionando a guia do navegador e clicando na exibição compartilhada. Em seguida, abra o experimento Accudrop_DROP DELAY e clique no botão de layout de classificação. Agora, altere a taxa de limiar no painel de aquisição manipulando a taxa de fluxo até atingir 3.000 eventos por segundo. Clique em tensão e clique no filtro óptico. O quadrante esquerdo deve ser igual a zero e quadrante direito igual a 100.

Finalmente, na janela de layout de classificação, clique em classificar e clique em cancelar. O quadrante esquerdo deve ser igual a 100 e o quadrante direito igual a zero. Se o quadrante esquerdo tiver menos de 95, clique em auto-atraso para instruir o software a aumentar automaticamente a tensão para obter 100% das gotas no quadrante esquerdo.

Para começar a citometria de fluxo, primeiro usaremos células não manchadas para definir a morfologia celular e os picos negativos dos fluorochromes. Para isso, coloque um tubo contendo células não manchadas na máquina e sob a guia do painel de aquisição clique em carga. Na aba do cítmetro, ajuste as tensões de dispersão dianteira e lateral até ver sua população celular como uma densa concentração de pontos na tela. Linfócitos são células pequenas, então eles terão uma dispersão baixa para a frente e dispersão lateral baixa.

Em seguida, remova a fluorescência de fundo ajustando a tensão para os fluorocromes na guia do citógrafo até que as populações celulares em um nível negativo estejam na primeira década na guia global da planilha. No menu do cítmetro, clique na configuração de exibição e verifique se todos os fluorochromes estão presentes. Em seguida, coloque o tubo dois no cítômetro e clique na carga. Ajuste a sobreposição espectral na guia do citômetro até que as medianas negativas e positivas da população estejam alinhadas na guia da planilha global. Na guia de aquisição, defina os eventos para registrar o parâmetro para 10.000 e clique em gravar. Repita estes passos com tubos três, quatro e cinco.

Em seguida, tubo de carga seis que contém as células multi-manchadas. Para isolar linfócitos B, primeiro configure os parâmetros para classificar as células com base em sua morfologia. Na primeira janela, plote a área de dispersão dianteira FSC-A no eixo y e na área de dispersão lateral SSC-A no eixo x. No gráfico de dispersão, cada ponto representa uma célula. Clique no portão do polígono na planilha global e selecione a população com uma dispersão para a frente baixa e uma dispersão lateral intermediária. Em uma nova janela de gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse na janela e selecione mostrar populações do menu e clique em P1.

Em seguida, na nova janela, portal as células positivas CD45 viáveis, plotando viabilidade no eixo y e CD45 no eixo x. Use o portão do polígono para circular as células com baixa viabilidade e alto sinal CD45 e selecione P2 para exibir as células selecionadas em uma nova janela. Na janela seguinte, portão para leucócitos positivos CD45, excluindo linfócitos T. Com CD45 no eixo x e CD3 no eixo y, circule a população com um alto sinal CD45 e baixo sinal CD3 negativo e selecione P3. Por fim, portão para células positivas cd19 que identificam os linfócitos B. Com CD19 no eixo y e CD3 no eixo x, circule a população com um alto sinal CD19 e um sinal CD3 negativo baixo e selecione P4.

Todos os parâmetros de classificação estão agora definidos. Em seguida, na janela de layout de classificação, selecione sua população celular de interesse- P4, que é a quarta população que foi fechada, e diz à máquina para apenas classificar linfócitos B. Defina eventos-alvo para 10.000 células e defina precisão à pureza. Só estamos classificando uma população. No entanto, até quatro populações diferentes podem ser classificadas ao mesmo tempo. Uma vez pronto, clique em classificar e OK. Então, espere pela classificação celular.

Uma vez que a classificação celular esteja completa, execute um controle de pureza ao pipetar 10 microliters das células classificadas em um novo tubo FACS com 90 microliters de HBSS 2% FCS. Coloque o tubo no cítmetro, clique na carga e clique em gravar para analisar os fenótipos das células para verificar se a estratégia de gating funcionou como pretendido.

Agora, vamos analisar as células classificadas para determinar a porcentagem de linfócitos B entre os leucócitos que foram isolados do baço do rato. Para iniciar, clique duas vezes no ícone FlowJo e arraste os arquivos de cada tubo para a janela de todas as amostras.

Clique no polígono e recrie as estratégias de gating que foram usadas na seção anterior. Em seguida, clique no editor de layout e arraste as populações de linfócitos B de interesse do tubo seis e o controle de pureza para a guia do editor de layout. Gráficos de pontos representando linfócitos B aparecerão. Neste exemplo, o enredo no canto superior direito representa os linfócitos B classificados da suspensão total da célula do baço e o enredo no canto inferior direito é o controle da pureza. As células só devem aparecer na população de interesse no controle da pureza.

Para verificar a pureza dos linfócitos B nas células classificadas, clique no editor de tabelas. Arraste a população de linfócitos B do tubo seis e controle de pureza na mesa. No menu estatístico, selecione a frequência de células positivas de CD45 para testar a pureza dessa população celular. Em seguida, clique em criar tabela. Os valores dos parâmetros aparecem em uma nova tabela. Na janela de controle da pureza, verifique a frequência de linfócitos B dentro das células positivas CD45, que devem ser superiores a 98%.

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Results

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Neste protocolo, purificamos linfócitos B esplênicos usando a tecnologia FACS. Primeiro isolamos leucócitos do baço e os manchamos. Usando uma combinação de marcadores de superfície de célula B, criamos uma estratégia de gating para classificá-los (Figura 2, painel superior). No final do experimento, verificamos se as células do tubo de coleta eram células B através de um "teste de pureza". Mantivemos a mesma estratégia de gating e observamos que mais de 98% das células eram de fato células B (Figura 2, painel inferior). Assim, o FACS é um protocolo eficaz para isolar populações de células imunes com alto grau de pureza. As células coletadas podem então ser usadas para experimentos a jusante, como cultura celular, RT-qPCR e ensaios de citotoxicidade.

Figure 2
Figura 2: Estratégia de gating e teste de pureza pós-tipo. (A) As células foram primeiro fechadas com base em sua morfologia (esquerda: FSC-A, SSC-A), depois apenas vivas (média esquerda: viabilidade, CD45), CD45+ células (CD45, CD3) foram plotadas contra CD19 e CD3. Apenas as células CD19+ foram classificadas. (B) Resultados dos testes de pureza de uma fração de células obtidas após a triagem celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Applications and Summary

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A citometria de fluxo é uma técnica em primeira mão para caracterizar e classificar populações de células imunes com alto grau de pureza. É ferramenta primordial no campo da pesquisa, pois permite o enriquecimento de populações celulares específicas e decifrar a resposta imune aos patógenos. Com o aumento do número de fluorochromes disponíveis e citómetros, o número de parâmetros detectáveis é altamente aumentado. Como resultado, a análise bioinformática dos dados FACS começou a surgir e abriu novos horizontes para a citometria de fluxo (3). A citometria de fluxo oferece outras aplicações em hematologia e oncologia (4) onde é utilizada para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico.

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References

  1. Lanier, L. L. Just the FACS. The Journal of Immunology, 193 (5), 2043-2044 (2014).
  2. Walker, J. M. Epiblast Stem Cells IN Series Editor.
  3. Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks. D. R., Herzenberg, L. A., and Herzenberg. L. A. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 453-468 (2007).
  4. Walker, J. M. Tumor Angiogenesis Assays IN Series Editor.

Transcript

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