Overview
Fonte: Meunier Sylvain1,2,3, Perchet Thibaut1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unidade de Linfopose, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
2 INSERM U1223, Paris, França
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França
A defesa contra patógenos depende da vigilância do sistema imunológico. Este sistema é complexo e compreende muitos tipos de células, cada uma com funções específicas. Essa composição complexa permite respostas imunes a uma grande diversidade de patógenos e lesões. A imunidade adaptativa permite respostas específicas contra patógenos específicos. A maioria das células responsáveis por esse tipo de imunidade são os linfócitos (células B e células T). Geralmente, as células B respondem a infecções extracelulares (como infecções bacterianas), e as células T respondem a infecções intracelulares (como infecções virais). Os diferentes tipos de células em populações de linfócitos podem ser caracterizados pela combinação de proteínas de superfície celular que expressam e/ou por um painel de citocinas secretadas.
A classificação magnética permite o enriquecimento de populações de células-alvo usando propriedades magnéticas e expressão de uma ou várias proteínas da superfície celular (1, 2). Esta técnica consiste em três passos. Primeiro, as células são incubadas com contas magnéticas que são acopladas a um ou vários anticorpos monoclonais específicos. Células que expressam proteínas superficiais que se ligam a esses anticorpos se prendem às contas magnéticas. Então, as populações de células-alvo são capturadas com um ímã. Para terminar, as células-alvo são eluidas do ímã. No final, são obtidos dois produtos de triagem, um contendo células não rotuladas e o segundo contendo as células-alvo, juntamente com as contas magnéticas. Colunas podem ser usadas para melhorar a eficiência da classificação magnética. Na coluna, um elemento não magnético alonga o caminho da célula através da coluna. Assim, o fluxo celular é desacelerado, facilitando a captura celular pelo ímã.
Figura 1: Representação esquemática da separação magnética. Leucócitos timimicos estão manchados com anticorpos biotinilados anti-CD3. Após a lavagem, streptavidin (SAV) acoplado contas especificamente fixam a biotina em anticorpos anti-CD3. (1) As células são transferidas em uma coluna. (2) O ímã não retém células não rotuladas, enquanto as células CD3 positivas permanecem na coluna. Finalmente, a coluna é separada do ímã e (3) células CD3 positivas são elucidadas em média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Existem dois tipos de classificação magnética (3). Em classificação positiva, células de interesse são capturadas com as contas magnéticas. Na classificação negativa, as células indesejadas são removidas capturando com as contas magnéticas carregando os anticorpos apropriados. Esta técnica macs permite um bom enriquecimento de células-alvo e melhora a porcentagem de células recuperadas de 1-20% para 60-98% em um órgão. Após a triagem, é necessário verificar a pureza celular e a classificação por diferentes métodos (por exemplo, citometria de fluxo). A técnica MACS é ideal para enriquecer uma população-alvo para outros experimentos, como cultura celular ou análise de ciclo celular.
Neste exercício de laboratório, demonstramos como isolar leucócitos timiços e, posteriormente, enriquecer células timmicas CD3 positivas da mistura usando a técnica de classificação celular magnética.
Procedure
1. Preparação
- Antes de começar, coloque luvas de laboratório e roupas de proteção apropriadas.
- Lave todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque-as com uma toalha de papel limpa.
- Prepare 200 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).
2. Dissecção
- Fixar um rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina.
- Usando tesouras e fórceps, faça uma laparotomia longitudinal para acessar a cavidade torácica.
- Remova o coração para ter acesso ao timo, que está localizado acima do coração. Em seguida, identifique o timo, que é composto por dois lobos brancos e está localizado na cavidade torácica acima do coração.
- Usando fórceps cuidadosamente desprender o timo e colocá-lo na placa de Petri com 5 mL de HBSS 2% FCS.
3. Isolamento de células imunes
- Coloque o timo em um coador de célula de 40 μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o timo com um êmbolo para dissociá-lo no mesmo prato.
- Transfira o timo dissociado e o fluido em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Lave a placa de Petri com 5 mL de HBSS 2% FCS e transfira o meio lavado também para o mesmo tubo de centrífuga.
- Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 20°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
- Resuspenque a pelota em 2 mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e, em seguida, compor o volume de até 14 mL usando HBSS 2% FCS.
- Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 20°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS.
- Estime a concentração celular usando o ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração celular final para 107 células/mL usando volume apropriado de HBSS 2% FCS.
4. Rotulagem magnética de células imunes
- Pegue dois tubos FACS. Rotular um tubo, "células T não enriquecidas", e o outro tubo, "células T enriquecidas", que serão separados usando rotulagem magnética.
- Distribuição da solução celular em cada um dos dois tubos FACS.
- Centrifugar o tubo "células T enriquecidas" a 370 x g por 3 min a 20°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
- Resuspende a pelota em 250 μL de mistura de anticorpos biotinilados anti-CD3 (Tabela 1, Mix 1).
| Misturar | Rotulagem de reagentes | Diluição |
| 1 | Anticorpo biotinilado anti-CD3 | 1/400 (em HBSS 2% FCS) |
| 2 | Streptavidin acoplado contas | 1/5 (em HBSS 2% FCS) |
| 3 | Anti-CD3 BV421 | 1/200 (em HBSS 2% FCS) |
Tabela 1: Mistura de anticorpos. Misturas 1 e 2 são usadas para separação magnética. Mix 3 é usado para avaliar o enriquecimento celular após a separação magnética.
- Incubar a mistura de anticorpos suspensão celular por 15 minutos a 4°C no escuro.
- Adicione 3 mL de HBSS 2% FCS aos tubos e centrífugue novamente a 370 x g por 3 min a 20°C.
- Descarte o supernatante e resuspenda a pelota em 250 contas acoplado streptavidin (Tabela 1, Mix 2).
- Incubar a mistura celular e as contas por 20 minutos no gelo.
- Em seguida, adicione 3 mL de HBSS 2% FCS e misture bem e centrífuga novamente a 370 x g para 3 min a 20°C.
- Resuspense a pelota em 2 mL de HBSS 2% FCS.
5. Separação magnética de células CD3-Positivas
- Coloque a coluna no ímã e adicione 3 mL de HBSS 2% FCS para umidificar o sistema. Espere 5 minutos.
- Em seguida, coloque as células rotuladas na coluna.
- Após a suspensão do celular passar pela coluna, lave a coluna X3 vezes com 3 mL de HBSS 2% FCS.
- Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo de coleta de 15 mL.
- Para elutar as células-alvo, adicione 5 mL de HBSS 2% FCS à coluna e lave a coluna com o êmbolo.
- Repetir a etapa de eluição com mais 5 mL de HBSS 2% FCS.
6. Avaliação do enriquecimento de células-alvo por citometria de fluxo
- Transfira 500 μL de suspensão celular elucida para um tubo FACS rotulado de "células T enriquecidas". Transfira 200 μL de suspensão "células T não enriquecidas" para um segundo FACS.
- Em seguida, centrifugar ambos os tubos a 370 x g por 7 min a 20°C.
- Descarte o supernatante e adicione 100 μL de anticorpo fluorescente Mix 3 (ver Tabela 1) a ambos os tubos.
- Incubar os dois tubos por 20 min a 4°C no escuro.
- Em seguida, adicione 3 mL de HBSS 2% FCS aos tubos e centrífugue-os a 370 x g por 3 min a 20°C.
- Descarte o supernasal, depois resuspende cada tubo em 250 μL de HBSS 2% FCS.
- Agora, avalie a taxa de enriquecimento celular CD3 positivo por citometria de fluxo.
7. Análise de dados
- Abra o ícone 'FlowJo' e arraste os arquivos para cada tubo na janela "All Sample".
- Clique duas vezes no arquivo "células T enriquecidas" para exibir o gráfico de pontos exibindo dispersão para a frente (FSC-A) no eixo X e dispersão lateral (SSC-A) no eixo Y.
- Clique em "Polígono" para circular as populações de linfócitos.
- Em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela.
- Selecione "FSC-W" no eixo Y e "FSC-A" no eixo X, e circule as células negativas FSA-W. Na janela"Identificação de Subpopulação",nomeie a população celular como "células únicas".
- Clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela. Selecione "CD3" no eixo Y e circule as células CD3 positivos. Na janela"Identificação de Subpopulação"nomeie sua população celular "células T".
- Repita com as "células T não enriquecidas".
- Para visualizar a população celular, clique em "Editor de layout" e arraste a população de "células T" de arquivos "células T enriquecidas" e "células T não enriquecidas" na guia.
- Gráficos de ponto representando linfócitos CD3+aparecerão. As células CD3+ só devem aparecer na população de interesse do tubo enriquecido CD3+.
- Para avaliar o enriquecimento de linfócitos CD3+ nas células classificadas, clique em "Table editor", e depois arraste a população de "células T" de arquivos "células T enriquecidas" e "células T não enriquecidas" para a mesa.
- No menu "Estatística", selecione "Frequência de linfócitos" para verificar a porcentagem de células CD3+ em todos os linfócitos, em seguida, clique em "Criar tabela".
- Os valores dos parâmetros aparecerão em uma nova tabela. Para as "células T enriquecidas", a frequência das células CD3+ deve ser em torno de 80%.
A classificação celular ativada por magnético, ou MACS, é uma técnica que permite aos pesquisadores separar células com base em epítopos específicos expressos em suas superfícies.
O processo geralmente começa com a extração de um órgão ou tecido, como o timo. Em seguida, as células são mecanicamente separadas, geralmente por esmagamento, até que o tecido seja dissociado em células únicas. Células indesejadas podem ser removidas nesta fase através da adição de produtos químicos. Por exemplo, amônio-cloreto-potássio, ou tampão ACK, pode ser usado para lise eritrócitos indesejados.
Em seguida, um anticorpo conjugado a uma molécula chamada biotina é adicionado à suspensão, e esses complexos se ligam aos epítopos da superfície das células-alvo. A biotina tem uma alta afinidade por outra molécula chamada streptavidina. No próximo passo, moléculas de streptavidin fundidas a contas magnéticas são adicionadas às células rotuladas por anticorpos. Quando a biotina e o streptavidin entram em contato, eles se ligam firmemente. O resultado é que as células de interesse são revestidas com contas magnéticas. Este complexo às vezes é referido como um sanduíche. Neste caso, CD3 na membrana celular na parte inferior, então anti-CD3 conjugado à biotina, e finalmente, streptavidin conjugado a contas magnéticas.
Essas células rotuladas agora podem ser colocadas em uma coluna contendo uma matriz que, auxiliada pela gravidade, permite que as células passem lentamente por um ímã. Ao fazê-lo, as células magnéticas rotuladas de contas permanecerão na borda do tubo mais próximo do ímã, enquanto as células não rotuladas continuarão em um tubo de coleta abaixo. Em seguida, as células rotuladas podem ser removidas da coluna simplesmente removendo o ímã, adicionando uma solução eluente, e aplicando pressão suave com um êmbolo para lavá-las para fora da coluna e em um tubo de coleta fresco. Em última análise, esse processo permite a recuperação de 60 a 98% das células de interesse.
Neste procedimento, isolaremos leucócitos timiáticos de um mouse e usaremos MACS para classificar células T CD3 positivas antes de confirmar a eficiência da classificação usando FACS.
Para começar, coloque qualquer equipamento de proteção apropriado, incluindo um jaleco e luvas. Em seguida, lave um par de tesouras dissecando e fórceps com 70% de etanol e seque-os com uma toalha de papel limpa. Em seguida, prepare 200 mililitros de HBSS 2% de soro fetal de bezerro, ou FCS, misturando quatro mililitros de FCS com 196 mililitros de HBSS.
Fixar um rato eutanizado em uma posição supina em uma placa de dissecção. Usando tesouras e fórceps, realize uma laparotomia longitudinal para acessar a cavidade torácica. Primeiro, remova o coração para ter acesso ao timo, que está localizado acima do coração. Em seguida, identifique o timo, que é composto de dois lóbulos brancos. Usando fórceps, desprender cuidadosamente o timo e colocá-lo em uma placa de Petri com cinco mililitros de HBSS 2% FCS.
Para isolar as células imunes, primeiro coloque o timo em um coador de células de 40 micrômetros na placa de Petri. Esmague o tecido com um êmbolo para dissociá-lo no prato. Depois disso, enxágue o êmbolo e o coador com HBSS 2% FCS para recuperar quaisquer células aderidas. Em seguida, pipeta as células dissociadas de timo e fluido da placa de Petri em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave a placa de Petri com cinco mililitros de HBSS 2% FCS e transfira esta solução de lavagem para o tubo de centrífuga de 15 mililitros também.
Em seguida, centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenja a pelota em dois mililitros de tampão de lise ACK para lise os eritrócitos. Incubar por dois minutos em temperatura ambiente na parte superior do banco. Em seguida, leve o volume para 14 mililitros com HBSS 2% FCS. Centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, descarte o supernasce e resuspenque as células em cinco mililitros de HBSS 2% FCS.
Estime a concentração celular usando um slide de Malassez como mostrado no protocolo para o isolamento FACS de linfócitos B e ajuste a concentração celular para 10 para a sétima célula por mililitro com HBSS 2% de FCS.
Transfira 500 microliters de solução celular para dois tubos FACS. Rotule um tubo não enriquecido células T e o outro tubo enriqueceu células T, que serão separadas usando rotulagem magnética.
Centrifugar o tubo enriquecido de células T a 370 vezes g por três minutos a 20 graus Celsius. Descarte o supernascer e resuspenja a pelota em 250 microliters de anticorpos anticD3 acoplados a biotina diluídos um em 400 no HBSS 2% FCS. Incubar as células por 20 minutos no gelo e no escuro. Adicione três mililitros de HBSS 2% FCS aos tubos e centrifuá-los novamente a 370 vezes g por três minutos a 20 graus Celsius. Descarte o supernascer e resuspenja a pelota em 250 microliters de contas acopladas streptavidin diluídas uma em cinco no HBSS 2% FCS. Incubar a mistura de células e contas por 20 minutos no gelo. Em seguida, adicione três mililitros de HBSS 2% FCS ao tubo, pipeta para cima e para baixo para misturar, e centrífuga novamente a 370 vezes g por três minutos a 20 graus Celsius. Resuspende a pelota em dois mililitros de HBSS 2% FCS.
Coloque a coluna no ímã e adicione três mililitros de HBSS 2% FCS para umidificar o sistema. Em seguida, pipeta as células manchadas na coluna. Após a suspensão do celular passar pela coluna, lave a coluna três vezes com três mililitros de HBSS 2% FCS. Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo de 15 mililitros. Para elutar as células-alvo, adicione cinco mililitros de HBSS 2% FCS à coluna e lave a coluna com um êmbolo. Repita esta etapa com mais cinco mililitros de HBSS 2% FCS.
Para avaliar a eficácia do isolamento celular alvo, primeiro transfira 500 microliters de suspensão celular elucida para um tubo FACS e rotule-o enriquecendo as células T. Em seguida, centrifugar os tubos enriquecidos e não enriquecidos a 370 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Descarte o supernascer, depois adicione 100 microliters de anticorpo fluorescente diluído um em 200 em HBSS 2% FCS para ambos os tubos. Incubar as células por 20 minutos no gelo e no escuro. Em seguida, adicione três mililitros de HBSS 2% FCS aos tubos e centrifuá-los a 370 vezes g por três minutos a 20 graus Celsius. Descarte o supernascer, depois resuspenja as pelotas em 250 microliters de HBSS 2% FCS. Agora, avalie a taxa de enriquecimento celular CD3 positivo usando citometria de fluxo, como mostrado no protocolo FACS.
Agora, determinaremos a frequência de linfócitos CD3 positivos entre todos os timócitos que foram isolados do timo do rato. Para iniciar, clique duas vezes no ícone FlowJo e arraste os arquivos para cada tubo na janela de todas as amostras. Em seguida, clique duas vezes no arquivo enriquecido de células T para exibir as células registradas dessa amostra em um gráfico de pontos que exibe dispersão para a frente, FSCA, no eixo x, e dispersão lateral, SSCA, no eixo y.
Clique no polígono para circular as populações de linfócitos. Em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela. Selecione FSC-W no eixo y e FSC-A no eixo x e circule as células negativas FSA-W. Na janela de identificação da sub-população, nomeie sua população celular Células Únicas. Em seguida, clique em OK na janela de identificação da sub-população e, em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela. Selecione CD3 no eixo y e circule as células CD3-positivas. Na janela de identificação da subsu população, nomeie suas células T da população celular. Repita com o arquivo não enriquecido de células T. Para visualizar sua população celular, clique em Design de Layout e arraste a população de células T de células T enriquecidas e arquivos de células T não enriquecidas para a guia.
Gráficos de ponto representando linfócitos CD3 positivos aparecerão. As células CD3 positivas só devem aparecer na população de interesse no tubo enriquecido CD3 positivo. Para avaliar o enriquecimento de linfócitos CD3 positivos nas células classificadas, clique em Table Editor e arraste a população de células T de células T enriquecidas e arquivos de células T não enriquecidas para a mesa. No menu estatístico, selecione Frequência de Células Linfócitos para verificar a porcentagem de células CD3 positivas em todos os linfócitos. Em seguida, clique em Criar tabela. Os valores dos parâmetros aparecerão em uma nova tabela. Para as células T enriquecidas, a frequência de células CD3 positivas deve ser em torno de 80% ou mais.
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Results
Neste protocolo, as células CD3-positivas foram enriquecidas a partir de leucócitos timiêmicos usando classificação de células magnéticas (Figura 1). Antes do enriquecimento celular magnético, as células CD3-positivas representavam 53,6% do total das células timmicas (Figura 2, painéis superiores). Após o enriquecimento de células magnéticas, a porcentagem de células CD3 positivas aumentou para 95% (Figura 2, painéis inferiores). Assim, o MACS é uma técnica simples, rápida e eficiente de enriquecimento celular para enriquecer as populações celulares desejadas a partir de uma mistura de suspensão celular.
Figura 2: Estratégia de gating e classificação de teste de pureza. As células são primeiro fechadas com base em sua morfologia (esquerda: FSC-A, SSC-A), e então as células são plotadas contra CD3 (à direita: CD3, SSC-A). O painel superior representa a suspensão celular de timo antes do enriquecimento celular. O painel inferior representa a suspensão da célula de timo após a classificação celular magnética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Applications and Summary
A tecnologia de separação magnética é um método comum para classificar facilmente e rapidamente uma população celular alvo. Usando anticorpos específicos de células T e contas magnéticas enriquecemos a frequência de células T em nossa amostra. A taxa de pureza no final do experimento depende da porcentagem de células-alvo na suspensão celular inicial. As células obtidas após a classificação celular magnética podem ser usadas para vários propósitos, como transferência de células ou análise de ciclo celular. Outro método de classificação, usando citometria de fluxo, pode ser usado para enriquecer células. Este rendimento da técnica tem uma taxa de pureza muito alta após a classificação celular, porém requer mais passos e leva mais tempo.
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References
- Owen, C. S. and Sykes, N. L. Magnetic labeling and cell sorting. Journal of Immunological Methods. 73 (1), 41-48 (1984).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W. and Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
- Plouffe, B. D., Murthy, S. K. and Lewis, L. H. Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: a review. Reports on Progress in Physics. 78 (1), (2014).
