Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Clasificación de células activadas magnéticas (MACS)
 

Clasificación de células activadas magnéticas (MACS): Aislamiento de linfocitos T timáticos

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

La clasificación celular activada magnéticamente, o MACS, es una técnica que permite a los investigadores separar las células en función de epítopos específicos expresados en sus superficies.

El proceso generalmente comienza con la extracción de un órgano o tejido, como el timo. Luego, las células se separan mecánicamente, generalmente por aplastamiento, hasta que el tejido se disocia en células individuales. Las células no deseadas se pueden eliminar en esta etapa a través de la adición de productos químicos. Por ejemplo, el amonio-cloruro-potasio, o tampón ACK, se puede utilizar para lise eritrocitos no deseados.

A continuación, un anticuerpo conjugado con una molécula llamada biotina se añade a la suspensión, y estos complejos se unen a los epítopos de la superficie de las células diana. La biotina tiene una alta afinidad por otra molécula llamada streptavidina. En el siguiente paso, las moléculas de estreptavidina fusionadas con cuentas magnéticas se añaden a las células etiquetadas como anticuerpos. Cuando la biotina y la estreptavidina entran en contacto, se unen firmemente. El resultado es que las células de interés están recubiertas con cuentas magnéticas. Este complejo se conoce a veces como un sándwich. En este caso, CD3 en la membrana celular en la parte inferior, luego anti-CD3 conjugado a la biotina, y finalmente, la esptavidina conjugada con cuentas magnéticas.

Estas células etiquetadas ahora se pueden colocar en una columna que contiene una matriz que, asistida por la gravedad, permite que las células pasen lentamente por un imán. A medida que lo hagan, las células con cuentas magnéticas se pegarán al borde del tubo más cercano al imán, mientras que las células no etiquetadas continuarán en un tubo de recolección a continuación. A continuación, las células etiquetadas se pueden eliminar de la columna simplemente quitando el imán, añadiendo una solución eluyente y aplicando una suave presión con un émbolo para eliminarlas de la columna y en un tubo de recolección fresco. En última instancia, este proceso permite una recuperación de 60 a 98% de las células de interés.

En este procedimiento, aislaremos los leucocitos timicos de un ratón y usaremos MACS para ordenar las células T CD3 positivas antes de confirmar la eficiencia de la clasificación utilizando FACS.

Para empezar, ponte cualquier equipo de protección apropiado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes. A continuación, lave un par de tijeras dissección y fórceps con 70% de etanol y séquelas con una toalla de papel limpia. A continuación, prepare 200 mililitros de SUERO de becerro fetal HBSS 2% o FCS, mezclando cuatro mililitros de FCS con 196 mililitros de HBSS.

Ancle un ratón eutanasiado en una posición supina en una placa de disección. Con tijeras y fórceps, realice una laparotomía longitudinal para acceder a la cavidad torácica. Primero, quita el corazón para tener acceso al timo, que se encuentra sobre el corazón. Luego identifica el timo, que se compone de dos lóbulos blancos. Usando fórceps, desenganche cuidadosamente el timo y colóquelo en un plato de Petri con cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Para aislar las células inmunitarias, coloque primero el timo en un colador de células de 40 micrómetros en el plato Petri. Aplastar el tejido con un émbolo para disociarlo en el plato. Después de esto, enjuague el émbolo y el colador con HBSS 2% FCS para recuperar las células adheridas. Luego, pipetee las células disociadas del timo y el líquido de la placa Petri en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Lave el plato Petri con cinco mililitros de HBSS 2% FCS y transfiera esta solución de lavado al tubo centrífugo de 15 mililitros también.

A continuación, centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en dos mililitros de tampón de lising ACK para liciar los eritrocitos. Incubar durante dos minutos a temperatura ambiente en la parte superior del banco. A continuación, llevar el volumen a 14 mililitros con HBSS 2% FCS. Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 20 grados centígrados. Luego, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Estimar la concentración celular utilizando una diapositiva De Malassez como se muestra en el protocolo para el aislamiento FACS de linfocitos B y ajustar la concentración celular a 10 a las séptimas células por mililitro con HBSS 2% FCS.

Transfiera 500 microlitros de solución celular en dos tubos FACS. Etiquetar un tubo de células T no enriquecidas y el otro tubo enriquecido de células T, que se separarán mediante etiquetado magnético.

Centrifugar el tubo de células T enriquecidos a 370 veces g durante tres minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 250 microlitros de anticuerpo anti CD3 acoplado a biotina diluido uno de cada 400 en HBSS 2% FCS. Incubar las células durante 20 minutos sobre hielo y en la oscuridad. Añadir tres mililitros de HBSS 2% FCS a los tubos y centrifugardelos de nuevo a 370 veces g durante tres minutos a 20 grados Centígrados. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 250 microlitros de perlas acopladas con estreptavidina diluidas una de cada cinco en HBSS 2% FCS. Incubar la mezcla de células y cuentas durante 20 minutos sobre hielo. A continuación, agregue tres mililitros de HBSS 2% FCS al tubo, pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar, y centrifugar de nuevo a 370 veces g durante tres minutos a 20 grados Centígrados. Resuspenda el pellet en dos mililitros de HBSS 2% FCS.

Coloque la columna en el imán y agregue tres mililitros de HBSS 2% FCS para humidificar el sistema. A continuación, pipetee las celdas manchadas en la columna. Después de que la suspensión celular pase a través de la columna, lave la columna tres veces con tres mililitros de HBSS 2% FCS. A continuación, retire la columna del imán y colóquela en un tubo de 15 mililitros. Para eluir las celdas de destino, agregue cinco mililitros de HBSS 2% FCS a la columna y enjuague la columna con un émbolo. Repita este paso con otros cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Para evaluar la eficacia del aislamiento celular objetivo, primero transfiera 500 microlitros de suspensión celular eluida a un tubo FACS y etiquete las células T enriquecidas. A continuación, centrifugar los tubos enriquecidos y no enriquecidos a 370 veces g durante siete minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante y, a continuación, añada 100 microlitros de anticuerpos fluorescentes diluidos uno en 200 en HBSS 2% FCS a ambos tubos. Incubar las células durante 20 minutos sobre hielo y en la oscuridad. A continuación, añadir tres mililitros de HBSS 2% FCS a los tubos y centrifugarlos a 370 veces g durante tres minutos a 20 grados Centígrados. Deseche el sobrenadante y luego resuspenda los pellets en 250 microlitros de HBSS 2% FCS. Ahora, evalúe la velocidad de enriquecimiento de células CD3-positiva usando la citometría de flujo como se muestra en el protocolo FACS.

Ahora, determinaremos la frecuencia de los linfocitos CON positivo CD3 entre todos los timocitos que estaban aislados del timo del ratón. Para empezar, haga doble clic en el icono FlowJo y arrastre los archivos para cada tubo en la ventana de muestra. A continuación, haga doble clic en el archivo de celdas T enriquecidos para mostrar las celdas registradas a partir de esa muestra en una gráfica de puntos que muestra la dispersión hacia delante, FSCA, en el eje X, y dispersión lateral, SSCA, en el eje Y.

Haga clic en polígono para rodear las poblaciones de linfocitos. A continuación, haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana. Seleccione FSC-W en el eje Y y FSC-A en el eje X y circule las celdas negativas FSA-W. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a la población de celdas Células únicas. A continuación, haga clic en Aceptar en la ventana de identificación de subpoblación, luego haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana. Seleccione CD3 en el eje Y y circule las celdas con positivo CD3. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células T de la población celular. Repita con el archivo de celdas T no enriquecidos. Para visualizar el rellenado de celdas, haga clic en Editor de diseño y arrastre la población de celdas T de celdas T enriquecidas y archivos de celdas T no enriquecidos a la pestaña.

Aparecerán gráficas de puntos que representan linfocitos CON positivo CD3. Las células CD3 positivas sólo deben aparecer en la población de interés en el tubo enriquecido cd3 positivo. Para evaluar el enriquecimiento de linfocitos con positivo CD3 en las células ordenadas, haga clic en Editor de tablas y, a continuación, arrastre la población de células T de células T enriquecidas y archivos de células T no enriquecidas a la tabla. En el menú de estadísticas, seleccione Frecuencia de células de linfocitos para comprobar el porcentaje de células con indicadores CD3 en todos los linfocitos. A continuación, haga clic en Crear tabla. Los valores de parámetro aparecerán en una nueva tabla. Para las células T enriquecidas, la frecuencia de las células CON m2 con positivo CD3 debe estar alrededor del 80% o superior.

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter