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磁性活细胞分拣 (MACS): 胸腺 T 淋巴细胞的分离
 

磁性活细胞分拣 (MACS): 胸腺 T 淋巴细胞的分离

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磁活细胞分类(MACS)是一种技术,允许研究人员根据表面表达的特定表位分离细胞。

这个过程通常从提取器官或组织开始,如胸腺。然后,细胞被机械地分离,通常是通过粉碎,直到组织分离成单个细胞。在这个阶段,可以通过添加化学物质来去除不需要的细胞。例如,氯化铵-钾,或ACK缓冲液,可用于解说不需要的红细胞。

接下来,与一种称为生物锡的分子结合的抗体被添加到悬浮液中,这些复合物与目标细胞表面的表皮结合。生物锡对另一种叫做链球菌的分子具有很高的亲和力。在下一步中,与磁珠融合的链球菌分子被添加到抗体标记细胞中。当生物锡和链球菌接触时,它们紧密结合。结果是感兴趣的细胞被涂上磁珠。这个复合物有时被称为三明治。在这种情况下,CD3在细胞膜的底部,然后抗CD3结合生物素,最后,链球菌素结合磁珠。

这些标记的细胞现在可以放入一个包含矩阵的列中,在重力的辅助下,允许细胞通过磁铁缓慢地通过。当它们这样做时,磁珠标记的细胞将粘在离磁铁最近的管的边缘,而未标记的细胞将继续进入下面的收集管中。接下来,只需去除磁铁、添加润液和用柱塞施加温和压力,将标记的细胞从柱状物中排出并放入新的收集管,即可从柱状体中取出标记的细胞。最终,这个过程允许60-98%的感兴趣的细胞检索。

在此过程中,我们将从小鼠中分离胸腺白细胞,并使用 MACS 对 CD3 阳性 T 细胞进行排序,然后再确认使用 FACS 进行分拣的效率。

首先,穿上任何适当的防护设备,包括实验室外套和手套。接下来,用70%乙醇洗一把解剖剪刀和钳子,用干净的纸巾擦干。然后,通过将 4 毫升 FCS 与 196 毫升 HBSS 混合,制备 200 毫升 HBSS 2% 胎儿小牛血清(FCS)。

将安乐死小鼠固定在解剖板上的苏平位置。使用剪刀和钳子,进行纵向腹腔切除术进入胸腔。首先,取出心脏,以进入位于心脏上方的胸腺。然后识别胸腺,由两个白色叶组成。使用钳子,小心地分离胸腺,并将其放在五毫升的HBSS 2%FCS的培养皿上。

要分离免疫细胞,首先将胸腺放在培养皿中的40微米细胞过滤器上。用柱塞粉碎组织,将其分离到盘子里。在此之后,用 HBSS 2% FCS 冲洗柱塞和滤网,以恢复任何粘附细胞。然后,将分离的胸腺细胞和液体从培养皿移入15毫升的离心管中。用5毫升的HBSS 2%FCS清洗培养皿,并将这种洗涤溶液转移到15毫升的离心管中。

接下来,在20摄氏度的温度下,以370次g将管离心7分钟。丢弃上清液,将颗粒重新悬浮在两毫升ACK解毒缓冲液中,以赖解红细胞。在室温下在台面孵育两分钟。然后,使用 HBSS 2% FCS 将音量调至 14 毫升。在20摄氏度下,以370次g将管离心7分钟。然后,丢弃上清液,将细胞重新悬浮在5毫升的HBSS 2%FCS中。

使用 Malasez 幻灯片估计细胞浓度,如 B 淋巴细胞 FACS 分离协议所示,并使用 HBSS 2% FCS 将细胞浓度调整到每毫升 10 至第 7 个细胞。

将500微升的细胞溶液转移到两个FACS管中。将一管非富集T细胞和另一管富集T细胞贴上标签,使用磁性标记分离。

在20摄氏度下,以370次g将浓缩T细胞管离心3分钟。在 HBSS 2% FCS 中,丢弃上清液并重新悬浮在 250 微升生物蛋白结合抗 CD3 抗体中稀释的 400 分之一的颗粒。在冰上和黑暗中孵育细胞20分钟。在管中加入三毫升HBSS 2%FCS,并在20摄氏度下以370次g再次离心3分钟。丢弃上清液,在 250 微升链球蛋白耦合珠中重新悬浮在 HBSS 2% FCS 中五分之一稀释的颗粒中。在冰上孵育细胞和珠子的混合物20分钟。接下来,在管中加入三毫升的HBSS 2%FCS,上下移液混合,并在20摄氏度的温度下以370次g再次离心3分钟。将颗粒重新悬浮在两毫升的 HBSS 2% FCS 中。

将柱放在磁铁上,加入三毫升的 HBSS 2% FCS 来加湿系统。然后,将染色的细胞移入柱中。细胞悬浮液通过柱后,用三毫升的HBSS 2%FCS清洗柱三次。接下来,从磁铁上取下柱子,并将其放入 15 毫升的管子中。要洗去目标细胞,在柱中加入五毫升的HBSS 2%FCS,用柱塞冲洗柱塞。再用五毫升的哈佛商学院 2% FCS 重复此步骤。

为了评估靶细胞分离的有效性,首先将500微升的洗脱细胞悬浮液转移到FACS管中,并将其标记为富集T细胞。然后,在20摄氏度的温度下,以370倍g将浓缩管和非富集管离心7分钟。丢弃上清液,然后将100微升荧光抗体稀释在HBSS 2%FCS中的200分之一添加到两个管中。在冰上和黑暗中孵育细胞20分钟。接下来,在管中加入三毫升HBSS 2%FCS,在20摄氏度的温度下以370次g将其离心3分钟。丢弃上清液,然后重新悬浮在 250 微升的 HBSS 2% FCS 中的颗粒。现在,使用流式细胞测定法评估CD3阳性细胞富集率,如FACS协议所示。

现在,我们将确定从小鼠胸腺分离的所有胸腺细胞中CD3阳性淋巴细胞的频率。要开始,双击 FlowJo 图标,并拖动所有示例窗口中每个管的文件。然后,双击富集的 T 细胞文件,在显示 x 轴上的正向散点、FSCA 和 y 轴上的侧散射 SSCA 的点图上显示从该样本记录的单元格。

单击多边形以圈出淋巴细胞群。接下来,双击圆圈填充以创建新窗口。在 y 轴上选择 FSC-W,在 x 轴上选择 FSC-A,然后圈出 FSA-W 负数。在子人口标识窗口中,命名单元格填充单个单元格。接下来,单击子填充标识窗口上的"确定",然后双击圈填充以创建新窗口。在 y 轴上选择 CD3,然后圈出 CD3 阳性细胞。在子总体标识窗口中,命名单元格群 T 细胞。对未富集的 T 细胞文件重复上述操作。要可视化单元格群,请单击"布局编辑器",并将丰富的 T 细胞和未富集的 T 细胞文件中的 T 细胞填充拖动到选项卡中。

将显示表示 CD3 阳性淋巴细胞的点图。CD3阳性细胞应只出现在CD3阳性浓缩管的感兴趣人群中。要评估已排序细胞中 CD3 阳性淋巴细胞的富集性,请单击表编辑器,然后将富集的 T 细胞和非富集 T 细胞文件中的 T 细胞群拖到表中。在统计菜单上,选择淋巴细胞的频率以检查所有淋巴细胞中CD3阳性细胞的百分比。然后,单击"创建表"。参数值将显示在新表中。对于富集的T细胞,CD3阳性细胞的频率应在80%或以上。

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