Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

מיון תאים המופעל מגנטי (MACS)
 
Click here for the English version

מיון תאים המופעל מגנטי (MACS): בידוד של לימפוציטים T תימיים

Overview

מקור: מונירסילבן 1,2,3, פרצ'טתיבו 1,2,3, סופינובולט 4, רחל גולוב1,2,3
יחידה אחת ללימפופוליס, המחלקה לאימונולוגיה, מכון פסטר, פריז, צרפת
2 INSERM U1223, פריז, צרפת
3 100é Paris Diderot, סורבון פריז סיטה, צ'רול פסטר, פריז, צרפת
4 פלטפרום ציטומטריה זרימה, ציטומטריה וסמנים ביולוגיים UtechS, המרכז למדע תרגום, מכון פסטר, פריז, צרפת

הגנה מפני פתוגנים תלויה במעקב של מערכת החיסון. מערכת זו מורכבת וכוללת סוגי תאים רבים, כל אחד עם פונקציות ספציפיות. הרכב מורכב זה מאפשר תגובות חיסוניות למגוון גדול של פתוגנים ופציעות. חסינות אדפטיבית מאפשרת תגובות ספציפיות נגד פתוגנים ספציפיים. רוב התאים האחראים לסוג זה של חסינות הם הלימפוציטים (תאי B ותאי T). בדרך כלל, תאי B מגיבים לזיהומים חוץ תאיים (כגון זיהומים חיידקיים), ותאי T מגיבים לזיהומים תאיים (כגון זיהומים ויראליים). סוגים שונים של תאים באוכלוסיות לימפוציטים יכולים להתאפיין בשילוב של חלבוני פני התא שהם מבטאים ו / או על ידי פאנל של ציטוקינים מופרשים.

מיון מגנטי מאפשר העשרה של אוכלוסיות תאים ממוקדות באמצעות תכונות מגנטיות וביטוי של חלבון אחד או כמה חלבונים על פני התא (1, 2). טכניקה זו מורכבת משלושה שלבים. ראשית, התאים הם דגירה עם חרוזים מגנטיים כי הם יחד עם נוגדנים אחד או כמה חד שבטיים ספציפיים. תאים המבטאים חלבוני שטח שנקשרים לנוגדנים אלה מתחברים חרוזים מגנטיים. לאחר מכן, אוכלוסיות התאים הממוקדות נלכדות עם מגנט. כדי לסיים, התאים הממוקדים נבחנים מהמגנט. בסוף מתקבלים שני מוצרי מיון, אחד המכיל תאים ללא תווית והשני המכיל את תאי היעד בשילוב עם החרוזים המגנטיים. עמודות ניתן להשתמש כדי לשפר את היעילות של מיון מגנטי. בעמודה, רכיב לא מגנטי מאריך את נתיב התא דרך העמודה. לפיכך, זרימת התא מואטת, מקלה על לכידת התא על ידי המגנט.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הפרדה מגנטית. לויקוציטים תימיים מוכתמים בנוגדנים ביוטינילים נגד CD3. לאחר הכביסה, סטרפטאבידין (SAV) חרוזים מצמידים במיוחד לתקן את הביוטין על נוגדנים נגד CD3. (1) תאים מועברים בעמודה. (2) המגנט אינו שומר על תאים ללא תווית, בעוד שתאים חיוביים CD3 נשארים בעמודה. לבסוף, העמודה מופרדת מהמגנט ו-(3) תאים חיוביים ל- CD3 נבחנים בינוניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ישנם שני סוגים של מיון מגנטי (3). במיון חיובי, תאים מעניינים נלכדים עם החרוזים המגנטיים. במיון שלילי, תאים לא רצויים מוסרים על ידי לכידה עם החרוזים המגנטיים הנושאים את הנוגדנים המתאימים. טכניקת MACS זו מאפשרת העשרה טובה של תאים ממוקדים ומשפרת את אחוז התאים התאושש מ 1-20% ל 60-98% באיבר. לאחר המיון, יש צורך לאמת את טוהר התא ומיון לפי שיטות שונות (למשל cytometry זרימה). טכניקת MACS אידיאלית להעשרת אוכלוסיית יעד לניסויים אחרים כגון תרבית תאים או ניתוח מחזור תאים.

בתרגיל מעבדה זה, אנו מדגימים כיצד לבודד לויקוציטים תימיים ולאחר מכן להעשיר תאים חיוביים CD3 תימי מהתערובת באמצעות טכניקת מיון תאים מגנטיים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנה

  1. לפני שתתחילו, לבשו כפפות מעבדה וביגוד מגן מתאים.
  2. לשטוף את כל כלי הניתוח, תחילה עם חומר ניקוי ולאחר מכן עם 70% אתנול ולאחר מכן לייבש אותם עם מגבת נייר נקי.
  3. הכן 200 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המכילה 2% סרום עגל עוברי (FCS).

2. ניתוח

  1. הצמד עכבר מורדם על צלחת ביתור בתנוחת עלון.
  2. באמצעות מספריים ומלקחיים לבצע לפרוסטומיה אורך כדי לגשת לחלל החזה.
  3. הסר את הלב כדי לקבל גישה התימוס, אשר ממוקם מעל הלב. לאחר מכן, לזהות את התימוס, אשר מורכב משתי אונות לבנות והוא ממוקם בחלל החזה מעל הלב.
  4. באמצעות מלקחיים לנתק בזהירות את התימוס ומניחים אותו על צלחת פטרי עם 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.

3. בידוד תאי מערכת החיסון

  1. מניחים את התימוס על מסננת תא 40 מיקרומטר על אותה צלחת פטרי. למחוץ את התימוס עם בוכנה כדי לנתק אותו באותה מנה.
  2. מעבירים את התימוס הנותק ואת הנוזל לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
  3. לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מ"ל של HBSS 2% FCS ולהעביר את המדיום שטוף גם לתוך אותו צינור צנטריפוגה.
  4. צנטריפוגות הצינור ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
  5. resuspend הכדור ב 2 מ"ל של אשלגן אצטט ליזה אריתרוציטים. המתן 2 דקות ולאחר מכן האיפור את עוצמת הקול עד 14 מ"ל באמצעות HBSS 2% FCS.
  6. צנטריפוגות הצינור שוב ב 370 x גרם במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.
  7. להעריך את ריכוז התא באמצעות בדיקות כתמים כחול טריפן ולהתאים את ריכוז התא הסופי ל 107 תאים / מ"ל באמצעות נפח מתאים של HBSS 2% FCS.

4. תיוג מגנטי של תאי מערכת החיסון

  1. קח שני צינורות FACS. סמן צינור אחד, "תאי T לא מועשרים", והצינור השני, "תאי T מועשרים" - שיופרדו באמצעות תיוג מגנטי.
  2. הפצת פתרון תא לכל אחד משני צינורות ה- FACS.
  3. צנטריפוגה צינור "תאי T מועשרים" ב 370 x גרם במשך 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant הימנעות הכדור.
  4. resuspend הכדור ב 250 μL של נוגדנים ביוטינילאט אנטי CD3 לערבב (טבלה 1, לערבב 1).
לערבב תיוג ריאגנטים דילול
1 נוגדן ביוטינילאט נגד CD3 1/400 (ב- HBSS 2% FCS)
2 סטרפטאבידין חרוזים מצמידים 1/5 (ב- HBSS 2% FCS)
3 אנטי CD3 BV421 1/200 (ב- HBSS 2% FCS)

טבלה 1: קומפוזיציה לערבב נוגדנים. תערובות 1 ו-2 משמשות להפרדה מגנטית. תערובת 3 משמשת להערכת העשרת התא לאחר הפרדה מגנטית.

  1. לדגור על תערובת ההשעיה-נוגדנים של התא במשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
  2. הוסף 3 מ"ל של HBSS 2% FCS הן לצינורות וצנטריפוגה אותם שוב ב 370 x g במשך 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
  3. השליכו את הסופר-נט והדביקו מחדש את הכדור ב-250 חרוזים מצמידי סטרפטאבין (טבלה 1, ערבוב 2).
  4. לדגור על תערובת התאים והחרוזים במשך 20 דקות על קרח.
  5. לאחר מכן, להוסיף 3 מ"ל של HBSS 2% FCS ולערבב היטב צנטריפוגה שוב ב 370 x g במשך 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
  6. resuspend הכדור ב 2 מ"ל של HBSS 2% FCS.

5. הפרדה מגנטית של תאים חיוביים CD3

  1. מקם את העמודה על המגנט והוסף 3 מ"ל של HBSS 2% FCS כדי לח את המערכת. חכה 5 דקות.
  2. לאחר מכן, הזרם את התאים המסומנים בתווית לתוך העמודה.
  3. לאחר התליית התא עובר דרך העמודה, לשטוף את העמודה X3 פעמים עם 3 מ"ל של HBSS 2% FCS.
  4. לאחר מכן, הסר את העמודה מהמגנט והנח אותו בצינור איסוף של 15 מ"ל.
  5. כדי לחמוק מתאי היעד, הוסף 5 מ"ל של HBSS 2% FCS לעמודה ורוקן את העמודה עם הבוכנה.
  6. חזור על שלב ההתחמקות עם עוד 5 מ"ל של HBSS 2% FCS.

6. הערכת העשרת תאי יעד לפי ציטומטריית זרימה

  1. העבר 500 μL של השעיית תא eluted לצינור FACS שכותרתו "תאי T מועשרים". העבר 200 μL של השעיית "תאי T לא מועשרים" ל- FACS שני.
  2. לאחר מכן, צנטריפוגה שני הצינורות ב 370 x g במשך 7 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
  3. השלך את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של נוגדן פלואורסצנטי לערבב 3 (ראה טבלה 1) לשני הצינורות.
  4. לדגור על שני הצינורות במשך 20 דקות ב 4°C בחושך.
  5. לאחר מכן, להוסיף 3 מ"ל של HBSS 2% FCS צינורות צנטריפוגה אותם ב 370 x g במשך 3 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
  6. להשליך את supernatant, ולאחר מכן resuspend כל צינור ב 250 μL של HBSS 2% FCS.
  7. עכשיו, להעריך את קצב העשרת התאים CD3 חיובי על ידי ציטומטריית זרימה.

7. ניתוח נתונים

  1. פתח את סמל 'FlowJo' וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון "כל הדוגמה".
  2. לחץ פעמיים על קובץ "תאי T מועשרים" כדי להציג את התוויית הנקודות המציגה פיזור קדימה (FSC-A) בציר X ופיזור הצד (SSC-A) בציר ה- Y.
  3. לחץ על "מצולע" כדי להקיף את אוכלוסיות הלימפוציטים.
  4. לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה כדי ליצור חלון חדש.
  5. בחר "FSC-W" בציר Y ו - "FSC-A" בציר X והקף את התאים השליליים FSA-W. בחלון "זיהוי אוכלוסין משנה", תן שם לאוכלוסיית התאים "תאים בודדים".
  6. לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה כדי ליצור חלון חדש. בחר "CD3" בציר Y והקף את התאים החיוביים ל- CD3. בחלון "זיהוי אוכלוסין משנה" קוראים לאוכלוסיית התאים שלך "תאי T".
  7. חזור על הפעולה עם "תאי T לא מועשרים".
  8. כדי להציג באופן חזותי את אוכלוסיית התאים, לחץ על "עורך הפריסה" וגרור את האוכלוסייה "תאי T" מקבצים "תאי T מועשרים" ו " תאי T שאינם מועשרים "לתוך הכרטיסיה.
  9. חלקות נקודה המייצגות לימפוציטים CD3+ יופיעו. תאי CD3+ אמורים להופיע רק באוכלוסיית העניין בצינור המועשר CD3+ בלבד.
  10. כדי להעריך את ההעשרה של לימפוציטים CD3+ בתאים ממוינים, לחץ על "עורך טבלאות"ולאחר מכן גרור את האוכלוסייה "תאי T" מקבצים "תאי T מועשרים" ו " תאי T לא מועשרים "לטבלה.
  11. בתפריט "סטטיסטיקה", בחר "תדירות הלימפוציטים" תאים כדי לבדוק את אחוז תאי CD3 + בכל הלימפוציטים ולאחר מכן לחץ על "צור טבלה".
  12. ערכי פרמטר יופיעו בטבלה חדשה. עבור "תאי T מועשרים", התדירות של תאי CD3+ צריכה להיות סביב 80%.

מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית, או MACS, היא טכניקה המאפשרת לחוקרים להפריד תאים בהתבסס על אפיטופים ספציפיים המתבטאים על פני השטח שלהם.

התהליך מתחיל בדרך כלל עם מיצוי של איבר או רקמה, כגון התימוס. לאחר מכן, התאים מופרדים באופן מכני, בדרך כלל על ידי ריסוק, עד שהרקמה מנותקת לתאים בודדים. תאים לא רצויים ניתן להסיר בשלב זה באמצעות תוספת של כימיקלים. לדוגמה, אמוניום-כלוריד-אשלגן, או חוצץ ACK, ניתן להשתמש כדי לייס אריתרוציטים לא רצויים.

לאחר מכן, נוגדן ההוליד למולקולה הנקראת ביוטין מתווסף להשעיה, ומתחמים אלה נקשרים לאפיטופים של פני השטח של תאי היעד. לביוטין יש זיקה גבוהה למולקולה אחרת הנקראת סטרפטאבידין. בשלב הבא, מולקולות סטרפטבידין המותכות לחרוזים מגנטיים מתווספות לתאים המסומנים בנוגדנים. כאשר הביוטין והסטרפטבידין באים במגע, הם נקשרים בחוזקה. התוצאה היא שתאי העניין מצופים חרוזים מגנטיים. תסביך זה מכונה לעתים כריך. במקרה זה, CD3 על קרום התא בתחתית, לאחר מכן אנטי CD3 מצומד ביוטין, ולבסוף, סטרפטאבין מצומד לחרוזים מגנטיים.

תאים מסומנים אלה יכולים כעת להיות ממוקמים בעמודה המכילה מטריצה אשר, בסיוע כוח המשיכה, מאפשר לתאים לעבור לאט על ידי מגנט. כאשר הם עושים זאת, התאים המסומנים חרוז מגנטי ידבקו לקצה הצינור הקרוב ביותר למגנט, בעוד התאים שאינם מסומנים ימשיכו לתוך צינור איסוף להלן. לאחר מכן, ניתן להסיר את התאים המסומנים מהעמודה פשוט על ידי הסרת המגנט, הוספת פתרון אלים, והפעלת לחץ עדין עם בוכנה כדי לשטוף אותם מהעמוד לתוך צינור איסוף טרי. בסופו של דבר, תהליך זה מאפשר 60 עד 98% אחזור של התאים מעניינים.

בהליך זה, נבודד לויקוציטים תימיים מעכבר ונשתמש ב- MACS כדי למיין תאי T חיוביים CD3 לפני אישור היעילות של מיון באמצעות FACS.

ראשית, לבשו את כל ציוד המגן המתאים כולל חלוק מעבדה וכפפות. לאחר מכן, לשטוף זוג מספריים לנתח מלקחיים עם 70% אתנול ולייבש אותם עם מגבת נייר נקייה. לאחר מכן להכין 200 מיליליטר של סרום עגל עוברי HBSS 2%, או FCS, על ידי ערבוב ארבעה מיליליטר של FCS עם 196 מיליליטר של HBSS.

הצמד עכבר מורדם בתנוחת עלון על צלחת ניתוח. באמצעות מספריים ומלקחיים, לבצע לפרוסטומיה אורך כדי לגשת לחלל החזה. ראשית, להסיר את הלב כדי לקבל גישה התימוס, אשר ממוקם מעל הלב. ואז לזהות את התימוס, אשר מורכב משתי אונות לבנות. בעזרת מלקחיים, יש לנתק בזהירות את התימוס ולהניח אותו על צלחת פטרי עם חמישה מיליליטר של HBSS 2% FCS.

כדי לבודד את תאי החיסון, מניחים תחילה את התימוס על מסננת תאי 40 מיקרומטר בצלחת הפטרי. לרסק את הרקמה עם בוכנה כדי לנתק אותו לתוך המנה. לאחר מכן, לשטוף את הבוכנה ואת מסננת עם HBSS 2% FCS כדי לשחזר את כל התאים דבק. לאחר מכן, פיפטה תאי התימוס המנותקים והנוזל מצלחת פטרי לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לשטוף את צלחת פטרי עם חמישה מיליליטר של HBSS 2% FCS ולהעביר את פתרון לשטוף זה צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר גם.

לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 370 פעמים g במשך שבע דקות ב 20 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant ו resuspend הכדור בשני מיליליטר של ACK ליסינג חוצץ כדי ליזה את אריתרוציטים. דגירה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר על הספסל העליון. לאחר מכן, להביא את הנפח ל 14 מיליליטר עם HBSS 2% FCS. צנטריפוגות הצינור ב 370 פעמים גרם במשך שבע דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להשליך את supernatant ו resuspend התאים בחמישה מיליליטר של HBSS 2% FCS.

להעריך את ריכוז התא באמצעות שקופית Malassez כפי שמוצג בפרוטוקול לבידוד FACS של לימפוציטים B ולהתאים את ריכוז התא ל 10 כדי התא השביעי למיליליטר עם HBSS 2% FCS.

העבר 500 מיקרוליטרים של פתרון תאים לשני צינורות FACS. סמן צינור אחד של תאי T לא מועשרים ותאי T מועשרים בצינור השני, שיופרדו באמצעות תיוג מגנטי.

צנטריפוגות צינור תאי T מועשר ב 370 פעמים גרם במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס. השלך את supernatant ו resuspend הכדור ב 250 microliters של ביוטין בשילוב נוגדן CD3 מדולל אחד מכל 400 ב HBSS 2% FCS. לדגור על התאים במשך 20 דקות על קרח בחושך. הוסף שלושה מיליליטר של HBSS 2% FCS לצינורות וצנטריפוגה אותם שוב ב 370 פעמים g במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נט והגדילו מחדש את הכדור ב-250 מיקרו-לייטרים של חרוזים מצמידי סטרפטאבידין מדוללים אחד מכל חמישה ב-HBSS 2% FCS. לדגור על תערובת של תאים וחרוזים במשך 20 דקות על קרח. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של HBSS 2% FCS לצינור, pipette למעלה ולמטה לערבב, וצנטריפוגה שוב ב 370 פעמים g במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס. resuspend הכדור בשני מיליליטר של HBSS 2% FCS.

מקם את העמודה על המגנט והוסף שלושה מיליליטר של HBSS 2% FCS כדי לח את המערכת. לאחר מכן, צנרת את התאים המוכתמים לתוך העמודה. לאחר התליית התא עובר דרך העמודה, לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של HBSS 2% FCS. לאחר מכן, להסיר את העמודה מן המגנט ומניחים אותו בצינור 15 מיליליטר. כדי לחמוק מתאי היעד, הוסף חמישה מיליליטרים של HBSS 2% FCS לעמודה ורוקן את העמודה עם בוכנה. חזור על שלב זה עם עוד חמישה מיליליטר של HBSS 2% FCS.

כדי להעריך את האפקטיביות של בידוד תא היעד, העבר תחילה 500 מיקרוליטרים של השעיית תאים אלוטים לצינור FACS ולתייג אותו מועשר תאי T. לאחר מכן, צנטריפוגה הן צינורות מועשרים ולא מועשרים ב 370 פעמים גרם במשך שבע דקות ב 20 מעלות צלזיוס. השלך את supernatant, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של נוגדן פלואורסצנטי מדולל אחד מכל 200 ב HBSS 2% FCS לשני הצינורות. לדגור על התאים במשך 20 דקות על קרח בחושך. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של HBSS 2% FCS לצינורות וצנטריפוגה אותם ב 370 פעמים g במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant, ולאחר מכן resuspend הכדורים ב 250 microliters של HBSS 2% FCS. כעת, הערך את קצב העשרת התאים החיובי CD3 באמצעות ציטומטריית זרימה כפי שמוצג בפרוטוקול FACS.

עכשיו, אנו נקבע את התדירות של לימפוציטים CD3 חיובי בין כל התימוסיטים שהיו מבודדים מן העכבר תימוס. כדי להתחיל, לחץ פעמיים על סמל FlowJo וגרור את הקבצים עבור כל צינור בחלון לדוגמה. לאחר מכן, לחץ פעמיים על קובץ תאי T מועשר כדי להציג את התאים שנרשמו מאותה דוגמה על תיימת נקודה המציגה פיזור קדימה, FSCA, על ציר ה- x ופיזור הצד, SSCA, על ציר ה- y.

לחץ על מצולע כדי להקיף את אוכלוסיות הלימפוציטים. לאחר מכן, לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה כדי ליצור חלון חדש. בחר FSC-W בציר ה- y וב- FSC-A בציר ה- x והקף את התאים השליליים FSA-W. בחלון זיהוי אוכלוסיית המשנה, תן שם לאוכלוסיית התאים שלך תאים בודדים. לאחר מכן, לחץ על אישור בחלון זיהוי אוכלוסיית המשנה ולאחר מכן לחץ פעמיים על האוכלוסייה המקיפה כדי ליצור חלון חדש. בחר CD3 בציר ה- y והקף את התאים החיוביים ל- CD3. בחלון זיהוי אוכלוסיית המשנה, תן שם לתאי T של אוכלוסיית התאים שלך. חזור על הפעולה עם קובץ תאי T שאינו מועשר. כדי להציג באופן חזותי את אוכלוסיית התאים שלך, לחץ על עורך הפריסה וגרור את אוכלוסיית תאי ה- T מתאי T מועשרים וקבצי T שאינם מועשרים לכרטיסיה.

תיתוני נקודה המייצגים לימפוציטים חיוביים CD3 יופיעו. תאים חיוביים CD3 צריכים להופיע רק באוכלוסיית העניין בצינור המועשר החיובי CD3. כדי להעריך את ההעשרה של לימפוציטים חיוביים CD3 בתאים ממוינים, לחץ על עורך הטבלה ולאחר מכן גרור את אוכלוסיית תאי ה- T מתאי T מועשרים וקבצי תאי T שאינם מועשרים לטבלה. בתפריט הסטטיסטי, בחר תדירות של תאי לימפוציטים כדי לבדוק את אחוז התאים החיוביים CD3 בכל הלימפוציטים. לאחר מכן, לחץ על צור טבלה. ערכי פרמטר יופיעו בטבלה חדשה. עבור תאי T מועשרים, התדירות של תאים חיוביים CD3 צריך להיות סביב 80% ומעלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בפרוטוקול זה, תאים חיוביים CD3 הועשרו מלוקוציטים תימיים באמצעות מיון תאים מגנטיים (איור 1). לפני העשרת תאים מגנטיים CD3 תאים חיוביים ייצגו 53.6% מכלל התאים התימין (איור 2, לוחות עליונים). לאחר העשרת התא המגנטי, אחוז התאים החיוביים ל-CD3 עלה ל-95% (איור 2, החלוניות התחתונות). לכן, MACS היא טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה העשרת תאים כדי להעשיר את אוכלוסיות התא הרצוי מתערובת השעיית תאים.

Figure 2
איור 2: אסטרטגיית גיטינג ומיון מבחן טוהרה. התאים מגודרים תחילה על סמך המורפולוגיה שלהם (משמאל: FSC-A, SSC-A), ולאחר מכן תאים מסוממים נגד CD3 (מימין: CD3, SSC-A). החלונית העליונה מייצגת את השעיית תאי התימוס לפני העשרת התא. החלונית התחתונה מייצגת השעיית תאי תימוס לאחר מיון תאים מגנטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טכנולוגיית הפרדה מגנטית היא שיטה נפוצה למיין בקלות ובמהירות אוכלוסיית תאי יעד. באמצעות תאי T נוגדנים ספציפיים וחרוזים מגנטיים העשרנו את תדירות תאי ה- T במדגם שלנו. שיעור הטוהר בסוף הניסוי תלוי באחוז תאי היעד בהשעיית התא הראשונית. תאים המתקבלים לאחר מיון תאים מגנטיים יכולים לשמש למטרות שונות כגון - העברת תאים או ניתוח מחזור התא. שיטת מיון נוספת, באמצעות ציטומטריית זרימה, יכולה לשמש להעשרת תאים. טכניקה זו מניבה יש שיעור טוהר גבוה מאוד לאחר מיון התא אולם זה דורש צעדים נוספים ולוקח יותר זמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Owen, C. S. and Sykes, N. L. Magnetic labeling and cell sorting. Journal of Immunological Methods. 73 (1), 41-48 (1984).
  2. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W. and Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  3. Plouffe, B. D., Murthy, S. K. and Lewis, L. H. Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: a review. Reports on Progress in Physics. 78 (1), (2014).

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter